水楊酸和普魯蘭多糖對東北刺人參不定根生物活性物質積累的影響

李 賀， 金善玉, 王洪秋， 劉冠甫， 蔣曉龍， 樸炫春*

(1.延邊大學農學院;2.延邊州食品藥品檢驗所:吉林 延吉 133002)

水楊酸和普魯蘭多糖對東北刺人參不定根生物活性物質積累的影響

李 賀1， 金善玉2, 王洪秋1， 劉冠甫1， 蔣曉龍1， 樸炫春1*

(1.延邊大學農學院;2.延邊州食品藥品檢驗所:吉林 延吉 133002)

誘導子是促進植物細胞、組織和器官培養物中生物活性物質最常用的方法。本試驗將水楊酸(SA)和普魯蘭多糖(PL)作為2種誘導子分別對東北刺人參不定根進行處理，旨在探究2種誘導子對懸浮培養的東北刺人參不定根中多糖、酚類及黃酮等生物活性物質積累的影響。同時，對東北刺人參不定根的乙醇提取物的抗氧化特性進行了研究。結果表明，經SA、PL處理后，不定根中生物活性物質的積累量顯著增加。在懸浮培養40 d時加入100mol SA處理4 d時多糖、酚類和黃酮的積累量達到最大值，產量分別比未處理組高出1.22、1.45和1.45倍；PL在200 mg/L時誘導效果最佳，且相比酚類和黃酮，多糖積累量增加最為顯著。對于東北刺人參不定根提取物的抗氧化能力的測定結果顯示，DPPH及烷基自由基的ESR信號強度隨著提取物濃度的增加而降低。

不定根；誘導子；生物活性物質；抗氧化

東北刺人參(OplopanaxelatusNakai)為五加科刺人參屬的多年生落葉灌木，分布在中國東北、韓國以及俄羅斯遠東地區[1]。作為長白山珍稀藥用植物，東北刺人參具有多種生物活性物質，主要有揮發油、黃酮、蒽醌、脂肪酸、多糖以及多種皂苷等[2]。東北刺人參有抗抑郁、抗真菌、抗癌、抗氧化特性等多種藥理活性[3]，同時對血壓和生殖功能也有積極作用[4]。然而，東北刺人參對土壤和環境要求較為苛刻，且種子發芽率及播種出苗率較低，導致野生資源日益減少[5]，現被列為國家二級保護植物[6]。加之人工栽培技術不完善，現已處于瀕危狀態，植物原材料的短缺使東北刺人參的產品開發受到限制。而植物組織培養是大規模生產次生代謝產物的有效替代途徑，在反應器培養過程中常用的提高次生代謝產物的手段是利用誘導子，誘導子是一種信號分子，能夠引起植物體防御、過敏反應或相關蛋白的表達，以觸發植物細胞內代謝物的形成。水楊酸(SA)和普魯蘭多糖(PL)是植物組織培養過程中常用的2種誘導子， SA已經被廣泛應用于各種培養物的誘導，如半夏[7]、黃芩等。PL也同樣被廣泛應用，包括作為添加劑用于食品和制藥產業[8-9]，也曾被作為誘導劑來增強代謝生物合成。雖然PL作為誘導子這一應用尚未被推廣開來，但Savitha等[10]指出，經PL處理后的甜菜不定根中甜菜紅堿的含量顯著增加。因此，為了提高東北刺人參不定根中多糖、酚類以及黃酮等生物活性物質的積累量，本研究探索了SA和PL不同的誘導因子對積累量的影響；為了評估不定根的生物活性，用電子自旋共振(ESR)光譜儀對不定根的乙醇提取物進行抗氧化性能的測定，旨在為東北刺人參產品的開發以及工廠化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

參照李慧娟[11]的誘導方法獲得東北刺人參不定根。將獲得的不定根切成長度約1 cm大小，并稱取20 g接種于裝有4 L MS培養基的5 L氣球型生物反應器中，培養基為MS+IBA 3.0 mg/L + 蔗糖50 g/L，PH值為5.8。培養條件設置為25 ℃，通氣量為75 mL/min，在黑暗條件下培養40 d后收獲的不定根即為本試驗的試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 水楊酸和普魯蘭多糖對反應器內東北刺人參不定根生物活性物質積累的影響

