2株產低溫蛋白酶耐冷菌株的篩選及酶學性質

徐曉梅 薛雙紅 袁俊超 鄭連爽 熊燕飛++張建坤+蘇寶連+謝浩

摘要：采用低溫液體富集、酪蛋白篩選平板、溫度復篩等方法從黑龍江省大慶油田土壤這一非極端自然環境中篩選分離獲得2株產低溫蛋白酶的耐冷細菌LS3和LS4，通過菌落形態和顯微觀察，結合16S rDNA全序列分析確定前者為假單胞菌屬（Pseudomonas），后者為微小桿菌屬（Exiguobacterium）。LS3和LS4菌株在低溫（10 ℃）下均能較好地生長及產酶，最適酶活溫度分別為40、30 ℃，最適作用pH值均為8，對熱敏感，低溫仍能維持較好的酶活，屬于低溫堿性蛋白酶。其中，LS3菌株在含尿素培養基中產酶活性較高（52.46 U/mL），LS4菌株產的蛋白酶對鹽有一定耐受性。本研究結果豐富了對低溫蛋白酶的研究開發，為其在食品工業、農業復合菌劑等領域的應用提供了基礎。

關鍵詞：耐冷菌株；低溫蛋白酶；酶學性質

中圖分類號：S182；Q814.1文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）10-0209-04

微生物的生命活動和溫度密切相關，可分為高溫、中溫和低溫微生物三大類。Morita將低溫微生物分為嗜冷菌（psychophile）和耐冷菌（psychrotroph），前者最低可低于0生長，最高生長溫度約20 ℃，最適生長溫度不超過15 ℃；后者最適溫度可高于15 ℃，最高生長溫度大于20 ℃，在0～5 ℃可生長繁殖[1]，該定義已被廣泛接受。James等在《Modern Food Microbiology》一書中提出，耐冷菌又有狹義（stenopsychrotroph，40 ℃不生長）和廣義（eurypsychrotroph，可高于40 ℃生長）之分[2-3]。這些低溫微生物是低溫酶（cold-active enzyme or psychrophilic enzyme）來源的重要資源庫。蛋白酶是目前應用最多的一種酶，占世界酶市場的60%以上[4]。低溫蛋白酶最適作用溫度一般比同功能的中溫蛋白酶（50 ℃）低20～30 ℃，在低溫（0～20 ℃）和中溫環境下均具有較高催化活性，且對熱不穩定，因而有著中溫蛋白酶無法取代的優越性[5]，已被廣泛應用于分子生物技術、環境生物修復、食品工業、醫藥行業等各大領域[6]。已報道的產低溫蛋白酶的微生物大多分離自兩極、深海、冰川、凍土等常冷環境[7-10]。本研究對大慶油田土壤樣品中微生物進行分離篩選，得到2株產低溫堿性蛋白酶的耐冷菌，即狹義耐冷菌LS3和廣義耐冷菌LS4，經鑒定分別屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）和微小桿菌（Exiguobacterium sp.），并進一步對粗酶液進行酶學性質研究，為低溫蛋白酶的廣泛應用提供基礎。

1材料與方法

1.1菌株來源及培養基

1.1.1菌株來源

土壤樣品來自黑龍江省大慶油田，為無結核硅質黏土，顏色較黑，質地較硬。

1.1.2培養基

（1）LB富集培養基。蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，調pH值至7.0～7.2。固體培養基另加15～20 g/L瓊脂粉。（2）初篩培養基。酪蛋白 10 g/L，蛋白胨0.5 g/L，酵母提取物0.3 g/L，瓊脂粉1.5%～2.0%，調pH值至7.0～8.0。（3）搖瓶發酵培養基。酪蛋白10 g/L，蛋白胨0.5 g/L，酵母提取物0.3 g/L，調pH值至 7.0～8.0。

1.2產低溫蛋白酶耐冷菌株的篩選及鑒定

1.2.1耐冷菌富集5 g土壤樣品加入45 mL無菌水，充分攪拌后靜置30 min浸出，取土壤浸出液于LB培養基中，于 10 ℃、130 r/min富集培養并如此轉接富集3～4次，以上所有過程均在無菌條件下完成。

1.2.2產低溫蛋白酶耐冷菌株初篩將富集菌液按梯度稀釋法取合適稀釋度移入初篩平板中，涂布均勻，10 ℃倒置培養，挑選透明圈較大、菌落直徑較大的菌株繼續涂布或劃線直至菌落形狀完全一致。

