提高玉米愈傷組織再生率的研究

李海霞，孫金花，邢國珍，王愛武

（河南農業大學，河南鄭州450002）

提高玉米愈傷組織再生率的研究

李海霞，孫金花，邢國珍，王愛武

（河南農業大學，河南鄭州450002）

為了提高玉米愈傷組織再生率，以1個玉米自交系和3個雜交種的幼胚愈傷組織為試材，接入含有不同濃度2，4-D的分化預處理培養基（N6＋脯氨酸700 mg/L＋水解酪蛋白500 mg/L＋蔗糖30 g/L），2，4-D濃度設0、0.5、1.0和1.5 mg/L計4個處理，培養7 d后轉移到分化培養基中進行分化處理，以繼代培養7 d的愈傷組織直接轉入分化培養基進行植株再生作為對照，研究了不同濃度2，4-D分化預處理對玉米愈傷組織再生率和再生進程的影響。結果表明：愈傷組織在轉入分化培養基前進行預處理，可以提高玉米植株再生率。分化預處理培養基以不加2，4-D的效果最好，玉米愈傷組織再生率最高，與對照差異達到了極顯著水平，且分化成苗進程加快。不同基因型中，雜交種87-1×鄭22的植株再生率最高，與其他2個雜交種差異不顯著，但三者的植株再生率均極顯著高于自交系87-1。對玉米愈傷組織進行分化前的預處理，可以提高植株再生率，加快再生進程。

玉米；愈傷組織；分化；預處理；再生

生物技術的快速發展為玉米遺傳育種提供了新途徑，同時也對玉米組織培養體系提出了更高要求。愈傷組織作為基因轉化的一種受體，其再生成為轉基因技術的關鍵。自1975年Green等[1]利用玉米幼胚作為外植體誘導出愈傷組織并成功獲得再生植株以來，玉米再生體系技術得到了不斷完善和發展，已經利用玉米幼穗[2]、芽尖[3]、幼嫩花序[4]、花藥[5]、幼苗切段[6]、成熟胚[7]等外植體培養并成功獲得了再生植株。研究表明，在培養基中添加一定質量濃度的山梨醇或脫落酸（ABA），可有效提高愈傷組織的植株再生頻率[8～10]；對秈稻愈傷組織進行干燥處理后，可使其再生頻率極大提高[11]；玉米愈傷組織經過吸濕干燥處理后，可以增加分化前期再生植株的比例[12]。前人對影響愈傷組織再生的生長調節劑研究，主要是在分化培養基中添加不同濃度的KT和6-BA[13～16]。而如何使愈傷組織從脫分化快速進入再分化狀態還有待于探討。利用含有不同濃度2，4-D的培養基對玉米愈傷組織進行分化前的預處理，研究其對玉米愈傷組織再生的影響，旨為提高玉米植株再生率提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料參試玉米愈傷組織為自交系87-1以及雜交種87-1×鄭22、鄭22×87-1和昌7-2×HⅡA繼代培養的胚性愈傷組織。

1.1.2 培養基配方繼代培養基：N6＋2，4-D 2.0 mg/L＋脯氨酸700 mg/L＋水解酪蛋白500 mg/L＋蔗糖30 g/L；分化預處理培養基：N6＋脯氨酸700 mg/L＋水解酪蛋白500 mg/L＋蔗糖30 g/L＋2，4-D（試驗設計的濃度）；分化培養基：N6＋6-BA 1.0 mg/L＋KT 1.0 mg/L＋脯氨酸700 mg/L＋水解酪蛋白500 mg/L＋蔗糖20 g/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 愈傷組織的獲取取人工套袋授粉10～14 d的玉米雌幼穗，剝取長1～2 mm的幼胚，在繼代培養基上進行愈傷組織誘導和繼代培養，繼代培養條件為無光照、溫度26℃，20 d左右繼代1次。

1.2.2 分化誘導預處理挑選生長一致的繼代培養的愈傷組織，接入含有不同濃度2，4-D的分化預處理培養基，2，4-D濃度設0.0、0.5、1.0和1.5 mg/L計4個處理，依次記作S0.0、S0.5、S1.0和S1.5；培養7 d后轉移到分化培養基中，進行分化處理。以將愈傷組織接入正常繼代培養基，7 d后轉入分化培養基進行植株再生作為對照（CK）。每處理均接種10個培養皿，愈傷組織接種量10塊/皿，統計時去除培養過程中污染的處理。每周統計愈傷組織再生苗數、綠色愈傷數、生根數，以及5周的總出苗數（以苗高1.5 cm以上為出苗標準），計算愈傷組織再生率（%，出苗的愈傷組織塊數/誘導再生愈傷組織塊數×100）。并肉眼觀察不同處理的愈傷組織再生進程。

