α-硫辛酸對帕金森病大鼠腦內黑質多巴胺能神經元保護機制研究

吳艷芬 陳文 王鳴飛 王偉

·論著·

α-硫辛酸對帕金森病大鼠腦內黑質多巴胺能神經元保護機制研究

吳艷芬 陳文 王鳴飛 王偉

目的 探討α-硫辛酸(LA)對帕金森病(PD)大鼠模型腦內黑質多巴胺能神經元的保護機制。方法 60只3月齡雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、實驗組和藥物干預組，每組20只。對照組大鼠給予背部皮下注射葵花油，實驗組和藥物干預組背部皮下注射魚藤酮制備PD模型，藥物干預組大鼠同時給予LA腹腔注射；采用Western blot檢測大鼠中腦多巴胺能神經元中酪氨酸羥化酶(TH)、轉錄因子NF-E2相關因子-抗氧化反應元件(Nrf2-ARE)和血紅素氧合酶1(HO-1)的表達變化；采用分光光度法檢測大鼠腦內紋狀體中丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量變化。結果 實驗組大鼠中腦TH蛋白表達比對照組明顯降低(P<0.05)；藥物干預組中腦TH蛋白在黑質比魚藤酮組明顯增高(P<0.05),但是較對照組仍有明顯減少(P<0.05)。實驗組大鼠Nrf2和HO-1蛋白表達比對照組明顯降低(P<0.05)；藥物干預組Nrf2和HO-1蛋白表達比實驗組明顯增高(P<0.05)，但是較對照組仍有明顯降低(P<0.05)。與對照組相比，實驗組大鼠紋狀體組織中脂質代謝產物MDA含量明顯增加(P<0.01)，藥物干預后紋狀體中MDA含量明顯減少(P<0.05)，但較對照組仍明顯增高(P<0.05)。與對照組相比，實驗組大鼠GSH的含量明顯減少(P<0.01)，藥物干預后GSH明顯增加(P<0.05)，但較對照組仍顯著降低(P<0.05)。結論 LA能激活Nrf2-ARE信號通路對PD大鼠模型中腦多巴胺能神經元起到有效的神經保護作用，改善PD樣癥狀。

帕金森病；α-硫辛酸；氧化應激；轉錄因子NF-E2相關因子-抗氧化反應元件；血紅素氧合酶1

帕金森病(parkinson’s disease,PD)是一種中老年人常見的神經退行性疾病，其主要病理改變為中腦黑質多巴胺能神經元的胞體內嗜酸性包涵體形成及其變性壞死，從而導致腦內多巴胺能神經遞質含量減少，臨床表現為靜止性震顫、運動遲緩和肌張力增高等癥狀[1]。目前PD確切的病因和發病機制尚不明確，遺傳因素、環境因素、年齡老化、氧化應激等均可能參與PD患者腦內多巴胺能神經元的變性死亡過程。PD在臨床的治療中還沒有特效藥物，多為外源性補充多巴胺能藥物延緩病情惡化，但由于長期用藥導致自身對多巴胺制劑敏感性降低、毒副作用不能耐受等原因，使患者不得不減少藥物服用劑量或終止治療[2-4]。因此，尋找能夠有效保護PD患者腦內多巴胺能神經元的藥物，提高藥物治療的安全性是當前亟待解決的科學難題。氧化應激是指體內的抗氧化能力減弱，導致體內的自由基過度蓄積，從而對機體產生一系列的負面作用，被認為是導致衰老和疾病的一個重要因素。氧化應激可在多個環節參與腦內黑質多巴胺能神經元的損傷。因此，阻止氧化損傷及其誘導的一系列級聯反應很可能成為治療PD極具前景的有效方法[5]。轉錄因子NF-E2相關因子(transcription factor NF-E2-related factor，Nrf2)通過與抗氧化反應元件(antioxident response element，ARE)結合誘導多種內源性多種抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶表達上調，是細胞氧化應激反應中的關鍵因子，具有提高機體的抗氧化和解毒能力。其中，Nrf2-ARE 信號通路誘導的內源性保護基因血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)在抗氧化損傷方面起著重要作用[6,7]。Nrf2-ARE信號通路是機體內最為重要的內源性抗氧化損傷通路之一。α-硫辛酸(LA)又名1,2-二硫戊環-3-戊酸，是1937年在馬鈴薯中發現的一種B 族維生素，由于其具有強大的抗氧化能力，被譽為“萬能抗氧劑”[8]。本研究探討LA對PD大鼠模型腦內多巴胺能神經元保護作用及其機制，為帕金森病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 12周齡雄性Witstar 大鼠60只，體重(300±20)g，由河北醫科大學實驗動物中心提供(合格證號：SCXK冀2008-1-003)。將實驗大鼠隨機分為對照組、實驗組和藥物干預組，每組20只。所有大鼠在同一實驗室按照清潔級標準飼養，期間所有大鼠自由進食進水，房間保持穩定的溫度(24℃)和濕度(40%)。