1.2.3產低溫蛋白酶耐冷菌株溫度復篩以43 ℃為生長上限溫度，該溫度下即不生長的菌株為耐冷菌，如前所述40 ℃用于區分狹義和廣義耐冷菌[2-3]。將初篩得到的產蛋白酶菌株在初篩平板上點樣，分別置于4、20、37、43 ℃上培養，4 ℃生長、43 ℃下不生長的菌株為試驗菌株，液體培養后加滅菌甘油于-70 ℃下保存。

1.2.4蛋白酶活力測定按照QB/T 1803—1993《工業酶制劑通用試驗方法》的紫外分光光度法測定粗酶液酶活力。20 g/L 酪蛋白底物用pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液配制，相應溫度下反應30 min后加0.4 mol/L三氯乙酸終止反應，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，275 nm處測定吸光度D值。酶活力定義為：在上述條件下，1 mL酶液催化酪蛋白水解形成1 μg酪氨酸的酶量為1個單位（U/mL）。

1.2.516S rDNA全序列測序細菌克隆測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。通用引物為：7F，5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；1540R，5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。

1.3菌株生長產酶特性

1.3.1溫度對產酶耐冷菌生長的影響將產酶菌株的液體培養液按2%的接種量接入10 mL LB富集培養基中，分別置于4、10、20、25、30、37、40、43 ℃下130 r/min下振蕩培養，每隔 2 h 測其D600 nm值。

1.3.2pH值對產酶耐冷菌生長的影響同“1.3.1”節接種，于30 ℃、130 r/min下振蕩培養，調節培養基pH值分別為5、6、7、8、9，每隔2 h測其D600 nm值。

1.3.3鹽度對產酶耐冷菌生長的影響同“1.3.2”節接種培養，調節培養基NaCl濃度分別為0、5、10、20、30、40、50、60、70 g/L，每隔2 h測其D600 nm值。

1.3.4培養時間對菌株生長及產酶影響將產酶菌株的液體培養液按2%的接種量接入50 mL發酵培養基中，于 10 ℃、130 r/min下振蕩培養，每24 h測其D600 nm 值及上清液酶活力。

1.3.5不同碳源、氮源對耐冷菌生長及產酶影響

1.3.5.1碳源試驗以酪蛋白為氮源，在培養基中分別加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉和酵母膏為碳源，使終濃度為10 g/L，培養96 h后測酶活力。

1.3.5.2氮源試驗以酵母膏為碳源，在培養基中分別加入胰蛋白胨、尿素、氯化銨、硫酸銨、硝酸鈉、硝酸銨和酪蛋白為氮源，使終濃度為5 g/L，培養96 h后測上清液酶活力。

1.4粗酶液部分酶學性質研究

1.4.1酶的最適溫度將酶活力測定中的反應溫度分別控制在10、20、30、40、50、60 ℃，其他條件不變，分別測定酶活力。

1.4.2酶的最適pH值在最適反應溫度下，將酶活力測定中的反應pH值分別控制在7、8、9、10、11，其他條件不變，分別測定酶活力。

1.4.3酶的熱穩定性將粗酶液分別在30、40、50、60 ℃ 等4個溫度下保溫10、20、30、40 min，再放入冰水混合物中冷卻，測定蛋白酶活力，以未做保溫處理的酶活力為對照。

1.4.4酶的耐鹽性在酶的最佳反應溫度和pH值條件下，于酶反應體系中分別加入0、10、20、30、40、50 g/L NaCl，以未加NaCl的酶活力為100%，分別測定酶活力。

1.4.5部分金屬離子及抑制劑對酶活力的影響在酶的最佳反應溫度和pH值條件下，于酶反應體系中加入不同金屬離子及抑制劑，以未加金屬離子或抑制劑的酶活力為100%，測定加入化學劑后的酶活力。

2結果與分析

2.1產低溫蛋白酶耐冷菌株的篩選和鑒定

經過低溫富集、平板初篩、溫度復篩及酶活力檢測，從土壤樣品中篩選得產蛋白酶活力較高的耐冷菌LS3和LS4。LS3菌株呈細長桿狀，長約2 μm，寬約0.5 μm；LS4菌株呈粗短桿狀，長不到1 μm，寬約0.8 μm（圖1）。在酪蛋白平板上，兩菌均呈圓形，不透明，表面光滑、邊緣整齊、易挑取，產生明顯透明圈，其中LS3為乳白色，LS4呈土黃色。經16S rDNA [CM（23*5]全序列測序鑒定，乳白色LS3菌株為假單胞菌屬，土黃

