黃芪多糖對糖尿病大鼠視網膜病變的保護作用

劉俊輝,李春江,李玉濤,2*(.河北省唐山市冀東眼科醫院眼科，河北 唐山 063000;2.華北理工大學附屬醫院眼科，河北 唐山 063000)

·論 著·

黃芪多糖對糖尿病大鼠視網膜病變的保護作用

劉俊輝1,李春江1,李玉濤1,2*
(1.河北省唐山市冀東眼科醫院眼科，河北 唐山 063000;2.華北理工大學附屬醫院眼科，河北 唐山 063000)

目的觀察黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)對糖尿病大鼠視網膜病變的治療作用并探討相關機制。方法將清潔級健康雄性SD大鼠45只隨機分為正常對照組、糖尿病模型組和APS組各15只。使用鏈脲佐菌素腹腔注射制作糖尿病大鼠模型。造模后1周，APS組大鼠給予400 mg/kg APS灌胃，1次/d，連續治療8周。治療結束后，測量各組大鼠的血糖、體質量，ELISA法檢測大鼠視網膜中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1 ICAM-1)的含量，免疫印跡方法檢測大鼠視網膜血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和p-Akt蛋白表達。結果模型組和APS組血糖高于對照組，體質量低于對照組(P<0.05)。模型組和APS組大鼠TNF-α、ICAM-1、VEGF和p-Akt表達明顯高于對照組，APS組TNF-α、ICAM-1、VEGF和p-Akt表達低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論APS可降低糖尿病大鼠視網膜中TNF-α、ICAM-1、VEGF和Akt的水平，通過抗炎、減少白細胞在糖尿病病變的視網膜黏附、影響Akt-VEGF信號通路起到對視網膜的保護作用。

糖尿病視網膜病變；黃芪多糖；大鼠

糖尿病是一種以高血糖為特征的慢性、進行性代謝疾病，發病率呈逐年增加的趨勢。糖尿病患者的糖、脂類、蛋白質代謝混亂，引起多種并發癥，嚴重影響患者生活質量[1]。糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病眼部的主要并發癥，為糖尿病患者常見的微血管病變之一[2]，隨著生活水平的提高和生活方式改變，發病率呈逐年上升的趨勢[3]，且出現眼部并發癥的病程逐漸縮短。病程>20年的糖尿病患者75%以上都伴隨著不同程度的DR。DR導致患者的視力急劇下降，并可能導致失明，給患者帶來極大痛苦，亦有患者出現抑郁[4]，不利于患者的治療，同時給家庭和社會帶來巨大的經濟壓力。有研究表明，早期DR表現為血管的神經炎癥、細胞凋亡、血-視網膜屏障的破壞[5]。因此，早期進行糖尿病患者的抗炎治療可能是預防DR的一種非常有效的方法。黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用，但是APS對于DR抗炎作用的相關機制尚不十分清楚。本研究旨在探討APS對于糖尿病大鼠DR抗炎方面的作用及相關機制，從而為臨床治療DR提供重要的理論依據。報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物模型及分組 清潔級健康雄性SD大鼠45只，體質量200～240 g，由天津市實驗動物中心提供。所有SD大鼠隨機分為正常對照組(15只)、糖尿病模型組(15只)和APS組(15只)，所有大鼠進行適應性喂養7 d。模型組和APS組大鼠接受鏈脲佐菌素左下腹腹腔注射建立糖尿病模型(鏈脲佐菌素溶于生理鹽水中，按60 mg/kg進行注射)，對照組注射等量的生理鹽水。鏈脲佐菌素注射72 h后尾靜脈測量血糖(血糖儀測定)，若血糖>16.7 mmol/L視為糖尿病模型制作成功。造模后1周，APS組大鼠給予400 mg/kgAPS灌胃，1次/d，連續治療8周。對照組和糖尿病組大鼠每日給予等量生理鹽水灌胃。

1.2 試劑 APS購自上海士峰生物科技有限公司。鏈脲佐菌素購自美國sigma公司。細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)ELISA試劑盒購自Abcam公司。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、p-Akt、actin抗體及其他試劑均購自于北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 APS治療結束后每只大鼠稱體質量，尾靜脈取血，血糖儀測量空腹血糖。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)進行腹腔麻醉，去雙側眼球，顯微鏡下分離視網膜，-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.1 ELISA法檢測大鼠視網膜TNF-α和ICAM-1含量 視網膜加入組織裂解液，超聲粉碎后離心，取上清液蛋白定量，按ELISA試劑盒說明書檢測視網膜組織中TNF-α和ICAM-1的含量。

