深圳灣紅樹林根際富油酵母的篩選與鑒定

安娜+楊淵+沈蘭琳+朱卓+郭馨杰+薛智權

摘 要：從深圳灣紅樹林根際土壤和海水樣品中篩選到一株富油酵母，對其基本形態、油脂積累情況和生物學地位進行研究，旨在為開發其應用潛力提供理論指導。利用松花粉垂釣法篩選得到富油酵母，用顯微鏡觀察其基本形態，采用尼羅紅染色法觀察油脂積累情況，擴增18S rRNA序列對該富油酵母進行分子鑒定，并用GC-MS分析菌株的油脂含量和組成情況。結果顯示，篩選得到一株富油酵母菌，在低氮培養基中72 h油脂積累即達到平臺期。18S rRNA序列鑒定其屬于Cyberlindnerasaturnus sp.。脂肪酸含量達到細胞干質量的55%，主要成分為C15∶0、C16∶0和C17∶0的飽和脂肪酸，含量達到總脂肪酸的90%以上。該酵母菌適合用于生物柴油的生產。

關鍵詞：紅樹林；富油酵母；篩選；18S rRNA；GC-MS

中圖分類號：TE667 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.07.002

Screening and Identification of Oil-rich Yeast from Mangrove Rhizosphere of Shenzhen Bay

AN Na， YANG Yuan， SHEN Lanlin， ZHU Zhuo， GUO Xinjie， XUE Zhiquan

（College of Life Science， Shanxi Agricultural University， Jinzhong， Shanxi 080301， China）

Abstract：Anoil-rich yeast strain was screened from mangrove rhizosphere soil and seawater samples of Shenzhen bay， and its morphology， oil accumulation and taxonomy were studied. The pine pollen fishing method was used for screening and its morphology was observed by microscope， Nile red staining was used to observe the oil content， the molecular identification of the oil rich yeast was conducted by enhancing 18S rRNA gene sequence， and GC-MS was used to analyze the oil content and composition. The result showed that the strains of the yeast identified by 18S rRNA gene belonged to Cyberlindnerasaturnus sp.， and the strains had the genus of rich oil. It is concluded that the yeast is suitable to producing biological diesel oil.

Key words：mangrove； oil-rich yeast； screening； 18S rRNA； GC-MS

近年來，隨著石油能源枯竭、全球資源短缺及環境污染等問題的日益嚴重，生物柴油因其原料的可再生性、易生物降解、清潔無污染等特性，被認為是傳統石油的最佳代替品之一，已成為國際研究熱點[1-3]。

深圳紅樹林位于陸地和海洋環境的動態交界面，為熱帶亞熱帶海洋潮間帶獨特的生態系統。因周期性的海水侵襲、河口有機質的沉積和落葉的腐敗作用使其中富含有機質和腐殖質，并形成了特殊的生態環境，其中生活著眾多生物，也蘊含了極其豐富的微生物資源[4]。對鹽脅迫和富營養化環境的長期適應，使得紅樹林微生物在形成特殊群落的同時，也可產生大量活性代謝產物。紅樹林土壤中的微生物不但在環境修復和城市污水處理中扮演著重要的角色[5-6]，同時也是多種重要工業和醫藥產業中間產物的生產者[7]。其中的多種微生物能夠合成和積累大量的多不飽和脂肪酸和中長鏈飽和脂肪酸，在食品、保健品和生物新能源等行業中具有巨大的潛在應用價值[8-10]。

本研究從深圳紅樹林根際土壤和海水樣品中篩選到一株富油酵母菌株，研究了其基本形態、油脂積累情況，并用18S rRNA基因序列對其進行鑒定，可為菌種工業化高產脂肪酸提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 培養基

篩選培養基：葡萄糖30 g·L-1，胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，海水晶15 g·L-1，蒸餾水配制。固體培養基加20 g·L-1的瓊脂。