1.2 動物模型的制備及藥物干預 對照組大鼠給予背部皮下注射葵花油1 ml·kg-1·d-1，實驗組和藥物干預組大鼠按照2.0 mg·kg-1·d-1背部皮下注射魚藤酮(魚藤酮溶解在葵花籽油中充分震蕩混勻)，藥物干預組大鼠在魚藤酮注射前半小時給予LA 20 mg·kg-1·d-1腹腔注射，共30 d。

1.3 實驗動物的取材及組織勻漿制備 每組各取8只大鼠斷頭處死，在冰板上分離中腦和紋狀體液氮速凍后，-80℃保存備用。勻漿制備時，取紋狀體和中腦稱重，放入勻漿器，按1∶9(組織重量與裂解液體積比)比例加入RIPA裂解液，勻漿器放在冰浴中，超聲勻漿器以2 000 r/min勻漿20次，然后吸至1 ml離心管中。4℃放置30 min。低溫離心10 000 g，30 min。小心吸出上清分裝，-80℃儲存備用。

1.4 蛋白濃度的測定(BCA 法) 蛋白濃度的測定按照BCA蛋白測定試劑盒說明書上的步驟，取一酶標板，各孔加入 200 μl BCA 工作液，取稀釋樣品 10 μl加入各孔中，在振蕩器上將各酶版孔中的液體混勻，將酶標儀開機問題調至37℃，將酶標版放入30 min，然后562 nm下比色測定。并根據所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查到相應蛋白含量(μg)/樣品稀釋液總體積(10 μl)×樣品稀釋倍數即為樣品實際濃度(μg/μl)。

1.5 Western blot 取各組實驗大鼠腦組織勻漿樣品50 μg總蛋白常規變性后自然冷卻，經10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，電泳轉移至NC膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入抗體稀釋液稀釋的兔TH單克隆抗體(1∶5 000，Sigma)、兔Nrf2和HO-1單克隆抗體(1∶1 000，Abcom)，4℃過夜。NC膜以TTBS洗3次。羊抗兔IgG 熒光抗體(1∶2 000，Rocland 公司)室溫避光1 h，TTBS漂洗5 次，遠紅外熒光掃描成像系統掃描并測定目標蛋白光密度值，所得值與Actin (1∶5 000，Santa Cruz)蛋白的光密度值比值后，做統計學分析。

1.6 分光光度法檢測腦組織丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的含量測定 取大鼠紋狀體腦組織，在4℃RIPA裂解液勻漿， 低溫離心10 000 g 30 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。具體檢測MDA和GSH的實驗方法按所購試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 一般狀況 與對照組相比，實驗組大鼠毛色變黃變臟，體態呈弓背屈曲狀、主動活動減少、動作遲緩、行走時多向一側旋轉。實驗組大鼠在第10、13、15、19天時各死亡1只，藥物干預組大鼠腹腔注射LA后上述癥狀有明顯改善，在另第13、14天時各死亡1只。

2.2 Western blot實驗結果

2.2.1 TH在大鼠中腦黑質多巴胺能神經元中的表達改變：實驗組大鼠中腦TH蛋白表達比對照組明顯降低(P<0.05)；藥物干預組中腦TH蛋白在黑質比魚藤酮組明顯增高(P<0.05),但是較對照組仍有明顯減少(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 TH蛋白在各組大鼠中腦黑質中的表達

