鐵皮石斛灰霉病病原學初步研究

王連平，方 麗，謝昀華，王漢榮

(浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

鐵皮石斛灰霉病病原學初步研究

王連平，方 麗，謝昀華，王漢榮*

(浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

2013—2014年，從浙江樂清、新昌、建德、富陽、龍游等石斛產區采集感染灰霉病的鐵皮石斛病葉，從中分離純化出真菌分離物，對分離物的培養性狀和繁殖體特征進行觀測。取10株分離物進行離體和盆栽致病性試驗，從盆栽致病植株上采集病葉，分離并觀測分離物。結果顯示，從產區采集的鐵皮石斛病葉上分離到的真菌分離物是灰葡萄孢霉(BotrytiscinereaPers.ex Fr.)，10株分離物均對離體和盆栽石斛葉片致病，從盆栽致病植株上采集的病葉能分離出與原接種分離物相同的真菌。根據科赫氏法則，石斛灰霉病的病原是灰葡萄孢霉，是一種石斛新病害。

鐵皮石斛； 灰霉病； 病原

鐵皮石斛(DeudrobiumofficinaleKimura et Migo)是一種名貴的蘭科中藥材。現在鐵皮石斛野生資源極少，主要以人工栽培為主，特別是工廠化設施栽培，主要來源地有浙江、云南、安徽、貴州、江西等。據報道，石斛主要病害有炭疽病、黑斑病、軟腐病、自絹病、莖基腐病等[1-5]。近年來，灰霉病在浙江省主要石斛產區頻繁發生，一般葉發病率25%，有時可高達90%，是一種危害人工栽培石斛的重要病害。為明確該病的發病規律，進而提出該病的防治方法，本文對該病害進行了較系統的病原學研究，現將初步研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 病害標樣采集

石斛灰霉病病樣采集于浙江樂清、新昌、建德、富陽、龍游等地；采樣后將標樣稍作陰干，置于信封中帶回實驗室分離。

1.2 病原菌的分離純化

用PDA培養基進行常規組織分離，于25 ℃培養純化獲得菌株。人工接種后，采集病樣，經相同方法分離獲得菌株[6]。

1.3 病原菌的培養性狀

選取分離物FD13-12，觀測其主要培養性狀。將分離物接種于PDA培養基，25 ℃培養20 d，記錄菌落形態、顏色和子實體產生情況；測量100個分生孢子的大小，重復3次，計算平均值[6]。

1.4 致病性測定

選取FD13-12等10株分離物進行致病性測定。各供試分離物在PDA培養基上培養產生分生孢子，用毛筆刷取孢子并與0.1% CMC-Na水溶液混合均勻制成菌懸液，用0.1% CMC-Na水溶液稀釋菌懸液至其含菌量為106·mL-1，該菌懸液是本試驗用的接種體。

離體接種試驗。摘取外觀健康的石斛中位葉(除去心葉及其下一位葉和末位葉)進行試驗。在直徑90 mm培養皿底墊3層用無菌水浸濕的濾紙，隨機取葉片排放在濾紙上，在每片葉的兩端蓋上濕的脫脂棉，每皿5葉。傷口接種試驗處理在葉片中央用針頭穿刺1個小孔。在每張葉片中央滴加20 μL接種體菌懸液，每個分離物無傷口和有傷口接種試驗均涂6個培養皿共30片葉；對照用清水涂布葉片。將接種處理培養皿置28 ℃、5 000 lx光照生化培養箱內，觀察并記錄發病情況。

盆栽接種試驗。取健康中位葉用印泥標記作接種葉，用毛筆將接種體菌懸液均勻涂布在接種葉上，每個分離物無傷口和有傷口接種試驗均涂100個葉片；對照用清水涂布葉片。接種處理的植株在濕布圍成的保濕棚中保濕48 h后移去保濕棚，7 d后觀察記錄發病情況。每個病原分離物接種處理均采3片病葉，采用1.2節方法分離病原物，采用1.3節方法對新分離物與原分離物進行性狀對比。

2 結果與分析

2.1 癥狀

灰霉病主要侵染鐵皮石斛的葉片及嫩莖。葉片染病后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小點，后小點漸漸擴大，有時呈輪紋狀，病斑與綠色葉片的病健交界處常有褐色至深褐色的暈圈；病斑圓形或橢圓形，淡褐色至黑褐色，中間凹陷，最大病斑可達鐵皮石斛葉片的邊緣。深秋、冬季和早春石斛發病后葉片常發黃，或枯死，或脫落。發黃的石斛病葉常常帶有橘紅色，而其上病斑則呈淡褐色至黑褐色，病斑與發黃葉部交界處常常有或深或淺的綠色暈圈；病斑上，尤其是病斑中心常長有灰褐色的霉層，即病原菌的分生孢子。這些發黃的石斛病葉輕輕碰觸，即可脫落。在深秋、冬季和早春田間濕度高時，葉片、嫩梢以及枯黃的葉片有時會出現大量水漬狀的濕腐，并在病斑上產生大量的灰褐色的霉層，即病原菌的分生孢子(圖1)。