將生物反應器培養40 d的東北刺人參不定根和培養液用于本試驗，每100 mL收集的培養液裝入150 mL錐形瓶中。為篩選2種誘導子的最佳處理濃度，向錐形瓶中加入100 μmol的SA，并分別培養0，2，4，6，8和10 d；向錐形瓶中分別加入0，100，200，300和400 mg/L PL并培養4 d；將以上試驗中篩選出的SA和PL 2種誘導子最佳處理濃度及其濃度的一半進行組合，即100 μmol SA；200 mg/L PL；SA+PL(50 μmol SA+100 mg/L PL)；SA+PL (100 μmol SA+200 mg/L PL)，分別對不定根誘導培養4 d，設置一組不添加任何誘導子的對照組。以上3個試驗中，每個錐形瓶中接種10 g新鮮的不定根，并在轉速為100 r/min的振蕩器(GYCS-2013B，金壇市科析儀器有限公司，中國)上，在25 ℃下暗培養。經誘導子處理后，將收獲的不定根在流水下沖洗2次后瀝干根表面的水分，在50 ℃恒溫烘干箱(YHW1103，天津市華北實驗儀器有限公司，中國)中烘干至恒重，并記錄干重，將收集的不定根干粉用于制備提取物和檢測多糖、酚類以及黃酮含量。

1.2.2 不定根提取物中抗氧化能力的測定

將反應器培養40 d的不定根干粉烘干，并稱取15 g，置于錐形瓶中用200 mL的80%乙醇溶液浸泡并超聲提取1 h，用濾紙過濾后收集濾液，同等條件共重復3次。各自收集并合并的濾液分別為不定根的乙醇提取物(Ethanol-ARE)，并在37 ℃下減壓濃縮干燥至粉末狀。將提取物干粉置于4 ℃冰箱中待測DPPH自由基與烷基自由基清除能力。

1.3 測定

1.3.1 多糖含量的測定

參照Li等[12]的方法測定多糖含量，稱取不定根干粉0.1 g，用90%乙醇在25 ℃條件下浸泡洗滌6 h，收集沉淀，向其中加80%乙醇以去除內含物，如單糖、低聚糖和糖苷。加入蒸餾水20 mL并超聲提取30 min，過濾后收集濾液。向濾渣中加入與之前同等體積蒸餾水并超聲，共重復3次。合并以上濾液，并定容至100 mL，即得待測樣品溶液。以苯酚-濃硫酸法在490 nm處測定葡萄糖的吸光值，并計算多糖含量。

多糖含量/(mg·g-1) =(CDf)·W-1

式中，C為樣品溶液中葡萄糖濃度/(g·L-1)；D為樣品溶液的稀釋因素；f為換算因子； W為樣品的質量/g。

1.3.2 黃酮含量的測定

參照Yin等[13]的方法測定黃酮含量，稱取0.1 g不定根干粉置于錐形瓶中，用10 mL 70%乙醇浸泡，在60 ℃恒溫水浴鍋內加熱3 h后用濾紙過濾，收集濾液在轉速為5 000 r/min條件下離心10 min，將上清液用70%乙醇定容至25 mL，取1 mL提取物置于試管中，并以6 min間隔加入以下試劑：0.3 mL 5%亞硝酸鈉，0.3 mL 10%硝酸鋁和2 mL 4%氫氧化鈉。將這些試劑混合并在室溫下孵育15 min。用蘆丁作標準曲線，在510 nm處測定吸光值，并計算黃酮含量。

黃酮含量/(mg·g-1)=CVD × 10

式中，C為樣品溶液濃度/(mg·mL-1)；V為樣品溶液體積/mL；D為稀釋倍數。

1.3.3 酚類含量的測定

參照Singleton[14]的方法測定酚類含量，稱取0.1 g不定根干粉置于錐形瓶中，用10 mL 80%甲醇在80 ℃恒溫水浴鍋中浸泡并洗滌2 h，用濾紙過濾后在轉速為5 000 r/min,溫度4 ℃下離心10 min，將上清液用80%乙醇定容至25 mL，向裝有0.2 mL 10%福林-酚試劑和1 mL碳酸鈉溶液的試管中加入2 mL上述上清液，振蕩后再暗處靜止1 h，于760 nm處測定吸光值并計算酚類含量。

酚含量/(mg·g-1)= CVD × 10

式中，C為樣品溶液濃度/(mg·mL-1)；V為樣品溶液體積/mL；D為稀釋倍數。

1.3.4 抗氧化活性的測定

參考Nanjo等[15]的方法測定DPPH自由基清除能力，將30 μL的不定根提取物在甲醇溶液中加入到30 μL 60 μmol的DPPH中。振蕩10 s后，將溶液轉移到100 μL聚四氟乙烯毛細管中，用JES-FA ESR光譜儀(日本電子株式會社，東京，日本)測定DPPH自由基的清除能力。通過線性回歸分析得出具有50%自由基清除活性(IC50)的提取物。

1.4 數據整理與軟件分析

每個試驗處理重復3次，利用SAS程序對數據進行方差分析，采用鄧肯氏新復極差法進行比較，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 水楊酸對東北刺人參不定根生物量及生物活性物質積累的影響