組別TH/ActinNrf2/ActinHO-1/Actin對照組 0.87±0.040.74±0.050.91±0.05實驗組 0.35±0.06*0.41±0.05*0.23±0.04*藥物干預組0.63±0.03*#0.55±0.05*#0.45±0.03*#

注：與對照組比較，*P<0.05;與實驗組比較,#P<0.05

2.2.2 Nrf2和HO-1在大鼠中腦黑質多巴胺能神經元中的表達改變：實驗組大鼠Nrf2和HO-1蛋白表達比對照組明顯降低(P<0.05)；藥物干預組Nrf2和HO-1蛋白表達比實驗組明顯增高(P<0.05)，但是較對照組仍有明顯降低(P<0.05)。見圖2，表1。

圖2 Nrf2和HO-1蛋白在3組大鼠中腦黑質中的表達

2.3 大鼠紋狀體中氧化應激參數的改變 與對照組相比，實驗組大鼠紋狀體組織中脂質代謝產物MDA含量明顯增加(P<0.01)，藥物干預后紋狀體中MDA含量明顯減少(P<0.05)，但較對照組仍明顯增高(P<0.05)。與對照組相比，實驗組大鼠GSH的含量明顯減少(P<0.01)，藥物干預后GSH明顯增加(P<0.05)，但較對照組仍顯著降低(P<0.05)。見表2。

組別MDA(nmol/mgprot)GSH(mg/gprot)對照組 6.21±1.5558.73±4.58實驗組 22.13±2.04*31.40±2.61*藥物干預組13.25±2.21*#42.46±2.11*#

注：與對照組比較，*P<0.05;與實驗組比較,#P<0.05

3 討論

PD的特征性病理改變是黑質內多巴胺能神經元受損，導致腦內多巴胺能神經遞質含量減少，從而臨床表現為運動障礙為主的臨床綜合征。PD發病后病情進展迅速，到疾病晚期患者的生活不能自理，完全需要家人護理和照顧，給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。隨著中國人口老齡化的到來，PD的發病率也逐年增加，目前還沒有特效藥物能治療該病，臨床上的藥物多為暫時緩解患者的癥狀，但是不能有效逆轉中腦黑質多巴胺能神經元的損傷，隨著患者病情加重，藥物還會引起患者出現異動癥和癥狀波動等不良反應，隨著治療時間的延長，患者對藥物的療效會越來越差[10]。所以，尋找PD的病因和治療藥物是擺在廣大科研工作者面前的重大難題。

關于PD的病因和發病機制在神經科學界近年開展了大量的科學研究。研究發現，PD的主要病因為家族遺傳因素和外界環境毒素的接觸，其中環境因素在PD發病過程中的作用越來越受到醫學科研工作者的重視[11]。魚藤酮為脂溶性，可透過血腦屏障進入中樞神經系統，其進入神經系統后可以神經元內的線粒體電子傳遞脫氫酶結合并使其失去活性，導致神經元對氧的利用障礙和能量產生不足，最終導致神經元的凋亡和壞死。近年研究發現，中腦黑質多巴胺能神經元對魚藤酮的毒性較敏感，魚藤酮進入中樞神經系統后可以特異性的對多巴胺能神經元產生神經毒性[12]。實驗大鼠長期慢性接觸魚藤酮后可以出現類PD樣癥狀，表現為活動減少、行走時向一側旋轉等癥狀，病理研究后發現大鼠腦內出現多巴胺能神經元減少，同時在神經元出現了PD特征性病理變化嗜酸性包涵小體以及腦內紋狀體酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表達顯著降低。我們通過給予大鼠背部皮下注射魚藤酮后發現，該藥物可以導致大鼠出現運動減少和行走時向一側旋轉等類帕金森樣癥狀，表明魚藤酮是制備PD動物模型有效藥物，這與以往的研究結果一致。目前用于制備PD動物模型的兩種毒性物質六羥多巴(6-OHDA)和MPTP 均需多巴胺轉運體將其攝取，選擇性地損傷腦內的多巴胺能神經元，從而導致實驗動物出現類PD樣癥狀。但實驗動物多巴胺能神經元內始終沒有嗜酸性包涵體的出現。然而，長期慢性給予實驗動物魚藤酮可以損傷其腦內的黑質多巴胺能神經元，同時在神經元內可有嗜酸性包涵小體形成，該動物模型對左旋多巴藥物治療較為敏感[13]。以上的實驗證據表明，魚藤酮所致的PD模型更接近自然發生的疾病狀態；為PD的發病機制和治療藥物的篩選提供了較為適宜的動物模型。