低氮培養基：葡萄糖30 g·L-1，胰蛋白胨1.5 g·L-1，酵母提取物1 g·L-1，海水晶1.5 g·L-1，KH2PO4 0.25 g·L-1，蒸餾水配制。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集與分離 從深圳灣紅樹林保護區采集紅樹林根際土壤和海水樣品，放入滅菌的密封離心管中帶回實驗室，立即進行菌株分離。分離采用松花粉垂釣法：在無菌平板中加入 2 mL 海水樣品和 10 mL 海水培養基，并加入少量松花粉（95 ℃烘箱處理1 h）作為誘餌，在室溫條件下培養1周。分別在接種土壤和海水的培養基中挑選菌種轉接到新鮮的海水（含有松花粉、0.075%鏈霉素和0.05%氨芐西林）平板中進行數字標記培養。培養1周后，取適量培養液涂布到含有鏈霉素和氨芐西林的固體培養基中，室溫培養1周后，取單克隆涂布到新鮮的固體培養基中，重復純化 2～3 次。

1.2.2 菌株鑒定 采用PCR法擴增18S rDNA序列的方法進行菌種鑒定。總基因組的提取采用酵母基因組DNA 提取試劑盒（Solarbio，北京）。18S rDNA基因的 PCR （Polymerase chain reaction）擴增使用的特異性引物為：18SF，5-AACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3；18SR，5-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT -3。PCR反應用20 μL 反應體系，其中菌液加2 μL，引物含量分別為1 μL，2*Mix 10 μL，ddH2O 6 μL。擴增條件：95 ℃ 4 min； 94 ℃45 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30 個循環；72 ℃10 min。PCR 產物跑瓊脂糖凝膠電泳后，切膠分離純化。挑取陽性克隆送到百邁克生物科技有限公司（北京）進行測序。

將測序得到的18S rDNA序列在GenBank中進行比對，確定該酵母菌的分子學分類。

1.2.3 富油酵母菌的形態及生活史觀察 觀察富油酵母菌的生活形態時，直接取30 μL富油酵母菌培養液，用95%乙醇稀釋的美藍溶液79 μL染色5 min。染色完成后，取一滴滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，風干后在 Olympus顯微鏡下觀察，目鏡10×，物鏡 40×。觀察時可先找到單個的酵母菌。油鏡（100×）下可清晰觀察到菌體形態。

定期取不同培養時期（6，12，24，36，48，60，

72，84，96 h）的酵母菌培養液在顯微鏡下觀察酵母菌生長變化及其生活史的一般過程。

1.2.4 尼羅紅（Nile Red）熒光染色 尼羅紅是一類苯吩啞嗪酮類化合物，能夠與脂類物質結合并在≤570 nm 波長的激發光下發出熒光，快速地將類脂類物質與其它儲藏物分離開來。尼羅紅是一類脂溶性染料，難溶于水，需要借助丙酮、乙醇等有機溶劑，故尼羅紅染色液配制成 0.01% （質量體積比）丙酮溶液。

取100 μL不同生長時間的酵母菌培養液于96孔板中，加入10 μL尼羅紅染色液于暗處染色20 min，然后用藍光激發，在暗場下觀察，以發出紅色熒光為陽性。

1.2.5 細胞油脂的提取與脂肪酸甲酯的制備 收集200 mL處于平臺期的菌體培養液，6 000 r·min-1離心10 min收集菌體，冷凍干燥后用于油脂提取。菌體油脂的提取與轉酯化采用一步法[6]：稱取200 mg冷凍干燥后的菌體，加入2 mL 4%硫酸甲醇溶液，振蕩混勻20 s，在80 ℃水浴1 h。待溶液冷卻至室溫后，加入水和正己烷各1 mL，混勻后離心，脂肪酸甲酯即溶于上層正己烷中。取上層有機相用于氣相色譜分析。