色LS4菌株為微小桿菌屬。

2.2菌株生長產酶特性

2.2.1溫度、pH值及鹽濃度對菌株生長的影響2株菌株在不同溫度、pH值及鹽濃度培養條件下的生長情況不同。LS3和LS4在低溫（4、10 ℃）下生長狀態較好，LS3在33 ℃不生長，符合狹義耐冷菌的定義，而LS4在43 ℃下不生長，為廣義耐冷菌。2株菌株對pH值均有一定耐受性，LS3在pH值為6～8之間生長良好，LS4在pH值為5～8之間生長良好，pH值達到9時對2株菌株生長稍有不利。LS3在0～20 g/L鹽濃度范圍內生長狀態良好，在鹽濃度超過30 g/L以后隨著鹽度升高，菌株生長逐漸受到抑制，當鹽濃度為50 g/L時即不生長，在60 g/L以上時D值呈下降趨勢，因為在該條件下，耐冷菌受到高滲脅迫，胞內失水，細胞凋亡。LS4菌株的耐鹽性與LS3相似，但其在不含鹽條件下生長也會受到抑制，在鹽濃度為50 g/L時也能生長，只是在高鹽環境下生長受阻而十分緩慢。

2.2.2培養時間對菌株生長及產酶的影響2株菌株在 10 ℃ 下生長和產蛋白酶曲線（酶反應溫度為10 ℃）結果見圖2。由圖2可知，2株菌株在60 h前處于對數生長期，后進入一段較長時間的穩定期，且酶活力在達到穩定期之前呈直線上升趨勢，之后也漸趨于穩定。培養液中蛋白酶量與菌體生物量呈正相關關系，當菌體生長進入對數生長后期時，菌株開始大量合成蛋白酶并分泌至胞外，隨后酶繼續產生，培養液中酶活力迅速升高；當菌體生長達穩定期后，培養液中酶活力保持基本恒定，并能維持較長時間。

2.2.3不同碳源和氮源對耐冷菌生長及產酶的影響利用不同碳源和氮源對LS3與LS4等2株耐冷菌進行發酵培養，其生長及產酶情況分別見表1、表2。由表1可知，2株菌株均不能在含葡萄糖的液體培養基中生長；對麥芽糖和可溶性淀粉利用率很低，酶活力極低或沒有酶活力；能較好地利用蔗糖，且有較高酶活力；在含酵母膏的液體培養基中生長最旺盛，但就酶活力而言，LS3菌株利用酵母膏的產酶情況不及蔗糖，LS4菌株利用酵母膏和蔗糖的產酶情況相當。由表2可知，在所試7種氮源中，LS4菌株雖能利用不同氮源生長，但僅在酪蛋白的存在下才產生蛋白酶，可認為其分泌的蛋白酶是誘導酶而非組成酶。LS3菌株與LS4菌株相似，但除了酪蛋白，其還能更好地利用尿素分泌蛋白酶，酶活力達到 52.46 U/mL。

2.3粗酶液部分的酶學性質

2.3.1酶的最適溫度設置不同的溫度梯度，對菌株酶活力進行檢測。圖3顯示，狹義耐冷菌LS3產蛋白酶的最適作用溫度約在40 ℃，50 ℃仍維持95%左右的酶活力，而在60 ℃降到50%左右，且在10、20 ℃維持較高酶活力，分別為40%、55%左右。廣義耐冷菌LS4產蛋白酶的最適作用溫度較LS3的低，在30 ℃左右，在10、20 ℃下分別維持45%、60%左右的較高酶活力，60 ℃高溫下僅存最高酶活力的25%左右。根據Margesin等的定義，通常把最適作用溫度在35 ℃左右的低溫下仍具一定催化效率的酶稱為低溫酶[11]。已報道的由耐冷菌分泌的蛋白酶最適作用溫度一般處在25～50 ℃范圍[12]。已知耐冷菌產蛋白酶的最適作用溫度最低的為19℃[13]，也有更高的最適溫度（55～60 ℃）[14-16]，可視為中溫酶。由此表明，耐冷菌所產酶不一定都是低溫酶，要鑒定是否為產低溫蛋白酶的菌株，也須要比較所產蛋白酶在不同溫度下的酶活力以及酶的熱穩定性。