氧化應激是指機體抗氧化能力減弱，產生大量氧自由基和氮自由基，過量的自由基可以對DNA和脂質等產生不可逆性損傷，從而導致機體疾病發生。科學研究發現，氧化應激被認為是導致衰老和疾病的一個重要因素。因此抗氧化損傷，減少腦內氧自由基的蓄積應是延緩疾病進展的一條重要途徑[14]。

谷胱甘肽(GSH)是一種肽類化合物，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三種氨基酸共價鍵結合而成，它是對機體保護的主要肽類物質之一，能有效地和體內的過氧化物及某些重金屬離子結合而降低其毒性，經過機體的代謝將其排出體外，維持體內的還原狀態，是體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑[15]。因此機體內GSH含量是衡量抗氧化能力的重要指標。本實驗中，魚藤酮背部皮下注射的大鼠腦內紋狀體中GSH 含量顯著低于對照組，我們的結果表明，PD大鼠腦內出現了氧化應激狀態，產生了大量的氧自由基，而自身的抗氧化能力下降，導致氧自由基堆積，造成神經元的損傷。MDA 是機體內脂質發生過氧化反應的終產物，具有較強的細胞毒性，能引起機體蛋白質、DNA等交聯聚合，對機體產生不可逆性損傷。由于MDA 為氧化代謝產物，其再體內的含量可以直接反映體內脂質過氧化程度和引起脂質過氧化的自由基的水平[16]。本實驗中，魚藤酮背部皮下注射的實驗組大鼠腦內MDA 含量明顯升高，提示在PD大鼠腦內發生了氧化應激反應，使脂質過氧化過程增強。既往也有研究報道，PD患者腦內發生了氧化應激反應，可以損傷腦內的多巴胺能神經元[17]，這與我們的研究結果一致。

LA是一種硫醇類化合物，眾多研究結果提示，LA具有強大的親電性和較強的清除活性氧的能力，抑制其對脂質、蛋白質和DNA 等生物大分子的損傷，抑制細胞氧化應激，是機體理想的抗氧化劑。同時，LA可保護機體免受各種有害因素的侵襲，包括解毒、抗炎及清除過量重金屬離子等。基于以上生物學特性，LA已廣泛應用與臨床疾病的輔助治療，包括心血管疾病、認知障礙性疾病、糖尿病等與氧化應激和炎癥相關性疾病[18]。

Nrf2 是機體內的一種重要的核轉錄因子，其本身的結構為亮氨酸拉鏈，機體的正常情況下，Nrf2 的氨基端和Keap1 蛋白特異地結合，使Nrf2 的活性受到抑制，從而穩定地存在細胞的胞漿內。當機體發生氧化應激反應，產生過度的氧自由基可以作為誘導劑有效的導致Nrf2 磷酸化后與Keap1解離，解離后的Nrf2能夠進入細胞核與抗氧化反應元件(ARE)結合，從而誘導機體內源性抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶表達上調，提高細胞的抗氧化和解毒能力，具有顯著細胞保護作用[19]。HO-1和NQO1為Nrf2-ARE結合后誘導產生的重要的抗氧化酶。研究證實，在腦血管病、癲癇、癡呆和糖尿病周圍神經病變等神經系統疾病中上調Nrf2、HO-1或者NQO1的表達能起到神經保護作用[20]。我們的前期研究發現，PD大鼠模型腦組織中Nrf2、HO-1和NQO1的表達明顯降低[21]，其受損程度和黑質多巴胺能神經元的表達呈正相關。本實驗研究發現，給予PD大鼠模型腹腔注射LA后能激活Nrf2-ARE通路，誘導其下游產物表達增強，改善腦內的氧化應激狀態，從而對黑質多巴胺能神經元起到保護作用。