1.3 數據處理

利用Excel軟件對試驗數據進行比較、方差分析和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度2，4-D分化預處理對玉米愈傷組織再生率的影響

將玉米愈傷組織接入含有不同濃度2，4-D的分化預處理培養基，培養7 d后結果（表1）顯示，除了個別預處理外，大部分基因型愈傷組織經過預處理的再生率與CK相比有不同程度的提高，其中，S0.0處理87-1、87-1×鄭22、鄭22×87-1和昌7-2×HⅡA的再生率分別為13.33%、40.00%、31.33%和27.78%，均明顯＞其CK。相同濃度的2，4-D處理下，雜交種87-1×鄭22、鄭22×87-1和昌7-2×HⅡA的再生率均＞自交系87-1。

表1 不同濃度2，4-D分化預處理對玉米愈傷組織再生率的影響Table 1 Effect differenciation pretreatment w ith different 2，4-D concentration on callus regeneration rate of maize

對分化過程中不同基因型和不同濃度2，4-D分化預處理的愈傷組織再生差異進行方差分析，結果（表2）顯示，玉米基因型和2，4-D濃度均對愈傷組織再生有顯著影響，其中，基因型的影響極為顯著。進一步對不同基因型之間的再生差異進行顯著性比較后發現，雜交種87-1×鄭22、鄭22×87-1、昌7-2×HiⅡA的出苗率差異不顯著，但均與自交系87-1差異達到了極顯著水平（表3）；對不同濃度2，4-D處理之間的再生差異進行顯著性比較后發現，4個分化預處理之間差異均不顯著，但是，S0.0處理與CK差異達到了極顯著水平，而其他3個處理與CK差異均不顯著（表4）。

表2 不同基因型和2，4-D濃度對玉米愈傷組織再生差異的方差分析Table 2 ANOVA analysis of regeneration on genotype w ith different 2，4-D concentration treatment

表3 不同基因型的玉米愈傷組織再生率差異顯著性比較Table 3 Difference com parison of regeneration rate w ith difference genotypes

表4 不同濃度2，4-D處理的玉米愈傷組織再生率差異顯著性比較Table 4 Difference comparison of regeneration rate with 2，4-D concentration treatment

2.2 不同濃度2，4-D分化預處理對玉米愈傷組織再生進程的影響

不同濃度的2，4-D分化預處理，對玉米愈傷組織再生進程的影響明顯不同（表5）。分化第1周，僅S0.0處理下雜交種87-1×鄭22和鄭22×87-1有苗長出，再生率分別為2.86%和8.89%；而CK無再生苗。分化第2周，S0.0處理的雜交種87-1×鄭22和鄭22× 87-1的出苗數繼續增多，出苗率分別達到了15.71%和14.44%；昌7-2×HiⅡA也開始有苗分化，出苗率為1.11%。分化第3周，CK中僅昌7-2×HiⅡA有1株苗分化，而其他基因型仍沒有出苗；自交系87-1 S0.0處理開始有苗分化，分化率為6.67%，而其CK直到第5周才開始有苗分化，分化率為4.00%。表明分化預處理可以加快玉米植株的再生進程，且使綠色愈傷組織和生根數增多。該結果與實際觀察結果（圖1）一致。

3 結論與討論

植物生長調節劑對植物組織培養中愈傷組織誘導與分化過程具有重要作用，同種植物生長調節劑的不同濃度、不同植物生長調節劑的相互作用對愈傷組織的誘導與分化產生重要影響。2，4-D能啟動脫分化，誘導外植體產生愈傷組織，在繼代過程中，2，4-D具有防止愈傷組織褐化的作用[18]。2，4-D是誘導愈傷組織必不可少的因素，其濃度至關重要[19]。各類植物激素的生理作用具有相對的專一性，誘導脫分化與分化的過程需要不同植物激素的調控。2，4-D是誘導體細胞發生的重要物質，主要促進細胞生長。在附加2，4-D的N6或MS培養基上誘導產生大量愈傷組織，但當其轉入含有KT和6-BA的培養基后，體細胞生長發育，分化形成再生植株。早在20世紀60年代國外學者就建立了胡蘿卜體細胞胚發生體系，胡蘿卜在含有2，4-D的MS培養基中可誘導愈傷組織和胚性愈傷組織的形成，當轉移至無2，4-D的MS培養基中可誘導體細胞胚的形成與發育[20]。