將生物反應器培養40 d的東北刺人參不定根和培養基分裝至150 mL錐形瓶并加入100 μmol的SA，分別培養0，2，4，6，8和10 d。結果發現SA能夠明顯影響不定根生物量及生物活性物質的積累，隨著處理天數的增加，不定根生物量不斷下降。多糖、酚類及黃酮含量隨著SA處理時間的增加呈先增加后減少的趨勢，在4 d時達到最大值，分別比對照組高1.22、1.45和1.45倍，為175.1、40和44.9 mg/g(表1)，由此可得出結論，SA最佳處理天數為4 d。

表1 水楊酸(100 M)處理天數對東北刺人參不定根生物量及生物活性物質積累的影響

Table 1 Effect of treatment days of the SA (100 M) on biomass and bioactive compound accumulation of O. elatus adventitious roots (ARs)

表1 水楊酸(100 M)處理天數對東北刺人參不定根生物量及生物活性物質積累的影響

處理時間 d干重g多糖含量(mg·g-1DW)酚含量(mg·g-1DW)黃酮含量(mg·g-1DW)01．10±0．12a143．6±1．44c27．6±0．29c31．0±0．87c20．93±0．01b155．9±0．64b29．7±0．17b35．1±0．64b40．91±0．01b175．1±1．62a40．1±0．40a44．9±0．64a60．86±0．02b142．8±0．40c29．1±0．23b30．8±0．16c80．84±0．02b138．4±0．75d14．8±0．23d16．6±0．23d100．83±0．01b128．2±1．04e13．2±0．46e9．6±0．23e

注：數值表示3次重復的平均值±標準偏差。不同字母表示在0.05水平上差異顯著，下同。

2.2 普魯蘭多糖對東北刺人參不定根生物量及生物活性物質積累的影響

將生物反應器培養40 d的東北刺人參不定根和培養基分裝至150 mL錐形瓶并加入0，100，200，300和400 mg/L的PL培養4 d，結果發現PL對不定根生物量沒有抑制作用，且隨著PL濃度的增加，對生物活性物質的生產有促進作用，在PL濃度為200 mg/L時多糖、酚類及黃酮含量達到最大值。但不同生物活性物質的增加程度各不相同，多糖，酚類和黃酮類物質含量比對照組高1.89，1.52和1.30倍，分別為205.4、29.9和32.7 mg/g。而在PL濃度大于200 mg/L后，生物活性物質含量呈下降趨勢(表2)。因此，PL最佳處理濃度為200 mg/L。

表2 普魯蘭多糖不同濃度處理4 d對東北刺人參不定根生物量及生物活性物質積累的影響

2.3 水楊酸、普魯蘭多糖及其組合之間的誘導作用比較

將生物反應器培養40 d的東北刺人參不定根和培養液分裝至150 mL錐形瓶中，并將以上試驗中篩選出的SA和PL 2種誘導子最佳處理濃度及其濃度的一半進行組合并誘導培養4 d。結果發現在SA和SA+PL處理后生物量呈下降趨勢，但在PL和SA+PL 2種處理中，生物量沒有減少，因此，SA對生物量的抑制作用高于PL。對于生物活性物質含量的影響，測定多糖含量的最大值出現在PL處理組，酚類含量最大值出現在SA+PL組合處理組，而黃酮含量最大值出現在SA處理組。因此，在東北刺人參不定根培養過程中，SA和PL對不同生物活性物質誘導的有效程度不同。SA+PL的組合處理表現出了協同作用，雖然低于SA和PL單獨處理組，但生物活性物質的含量明顯高于對照組(表3)。

表3 不同誘導子及其組合處理4 d對東北刺人參不定根生物量及生物活性物質積累的影響

Table 3 Comparison of effects among elicitors and their combinations on biomass and bioactive compound accumulation ofO. elatus ARs after 4 d of elicitation

處理干重g多糖含量(mg·g-1DW)酚含量(mg·g-1DW)黃酮含量(mg·g-1DW)Control1．06±0．03a110．0±3．00e19．1±0．52c31．6±0．23cSA0．88±0．01b137．4±1．50d31．1±0．64a42．6±0．81aPL1．07±0．04a197．5±1．56a30．3±0．40a36．1±1．10b1/2SA+1/2PL0．99±0．01a160．8±5．31b21．0±0．58b31．2±0．69cSA+PL0．85±0．01b150．7±0．98c17．4±0．35d28．3±0．98d

對照組：不用誘導子處理的不定根；SA：100M；PL：200 mgL-1；1/2SA+1/2PL：50M SA + 100 mg/L PL；SA+PL：100M SA+200 mg L-1PL.誘導子添加時期為反應器培養第40天并處理4 d。