左上圖為褐色至深褐色的暈圈；右上圖為或深或淺的綠色暈圈；左下圖為水漬狀的濕腐；右下圖為分生孢子圖1 鐵皮石斛灰霉病為害癥狀

2.2 病原菌的形態及培養性狀

培養基上菌落圓形、白色，營養菌絲半透明、稀疏，氣生菌絲較少。培養4 d后菌落直徑達到45 mm，培養11 d左右中間部位呈現灰色，后期出現黑色不規則菌核。

該菌較易產生分生孢子，其產孢量較大。分生孢子單胞，圓形或橢圓形，無色至淡灰褐色，大小7.5～10.8 μm ×4.8～9.6 μm，成簇聚生于分生孢子梗末端的膨大部。分生孢子梗叢生，直立或稍彎曲，大小192.5～387.6 μm×9.7～13.4 μm，淡褐色有隔膜。經鑒定，該真菌屬半知菌亞門叢梗孢目叢梗孢科葡萄孢屬灰葡萄孢霉(BotrytiscinereaPers.ex Fr.)。

2.3 致病性

從2013—2014年采自溫州樂清、紹興新昌、杭州建德、杭州富陽、衢州龍游等病樣分離物中，選取10株分離物進行離體試驗和盆栽試驗測定其致病性。離體接種試驗結果顯示，10株供試分離物均對石斛葉片致病，無傷口接種的葉發病率86.7%～96.7%，有傷口接種的葉發病率90.0%～100%。采集自不同地區的分離物致病性有一定差異(表1)。

表1 浙江各石斛產區灰葡萄孢霉分離物 致病力測定(離體試驗)

盆栽接種試驗結果顯示，10株供試分離物均對石斛葉片致病，無傷口接種的葉發病率80%～91%，有傷口接種的葉發病率84%～100%，有傷口接種的葉發病率高于無傷口接種，采集自不同地區的分離物致病性有一定差異(表2)。每個分離物接種處理均采3片病葉，從中均能分離到灰葡萄孢霉。該灰葡萄孢霉分離物與原用于接種的灰葡萄孢霉分離物在PDA培養基上的培養性狀和繁殖體形態特征相同，說明2種分離物是同一分離物。

3 小結與討論

3.1 石斛灰霉病的分離物鑒定

根據對石斛灰霉病分離物的培養性狀和形態特征觀測，參照魏景超等[7-9]的描述，石斛灰霉病的分離物被鑒定為灰葡萄孢霉，屬半知菌亞門、叢梗孢目、叢梗孢科、葡萄孢屬。

表2 浙江各石斛產區灰葡萄孢霉分離物 致病力測定(盆栽試驗)

3.2 石斛灰霉病的病原確定

從石斛灰霉病病樣中分離到灰葡萄孢霉，用該分離物成功誘發出灰霉病，從誘發出灰霉病的病樣中分離到與原分離物形態特征一致的灰葡萄孢霉。根據柯赫氏法則，石斛灰霉病的病原為灰葡萄孢霉。據報道，該病原的寄主范圍極為廣泛，幾乎可以寄生所有的雙子葉植物[8-9]，但在鐵皮石斛上尚未見明確的報道。

3.3 石斛灰霉病發生原因探討

石斛需要溫暖潮濕、散射光等生長條件，而這些條件也是多數病害發生的適宜條件，在自然狀態下，由于植株密度小，灰霉病發生相對較少、較輕；但在人工栽培條件下，灰霉病則多發、重發。人工栽培石斛灰霉病多發、重發的原因可能有以下3個方面：1)人工栽培石斛密度遠高于自然狀態；2)人工栽培相對密閉的環境及增濕等栽培措施有利于形成灰霉病發生所需的高濕和結露的條件；3)人工栽培所采用的增肥等促進石斛快速生長的栽培措施很可能降低植株對灰霉病的抗病性。

[1] 張敬澤, 鄭小軍. 鐵皮石斛黑斑病病原菌的鑒定和侵染過程的細胞學研究[J]. 植物病理學報, 2004, 34(1): 92-94.

[2] 李靜, 張敬澤, 吳曉鵬, 等. 鐵皮石斛疫病及其病原菌[J]. 菌物學報, 2008, 27(2): 171-176.

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[4] 李向東, 王云強, 王卉, 等. 金釵石斛和鐵皮石斛軟腐病原菌的分離和鑒定[J]. 中國藥學雜志, 2011 (4): 249-252.

[5] 李戈, 李榮英, 高微微. 藥用石斛規模化種植中的病害問題及防治策略[J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(4): 485-488.

[6] 張翊, 桑維鈞, 梁郡驛. 金釵石斛炭疽病病原鑒定及殺菌劑毒力測定[J]. 湖北農業科學, 2014, 53(14): 3307-3309.

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[7] 魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海: 上海科學技術出版社, 1979.

[8] 張中義. 中國真菌志: 第二十六卷 葡萄孢屬柱隔孢屬[M]. 北京: 科學出版社, 2006.

[9] 何永宏. 我國灰葡萄孢的新寄主植物[J]. 云南農業大學學報:自然科學, 2002.

(責任編輯：侯春曉)

2017-04-24

樂清院士工作站和院地合作項目(wz20130006)；浙江省特色農產品全產業鏈安全風險管控項目(201303088)

王連平(1965—)，男，副研究員，從事植保技術研究工作，E-mail:wlp8843@163.com。

王漢榮，E-mail: wanghrg@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170626

S567.23+9

A

0528-9017(2017)06-0990-03

文獻著錄格式：王連平，方麗，謝昀華，等. 鐵皮石斛灰霉病病原學初步研究[J].浙江農業科學，2017，58(6)：990-992.