表5 S0.0處理對玉米愈傷組織再生進程的影響Table 5 Effect of S0.0treatment on callus regeneration proceeding of maize

圖1 S0.0處理第1周時的玉米愈傷組織分化狀態Fig.1 Comparison the regeneration between CK and S0.0treatment after 1 week

在組織培養中愈傷組織的繼代和分化需要不同的植物調節劑，如何縮短2種控制不同培養狀態的植物生長調節劑的交互作用時間，使組織細胞盡快以旺盛的生命力從繼代培養進入到分化狀態，生成再生植株至關重要。本研究采用不同濃度的2，4-D進行分化前預處理，對玉米愈傷組織再生率及再生進程進行研究，結果表明，在培養基中不加2，4-D進行分化前預處理，對提高玉米愈傷組織植株再生率效果明顯，各基因型反應一致。低濃度的2，4-D對愈傷組織的處理也與CK有明顯區別，普遍提高了玉米愈傷組織的植株再生率。原因是2，4-D濃度降低，減弱了體細胞增生的趨勢，愈傷組織一旦轉入分化培養基，吸收KT和6-BA后，能使這2種物質快速發揮作用，促進其分化出苗。這種處理方法對提高玉米植株再生率，尤其是某些再生植株困難的基因型有一定的實用價值，并對玉米轉基因技術研究具有特別意義。

再生苗的健壯程度是影響組培苗移栽成活率的一個重要因素。實踐證明，分化速度快、莖稈粗壯、葉片較寬的再生苗，移栽后緩苗期短，移栽成活率高。在愈傷組織分化過程中，加快愈傷組織植株再生，縮短分化出苗時間對獲取健壯植株至關重要。本研究結果表明，不加2，4-D的分化預處理，愈傷組織變綠速度較不進行分化預處理的對照快，且顏色濃綠，綠色面積更大，愈傷組織的分化進程明顯加快。因此，分化前降低繼代培養基2，4-D濃度對玉米愈傷組織的分化起著一定的調控作用，有利于體細胞胚的形成，對分化有促進作用。

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Study on Improvement of Callus Regeneration Frequency in M aize

LI Hai-xia，SUN Jin-hua，XING Guo-zhen，WANG Ai-wu
（He’nan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China）

In order to improve the regeneration rate on maize callus，different 2，4-D concentration including 0，0.5，1.0 and 1.5 mg/L were used to pretreatment callus media of N6+700 mg/L proline+500 mg/L casein hydrolysate+30 g/L sucrose.The regenerate rate of different media after 7 days transformation was compared with CK as directly transformation.The effects of different 2，4-D concentration of differentiation pretreatments on callus regeneration frequency and regeneration process were investigated by using one inbred line and three hybrids immature embryos of maize as experimental materials.The results indicated that there was a significant increase on regeneration frequency with different 2，4-D concentration of pretreatments before transferred to differentiation medium. The pretreatment medium without 2，4-D could significantly improve the maize regeneration seedling frequency and accelerate the plant regeneration process.There was a significant different regeneration frequency with various genotype calluses.With the increase of 2，4-D concentration，the regeneration frequency of the same genotype callus was in a downward tendency in the several experimental genotypes.There was a highest regeneration rate on hybrids 87-1×Zheng 22 and no significant difference with other 2 hybrids.The plant regeneration frequency of three hybrids was generally higher than that of inbred line of 87-1.This demonstrated that the pretreatment with maize callus can increase the plant regeneration frequency and accelerate the regenerate process.

Maize；Callus；Differenctiation；Pretreatment；Regeneration

Q813.1

：A

：1008-1631（2017）02-0057-04

2016-09-07

河南省高等學校重點科研項目（15A180039）；河南農業大學本科教學實驗室開放項目（KF1613）

李海霞（1972-），女，河南輝縣人，實驗師，碩士，主要從事植物生理生化研究。E-mail：527801231@qq.com。