1.2.6 油脂成分分析 取0.5 mL過濾后的脂肪酸甲酯，置于氣相色譜樣品管中，采用氣相色譜-質譜聯合分析儀（氣相色譜儀為Trace1300，質譜儀為Trace ISQ，Thermo Fisher，USA）進行分析。色譜柱為DB-5 ms毛細管柱（35 m× 250 μm×0.25 μm），掃描荷質比范圍為40～500。載氣為He，流速1 mL·min-1，進樣量1 μL；進樣口溫度280 ℃，檢測器溫度 290 ℃，升溫程序：70 ℃保持2 min，接著以10 ℃·min-1升溫至 220 ℃，再以3 ℃·min-1升溫至 260 ℃，然后以10 ℃·min-1升溫到280 ℃，保持5 min。以37 種混合脂肪酸甲酯標準品（NU-CHEKPREP，INC.， USA）為參照。通過對比標準樣品并計算峰面積來確定各組分的含量。

2 結果與分析

2.1 富油酵母菌的形態特征及分子生物學鑒定

顯微鏡下可清晰地觀察到單個酵母菌，菌體的大小一般在2～10 μm 之間，菌體形態多呈橢圓形（圖1）。年輕的菌體其長軸一般在5 μm 左右，成熟的菌體長軸可達10 μm，且菌體形態被拉長，細胞核被擠向細胞邊緣，可清晰地看到成熟的大液泡。在固體培養基上，單克隆為乳白色圓球，直徑約為1～5 mm，邊緣清晰，表面光滑濕潤。

該酵母菌主要以出芽的形式繁殖，成熟細胞表面生出一個小芽孢，然后逐漸變大，至與母體大小相近時，兩細胞壁分離，成為完整的兩個細胞，此為第一種方式。也可能在母體細胞核內部先進行有絲分裂，隨著染色體被拉向細胞兩極，細胞膜、細胞壁發生縊縮，后分裂為兩個子細胞，此為第二種二分裂的方式。這兩種方式都是酵母菌比較常見的繁殖方式。在營養條件較豐富的培養基中，酵母菌主要以出芽生殖為主，而在后期產物積累的過程中，會出現部分二分裂生殖。二分裂生殖中，細胞壁縊縮發生在一瞬間，顯微鏡下很難捕捉到。在此次觀察中，還觀察到了少許呈兩端出芽生殖的細胞。

對18S rDNA序列測序后比對，該序列跟Cyberlindnerasaturnusstrain SBPN 27（GenBank No.：KY419100.1）的序列具有99%的相似度，根據微生物分類方法，將其歸類為Cyberlindnerasaturnus sp.，命名為SXAU-D12。

2.2 尼羅紅染色法檢測破囊壺菌生長過程中的油脂積累情況

使用尼羅紅熒光染色的方法對酵母菌生長過程中油脂積累情況進行定性檢測，所得結果見圖2。接種后12 h，酵母菌仍處于對數生長期，細胞以分裂生長為主，油脂的積累量較少。尼羅紅染色顯示熒光較弱，細胞內的油脂粒呈現微弱的黃色熒光，數量較少，細胞壁呈現紅色熒光，邊緣較厚且清晰可見。24 h后，細胞開始逐漸進入平臺期，細胞開始積累油脂，尼羅紅染色可見細胞內油脂粒的數量明顯增多，細胞內黃色熒光強度增加，細胞壁的紅色熒光減弱。第2天細胞中油脂粒的熒光強度繼續增強，至第3天，細胞中的油脂積累量達到最大，整個細胞都呈現亮黃色，細胞內不可見單個的脂肪粒，不可見明顯的細胞壁。

2.3 脂肪酸含量與成分分析

本試驗篩選得到的酵母菌脂肪酸含量占細胞干質量的55%以上。GC-MS結果顯示（圖3），脂肪酸成分主要包括C15∶0（棕櫚酸）、C16∶0（硬脂酸）和C17∶0，三者占到總油脂含量的90.5%。

3 結論與討論

本試驗從紅樹林根際土壤和海水中篩選得到的富油酵母菌，具有生長繁殖快，易于研究的特性。在低氮培養基中培養96 h左右，其脂肪酸堆積量大，可達干菌體質量的55%。脂肪酸主要為15碳、16碳和17碳的飽和脂肪酸，非常適合于生產生物柴油。在后續試驗中，擬通過優化培養條件，并對該菌株進行遺傳改造，以進一步提高脂肪酸產量，實現脂肪酸的大量生產，為其在工業上大規模應用奠定理論基礎。

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