1.3.2 免疫印跡法檢測大鼠視網膜VEGF和p-Akt表達 視網膜超聲粉碎離心，測量蛋白濃度，SDS-PAGE進行蛋白電泳，后轉移至PVDF膜上，BSA封閉后加入相應抗體4 ℃過夜，漂洗后加入二抗孵育，顯影，采集圖像。目的蛋白和actin比值為相對蛋白表達。

1.4 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件分析數據。計量資料比較分別采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血糖與體質量情況 模型組和APS組血糖高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組與APS組血糖差異無統計學意義(P>0.05)。模型組和APS組體質量低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組與APS組體質量差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

組別血糖(mmol/L)體質量(g)對照組6.15±0.57389.56±20.08模型組22.37±4.31*247.53±18.36*APS組21.56±2.03*238.77±17.54*F83.940195.595P0.0000.000

*P<0.05與對照組比較(LSD-t檢驗)

2.2 ELISA法檢測各組大鼠視網膜TNF-α和ICAM-1的表達 模型組和APS組大鼠TNF-α和ICAM-1表達明顯高于對照組， APS組TNF-α和ICAM-1表達低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

組別ICAM-1(μg/g)TNF-α(ng/L)對照組3.69±0.5713.52±2.61模型組7.67±0.48*19.73±4.48*APS組4.99±0.37*#15.62±2.25*#F133.67390.862P0.0000.000

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與模型組比較(LSD-t檢驗)

2.3 免疫印跡法檢測各組大鼠視網膜VEGF和p-Akt表達 模型組和APS組大鼠VEGF和p-Akt表達明顯高于對照組，APS組VEGF和p-Akt表達低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 免疫印跡法檢測大鼠視網膜VEGF和p-Akt表達

Figure 1 Expression of VEGF and p-Akt detected by western blot

組別VEGFp-Akt對照組0.28±0.040.23±0.07模型組0.83±0.09*0.94±0.21*APS組0.49±0.08*#0.45±0.09*#F97.637126.255P0.0000.000

*P<0.05與對照組比較 #P<0.05與模型組比較(LSD-t檢驗)

3 討 論

DR是糖尿病常見的一種微血管并發癥，同時也是全世界人群失明的一個主要原因[6]。DR對自尊心造成極大的影響并且給社會和家庭造成嚴重的負擔。目前DR的主要治療方法是疾病早期行激光光凝術以及疾病晚期使用玻璃體手術，該方法對患者的視力造成損害并且會帶來不適的感覺。因此，對DR有效治療藥物的研究就顯得至關重要。

DR的發病機制非常復雜，包括了血管、炎癥、神經等方面的機制[7]。近年來越來越多的研究證實DR是一種與炎癥密切相關的疾病，炎癥過程導致DR結構和功能的改變[8]。炎癥過程促進了DR的病理結構改變，包括血-視網膜屏障的破壞、視網膜新生血管的形成、視網膜谷氨酸代謝障礙、視網膜神經元凋亡等[9]。糖尿病患者的高血糖狀態導致了視網膜組織中白細胞的增多，從而引發了炎癥因子的過度表達。所以，控制DR的炎癥反應是治療DR的重要策略之一。

APS是中藥黃芪三大藥效成分中含量最多且活性最強的一種多糖類物質。大量研究表明，APS具有抗氧化應激、抗腫瘤、抗炎癥反應、免疫調節、抗病毒、預防衰老等作用[10]。陳紅霞等[11]將APS應用于糖尿病大鼠，APS發揮抗氧化、抗炎等功效，從而達到保護心肌的作用。有研究發現，APS對CLP誘導的膿毒癥小鼠急性肝損傷具有保護作用，APS有效減少了MDA、ICAM-1的表達并提高了caspase-3的表達，通過抗氧化應激、抗炎和抗凋亡機制起到保護肝臟的作用[12]。同時也有APS改善認知功能障礙的相關研究。費洪新等[13]應用APS治療AD模型小鼠，APS降低了AD模型小鼠血腦屏障破壞程度，改善了AD模型小鼠的認知功能并保護了海馬神經元形態結構，通過抑制Aβ沉積、降低白細胞介素6蛋白水平(發揮抗炎作用)而在AD治療中發揮作用。另有研究發現，APS對腦外傷大鼠的學習記憶能力也有作用，APS能夠提高SOD的活性，清除氧自由基，通過抗機體氧化應激提高腦外傷大鼠學習記憶能力[14]。