2.4 東北刺人參不定根的提取物對抗氧化活性的影響

對東北刺人參不定根的乙醇提取物進行DPPH自由基以及烷基自由基清除能力的測定，結果顯示，DPPH自由基的ESR信號強度隨著提取物濃度的增加而降低，同樣的趨勢在烷基自由基清除能力的測定結果中也表現出來，IC50分別為7.1和22.3 μg/mL，這表明東北刺人參不定根的乙醇提取物具有較高抗氧化活性(圖1)。

DPPH 自由基光譜 烷基自由基光譜

3 討論

由于不定根具有快速生長、均勻性和穩定性等特點，同時也有利于組織培養物合成更大數量和更高質量的次生代謝物。因此，將植物不定根作為培養物已經被用于許多物種的擴繁培養，并以此來生產大量的次生代謝物，如貫葉連翹[16]、紫錐菊[17]等。而在生產過程中常利用非生物誘導子來提高不定根次生代謝物產量，這是因為這種外源信號分子能夠激活植物次生代謝過程中的酶，以增加次生代謝產物的產生。在本研究中，采用SA和PL作為誘導子對東北刺人參不定根進行誘導，在處理過程中雖然生物量隨著SA濃度升高而下降，但是生物活性物質含量卻隨之升高。SA對生物量的增長有負面作用的現象在幾個研究中都有顯示，張春榮等[18]利用水楊酸對野葛細胞懸浮培養發現，水楊酸并不能提高野葛生物量，并且易使細胞發生褐化現象；黃蓓等[19]利用水楊酸處理霍山石斛原球莖時也發現，隨著SA處理濃度的增加，原球莖生長量一直呈下降趨勢。他們將原因歸納為，生長量和有效物質的積累并非同步進行，前者變化發生在后者之前，而后者的積累會抑制前者的積累。雖然對于PL可作為誘導子這一利用并未引起研究學者的注意，但是其誘導效果是明確的，經過PL處理后的東北刺人參不定根中有效物質含量明顯提高，但是其作用機制尚未明確。誘導子的協同作用在植物細胞、組織或器官培養物的代謝過程中也是同樣重要的，一些研究結果也表明不同誘導子組合能有效提高代謝產物的產量。Yan等[20]研究發現，酵母提取物與不同生物誘導子組合對丹參酮I和丹參酮IIA的產生具有顯著的協同作用，但不影響仙客來酐水平。本試驗也對DPPH及烷基自由基的清除能力進行測定，結果顯示東北刺人參不定根提取物具有一定的抗氧化能力，根據許多研究都將黃酮和酚類化合物從植物中提取出來并廣泛應用[21-23]，這也許與其抗氧化活性有較大聯系[24-25]，關于抗氧化能力其主要作用物質的確定還需要做進一步的分析。

4 結論

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Effect of salicylic acid and pulullan on bioactive compounds in adventitious roots ofOplopanaxelatus

LI He1, JIN Shanyu2， WANG Hongqiu1, LIU Guanfu1, JIANG Xiaolong1, PIAO Xuanchun1*

(1.AgriculturalcollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China； 2.yanbianinstituteFoodandDrug，YanjiJilin133001,China)

Alicitors are commonly used to promote bioactive compounds in plant cells, tissues and organ cultures. In the present study, salicylic acid (SA) and pullulan (PL) were used as two elicitors to deal with the adventitious roots of theOplopanaxelatus, respectively. The aim of this study was to investigate the effects of two elicitors on the accumulation of polysaccharides, phenol and flavonoids. At the same time, the antioxidant properties of adventitious ethanol extract were studied. The results showed that the accumulation of bioactive compounds in adventitious roots increased in SA treatment significantly. The accumulation of polysaccharides, phenol and flavonoids reached the maximum levels at the time of 40 days of suspension treatment, and the yields were 1.22,1.45,1.45 times higher than that of the untreated group, respectively. PL was the best at 200 mg/L, and the accumulation of polysaccharides was the most significant. The results of the determination of the antioxidant capacity of the adventitious root extract showed that the ESR signal strength of the 1,1-diphenyl-2-picrylhy-drazyl (DPPH) and alkyl radicals obviously decreased with the increasing adventitious roots extract concentrations.

adventitious root; elicitor; bioactive compound; antioxidant

2017-03-05 基金項目：國家自然科學基金項目(31260182、31660080)

李賀(1991—)，女，吉林松原人，在讀碩士，研究方向為植物組織培養及生物反應器的應用。樸炫春為通信作者，

E-mail: mllian@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)02-0009-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.02.002

S567.51

A