本研究發現，給予PD大鼠模型LA腹腔注射能有效激活Nrf2-ARE通路，使Nrf2進入細胞核誘導其下游產物HO-1和NQO1表達增強，改善腦內的氧化應激狀態，可以對黑質多巴胺能神經元起到保護作用，從而改善PD大鼠模型的運動障礙癥狀。我們的研究證實氧化應激損傷在PD患者的發病過程中指著重要的病理作用，抗氧化劑LA能有效地保護帕金森模型腦內的多巴胺能神經元，為PD的臨床治療提供了新的靶點，同時為臨床藥物的選擇提供了新的思路。

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Protecive effects of alpha-lipoic acid on brain substantia nigra dopaminergic neurons in rats with Parkinson’s disease and its action mechanism

WUYanfen*,CHENWen*,WANGMingfei,etal.

*DepartmentofEndocrinology,TheFirstHospitalofHandanCity,Hebei,Handan056001,China

Objective To investigate the protecive effects of alpha-lipoic acid (LA) on brain substantia nigra dopaminergic neurons in rats with Parkinson's disease (PD) induced by rotenone, and to explore its action mechanism.Methods Sixty healthy male Wistar rats (3-month age) were randomly divided into three groups:control group, experimental group and drug intervention group,with 20 rats in each group. The rats in control group were given sunflower oil by subcutaneous injection, however,the rats in experimental group and drug intervention group were given rotenone by subcutaneous injection to establish PD models,moreover,the rats in drug intervention group were given LA simultaneously by peritoneal injection.The expression levels of tyrosine hydroxylase (TH), transcription factor NF-E2 related factors, anti-oxidant response elements (Nrf2-ARE) and heme oxygenase 1 (HO-1) in brain substantia nigra of rats were detected by Western Blot,moreover, the levels of malondialdehyde (MDA) and reduced glutathione (GSH) in brain striatum of rats were detected by spectrophotometric method.Results The expression levels of TH protein in mesencephalon of rats in experimental group were significantly lower than those in control group (P<0.05),however, the expression levels of TH protein in brain substantia nigra of rats in drug intervention group were significantly higher than those in experimental group (P<0.05), but which in drug intervention group were significantly lower than those in control group (P<0.05). The expression levels of Nrf2 and HO-1 protein in experimental group were significantly lower than those in control group (P<0.05),however, which in drug intervention group were significantly higher than those in experimental group (P<0.05),moreover,which in drug intervention group were significantly lower than those in control group (P<0.05). As compared with those in control group, the levels of MDA in striatum tissues of rats in experimental group were significantly increased (P<0.05),however, after drug intervention,the levels of MDA were significantly decreased (P<0.05),but which were still significantly higher than those in control group (P<0.05). As compared with those in control group, the levels of GSH in experimental group were significantly decreased (P<0.01), however, after drug intervention,the levels of GSH were significantly increased (P<0.05), but which were still significantly lower than those in control group (P<0.05).Conclusion LA can effectively activate the Nrf2-ARE signal pathway to relieve the injury of dopaminergic neurons in brain of rats,moreover,which can improve the symptoms of PD.

Parkinson’s disease; α-lipoic acid; oxidative stress; transcription factor NF-E2-related factor /antioxident response element; heme oxygenase-1

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.14.006

項目來源：河北省邯鄲市科學技術研究與發展計劃項目(編號：1423108128)

056001 河北省邯鄲市第一醫院內分泌科(吳艷芬、陳文),神經內科(王偉)；河北省邯鄲市婦幼保健院(王鳴飛)

王偉，056001 河北省邯鄲市第一醫院神經內科;

E-mail：sunnywangwei@163.com

R 742.502

A

1002-7386(2017)14-2105-05

2017-01-26)