2.3.2酶的最適pH值設置不同的pH值梯度，對菌株酶活力進行檢測，結果見圖4。2株菌株最適作用pH值均在8左右，LS3菌株所產蛋白酶在堿性環境（pH值為8～11）下維持較高酶活力，雖呈遞減趨勢，但pH值在11時仍保持最高酶活力的60%左右。而LS4菌株所產蛋白酶活力受pH值影響較大，隨pH值升高，酶活力迅速下降，pH值為11時僅為最高酶活力的15%左右。2株菌株所產低溫蛋白酶均為堿性蛋白酶。

2.3.3酶的熱穩定性蛋白酶的耐熱性檢測試驗結果顯示，LS3和LS4等2株菌株所產生的蛋白酶對熱的穩定性不同（圖5）。30 ℃保溫處理對LS3菌株產生的蛋白酶影響不大，該溫度下保溫40 min后仍持有65%左右的活性；40 ℃處理30 min，50 ℃保溫10 min后仍保持60%左右，但50 ℃處理 20 min 則幾乎喪失100%的酶活力。相對LS3而言，LS4菌株產生的蛋白酶對熱更不穩定，其在30 ℃保溫30 min之后即喪失45%左右的活力，40 min后僅剩30%左右；40 ℃保溫 10 min 之后則只剩50%左右的酶活力，40 ℃處理30 min，50 ℃ 處理10 min即喪失所有酶活力。LS3和LS4等2株菌株產生的蛋白酶對熱的穩定性不同，應該與酶的最適作用溫度有關，前者為40 ℃左右，后者約為30 ℃，所以LS4菌株產生的蛋白酶熱穩定性更差?？偠灾?，2株菌株所產生的蛋白酶均對熱不穩定，在較高溫度（>50 ℃）下可快速失活，這是低溫酶的一個重要特性。

2.3.4酶的耐鹽性由圖6可知，鹽濃度對蛋白酶活力影響較為明顯，尤其是對LS3菌株產生的蛋白酶而言，鹽濃度為10 g/L時即可抑制50%左右的酶活力，鹽濃度為30 g/L時幾乎喪失100%的酶活力。LS4菌株產生的蛋白酶對鹽有一定耐受能力，鹽濃度為10 g/L時仍保持70%左右的酶活力，鹽濃度為40 g/L時保持15%左右的酶活力。

2.3.5部分金屬離子及抑制劑對酶活力的影響金屬離子對酶活力的影響與酶的特殊結構有關，研究金屬離子對酶活力的影響在今后的理論及應用研究中都具有重要的意義。由表3可知，受試金屬離子對LS3菌株產蛋白酶的活力均有一定程度的抑制作用，Mg2+、K+、Ba2+濃度的抑制作用沒有Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+濃度的抑制作用明顯，而Mg2+、K+濃度對LS4菌株產生的蛋白酶無明顯影響，Cu2+、Zn2+濃度則會[CM（25]使蛋白酶完全失活。吐溫80對2個蛋白酶均有明顯的激

活效果，其中機理尚不清楚。已有研究表明，吐溫80可在蛋白藥物中用作穩定劑，起保護作用，防止蛋白質分子之間發生反應或吸附聚集[17]。變性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）對2株菌株的蛋白酶均有強烈的抑制作用，使蛋白酶的氫鍵、疏水鍵打開并插入其疏水內部，形成蛋白酶-SDS復合物，從而使酶失活。研究表明，二甲基亞砜（DMSO）存在一定的毒性作用，與蛋白質疏水基團發生作用，能導致蛋白質變性。然而試驗顯示，DMSO對蛋白酶無抑制作用且對LS4菌株產生的蛋白酶有激活作用（136%），其中機理有待進一步探究。β-巰基乙醇對2株菌株產蛋白酶均有明顯的抑制作用，其通過將蛋白酶中二硫鍵還原為—SH基團而使之失活。金屬蛋白酶抑制劑乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）對LS4產的蛋白酶有強烈的抑制作用，對LS3產的蛋白酶無影響，說明LS4產的蛋白酶屬于金屬蛋白酶。