高血糖導致糖尿病視網膜的氧化應激，并且與細胞炎癥和炎性細胞因子的釋放密切相關[15]。炎性細胞因子在DR的新生血管形成過程中起到了重要作用，在DR的發展過程中，視網膜炎癥和白細胞黏附微血管(白細胞淤滯)促進血-視網膜屏障的破壞[16]。TNF-α是由巨噬細胞或單核細胞活化后產生的一種多功能的炎癥因子，與血視網膜屏障的破壞和血管細胞死亡呈正相關，被認為是炎癥反應的觸發器[17]。ICAM-1在DR患者中升高，ICAM-1表達的增多促進白細胞在糖尿病視網膜的黏附。白細胞黏附是糖尿病視網膜炎癥早期的變化之一，導致內皮細胞的減少和血-視網膜屏障破壞[16]。若ICAM異常表達，可能引起內皮細胞的損傷，也能夠造成白細胞釋放更多細胞因子或炎性介質。由于TNF-α和ICAM-1在DR 病理生理方面的重要性，本研究探討了APS對于糖尿病大鼠視網膜內TNF-α和ICAM-1表達的影響，結果顯示APS能夠抑制DR大鼠視網膜中TNF-α和ICAM-1的表達。因此，推斷抑制炎癥反應可能是APS治療DR的分子機制之一。

慢性高血糖刺激VEGF的合成和分泌，VEGF由低氧誘導因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α) 轉錄調控，是調節視網膜血管滲漏和新血管形成主要的一種生長因子[18]。VEGF是一種血管內皮生成和血管滲透性因子，被認為是導致DR以及其他視網膜疾病視網膜滲透性和血-視網膜屏障完整性的關鍵分子[19]。VEGF表達的調節過程是十分復雜的，HIF-1α是調節高血糖狀態下VEGF表達的一種轉錄因子[18]。此外，Akt的激活是HIF-1α表達的上游調節因子，故Akt-VEGF信號通路的啟動可影響視網膜新生血管形成的發生[20]。本研究結果顯示，糖尿病大鼠的視網膜內VEGF和p-Akt表達增多，APS治療后VEGF和p-Akt表達減少。因此，推斷APS通過抑制Akt的激活降低VEGF的表達，從而改善糖尿病視網膜的血管病變。

綜上所述，APS可降低糖尿病大鼠視網膜中TNF-α、ICAM-1的表達，通過抗炎、減少白細胞在糖尿病病變的視網膜黏附起到對視網膜的保護作用。同時APS也影響了Akt-VEGF信號通路，從而減少了糖尿病大鼠視網膜中VEGF和p-Akt兩者的表達，可能通過此機制影響視網膜新生血管的形成。APS具有抗氧化應激、抗腫瘤、抗炎癥反應、免疫調節、抗病毒、改善認知功能等作用，今后將繼續深層次探討APS的藥理作用，尤其是在眼科疾病中的基礎和臨床研究，從而為糖尿病視網膜病變乃至其他眼部疾病的患者的治療提供理論依據。

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(本文編輯：趙麗潔)

The protective effects of Astragalus polysaccharide on diabetic rats with retinopathy

LIU Jun-hui1, LI Chun-jiang1, LI Yu-tao1,2*
(1.DepartmentofOphthalmology,JidongOphthalmologyHospital,TangshanCity，HebeiProvince，Tangshan063000,China; 2.DepartmentofOphthalmology,NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedHospital，Tangshan063000,China)

Objective To study the therapeutic effects of Astragalus polysaccharide(APS) on diabetic rats with retinopathy, and to explore its mechanism. Methods Forty-five cleaning degree healthy male SD rats were randomly divided into 3 groups, normal control group, diabetic model group and APS group(n=15/group). The diabetic rats were made by streptozotocin intraperitoneal injection. One week after modeling, rats in APS group was administrated orally with APS(400 mg/kg) once daily for consecutive 8 weeks. After treatment, the blood glucose and body weight of different groups were measured. The expression of tumor necrosis factor alpha(TNF-α) and intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1) in retina of different groups were detected by ELISA. The relative expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and p-Akt in retina of different groups were tested by western blot. Results The blood glucose of model group and APS group was higher than control group, body weight of model group and APS group was lower than control group(P<0.05). The expression of TNF-α, ICAM-1, VEGF and p-Akt in model group and APS group was higher than that of control group. The expression of TNF-α, ICAM-1, VEGF and p-Akt in APS group was lower than that of model group(P<0.05). Conclusion APS could decrease the expression of TNF-α, ICAM-1, VEGF and p-Akt in retina of diabetic rats. Its protective effect on the retina may be through anti-inflammatory effect, reducing Leukocyte adhere to diabetic retina and affecting Akt- VEGF signaling pathways.

diabetic retinopathy； astragalan； rats

2017-03-02；

2017-03-22

劉俊輝(1978-)，女，河北唐山人，河北省唐山市冀東眼科醫院主治醫師，醫學學士，從事眼科疾病診治研究。

R587.26

A

1007-3205(2017)07-0797-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.07.013

*通訊作者