3結論

本試驗從大慶油田土壤這一非極端自然環境中分離獲得2株產低溫堿性蛋白酶的耐冷菌株LS3、LS4，豐富了產低溫堿性蛋白酶耐冷菌的資源庫。菌株對pH值（5～9）及鹽濃度（0～4%）均有一定耐受性。LS3菌株為狹義耐冷菌，經鑒定為假單胞菌屬，LS4菌株為廣義耐冷菌，經鑒定為微小桿菌屬。2株菌株在低溫下能夠良好生長并產酶，在尿素存在下，LS3產酶活力達到52.46 U/mL，為投入實際應用提供了有力依據，是良好的出發菌種。LS3和LS4菌株所產酶的最適作用溫度分別為40、30 ℃左右，最適作用pH值為8左右，低溫堿性環境中蛋白酶均維持較高活性，而熱穩定性差，在較高溫度（>50 ℃）下快速失活，為蛋白酶的應用提供基本條件。金屬離子對LS3菌株產蛋白酶的活力均有一定程度的抑制作用，Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+濃度的抑制作用較為明顯，表明此蛋白酶的作用不需要金屬離子的參與，EDTA對其無影響也可證實這一點。Cu2+、Zn2+濃度可使LS4菌株產的蛋白酶完全失活，其對EDTA敏感，說明屬于金屬蛋白酶。而吐溫80作為穩定劑，對2個蛋白酶均有激活效果。該研究對蛋白酶的實際應用具有指導性意義。

參考文獻：

[1]Morita R Y. Psychrophilic bacteria[J]. Bacteriological Reviews，1975，39（2）：144-167.

[2]James M J，Martin J L，David A G. Modern food microbiology[M]. Berlin：Springer，2004：395-413.

[3]Mossel D A，Zwart H. The rapid tentative recognition of psychrotrophic types among Enterobacteriaceae isolated from foods[J]. Journal of Applied Bacteriology，1960，23（2）：185-188.

[4]Baghel V S，Tripathi R D，Ramteke P W，et al. Psychrotrophic proteolytic bacteria from cold environment of Gangotri glacier，Western Himalaya，India[J]. Enzyme and Microbial Technology，2005，36（5/6）：654-659.

[5]Dastager S G，Dayanand A，Li W J，et al. Proteolytic activity from an alkali-thermotolerant Streptomyces gulbargensis sp. nov[J]. Current Microbiology，2008，57（6）：638-642.

[6]Fornbacke M，Clarsund M. Cold-adapted proteases as an emerging class of therapeutics[J]. Infectious Diseases and Therapy，2013，2（1）：15-26.

[7]Kuddus M，Ramteke P W. Cold-active extracellular alkaline protease from an alkaliphilic Stenotrophomonas maltophilia：production of enzyme and its industrial applications[J]. Canadian Journal of Microbiology，2009，55（11）：1294-1301.

[8]Wang Q F，Hou Y H，Xu Z，et al. Purification and properties of an extracellular cold-active protease from the psychrophilic bacterium Pseudoalteromonas sp. NJ276[J]. Biochemical Engineering Journal，2008，38（3）：362-368.

[9]Acevedo J P，Rodriguez V，Saavedra M，et al. Cloning，expression and decoding of the cold adaptation of a new widely represented thermolabile subtilisin-like protease[J]. Journal of Applied Microbiology，2013，114（2）：352-363.

[10]陳吉剛，李文晨，羅楠，等. 產蛋白酶北極海洋耐冷菌ArcB82306的篩選及其蛋白酶性質[J]. 應用與環境生物學報，2010，16（6）：858-862.

[11]Margesin R，Palma N，Knauseder F. Protease of psychrotrophic bacteria isolated from glaciers[J]. Journal of Basic Microbiology，1991，31（5）：377-383.

[12]Kasana R C. Proteases from psychrotrophs：an overview[J]. Critical Reviews in Microbiology，2010，36（2）：134-145.

[13]Huston A L，Methe B，Deming J W. Purification，characterization，and sequencing of an extracellular cold-active aminopeptidase produced by marine psychrophile Colwellia psychrerythraea strain 34H[J]. Applied and Environmental Microbiology，2004，70（6）：3321-3328.

[14]Kim J I，Lee S M，Jung H J. Characterization of calcium-activated bifunctional peptidase of the psychrotrophic Bacillus cereus[J]. Journal of Microbiology，2005，43（3）：237-243.

[15]Vazquez S，Ruberto L，Cormack W M. Properties of extracellular proteases from three psychrotolerant Stenotrophomonas maltophilia [JP3]isolated from Antarctic soil[J]. Polar Biology，2005，28（4）：319-325.

[16]曾胤新，陳波. 極區低溫海洋細菌及其產酶情況的初步研究[J]. 生物技術，2002，12（1）：10-12.

[17]Deechongkit S，Wen J，Narhi L O，et al. Physical and biophysical effects of polysorbate 20 and 80 on darbepoetin alfa[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences，2009，98（9）：3200-3217.