藍莓酒降酸酵母篩選鑒定及能力測定

李 迪，李靜媛

(青島農業大學食品科學與工程學院，山東青島266109)

藍莓酒降酸酵母篩選鑒定及能力測定

李 迪，李靜媛

(青島農業大學食品科學與工程學院，山東青島266109)

藍莓酒酸含量過高會導致酒體不協調，以藍莓果皮表面獲取的菌種作為出發菌株，經過自然篩選和紫外誘變篩選，以降酸量為依據選出降酸效果顯著的菌株，并對菌株進行鑒定。結果表明，篩選出的菌株降酸量為5.2 g/L。利用WL營養瓊脂培養基和分子生物學的方法，最終確定篩選菌株為釀酒酵母。該菌株能最大限度的將糖轉化為酒精，轉化率達91%，最終殘糖為3.4 g、酒精度為7.2%vol，同時對糖、酒精也有良好的耐受性。篩選出的釀酒酵母實現了在發酵的同時進行降酸，這對于藍莓酒業的發展來說提供了良好的酵母資源，也為微生物釀造提供了一個良好的發展方向。

微生物； 藍莓酒； 降酸酵母； 篩選

藍莓酒是以藍莓漿果為原料，經自然發酵釀制而成的低度營養保健酒[1]。藍莓酒較好地保留了漿果中天然花色苷、果膠質、維生素等營養成分[2]，具有延緩衰老、保護視力、增強人體免疫力等功能。但因酒中有機酸含量過高，酒體過于酸澀，口味粗糙，酒體不協調，破壞了酒的口感和品質，所以必須對藍莓酒進行嚴格的降酸處理。目前藍莓酒降酸的主要方法有3種，即化學降酸法[3]、物理降酸法、微生物降酸法[4]。物理、化學降酸需耗費大量能源輔料，對酒負面影響較大且降酸具有選擇性。與之相比，微生物降酸具有明顯優勢，降酸的同時，增加酒的穩定性，提升酒風味復雜性和口感[3]。

微生物降酸的一種途徑是利用乳酸菌在蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）中將蘋果酸降解為乳酸，迄今為止，國外生產的優質紅葡萄酒甚至一些佐餐紅葡萄酒大部分都采用MLF降酸，但這個過程一般發生在酒精發酵之后，耗時長且不易控制[5]；另一種途徑是利用酵母進行降酸，較典型的有利用粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）在蘋果酸-酒精發酵(Malo-alcoholic Fermentation,MAF)中將蘋果酸分解為乙醇和CO2，從而降低酒的酸度[6-9]，該方法能較好保持酒的清爽感與口感[10]，實現發酵的同時降酸。但裂殖酵母發酵能力較弱，會產生不良氣味。

利用酵母進行果酒降酸是一個較新的研究方向，目前，篩選應用于藍莓酒降酸的酵母研究較少。本研究擬以藍莓果皮表面的菌種為出發菌株，經自然篩選和紫外誘變篩選出降酸及發酵能力強的酵母并對其發酵特性進行探索，以應用到藍莓酒發酵中，以期實現在發酵同時進行降酸處理。試驗所篩出的菌種可以作為新菌種進行生產，在一定程度上豐富了果酒生物降酸的內涵，為提高藍莓酒的口感品質奠定了基礎，具有廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓：市售；藍莓的糖含量是138 g/L，酸含量是9.146 mg/g。

商業酵母(Saccharomyces cerevisiae）AWRI R2：拉曼公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose YPDfgreg)培養基：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、瓊脂粉2%。

模擬藍莓汁培養基：葡萄糖13%、磷酸二氫鉀0.5%、硫酸銨0.2%、七水硫酸鎂0.04%、酵母膏0.1%、草酸0.197 g/L、酒石酸0.333 g/L、蘋果酸1.170 g/L、檸檬酸7.446 g/L。

WL瓊脂培養基：酵母膏0.4%、胰蛋白胨0.5%、葡萄糖5%、磷酸二氫鉀0.055%、氯化鉀0.0425%、氯化鈣0.0125%、硫酸鎂0.0125%、氯化鐵0.00025%、硫酸錳0.00025%、瓊脂2%、溴甲酚綠0.0022%。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-50S11立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅醫療器械有限公司；KDM電子調溫電熱套（1000 mL），山東華魯電熱儀器有限公司；H13221臺式酸度測定儀，北京慧龍環科環境儀器有有限公司；SPX-250BS-II生化培養箱，寧波東南儀器有限公司；HYQ-180s搖床，武漢匯誠生物科技有限公司；BSC-1100ⅡA2生物安全柜，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；酒精計，陸恒生物科技有限公司；電子天平，美國Ohaus公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌液制備

稱取2 g藍莓樣品于2個250 mL三角瓶中，加幾粒玻璃珠，并加入100 mL無菌生理鹽水，室溫下以100 r/min搖床振蕩20 min后，取出靜置20 min。量取上清液5 mL，加入到100 mL YPD液體培養基中，以25℃、100 r/min搖床振蕩培養24 h。以同樣的條件再轉接培養1次，獲得菌液。

1.3.2 菌種分離

將菌液按照 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋。將稀釋菌液均勻涂布于YPD固體培養基上，25℃恒溫培養3～4 d，獲得單菌落。

1.3.3 菌種的自然篩選

將分離所得的100株單菌落分別接種到100 mL模擬藍莓汁培養基中，于25℃、100 r/min搖床中培養4 d。用濃度為0.5 mol/L的氫氧化鈉標準溶液滴定菌液，據降酸量初步獲得2株降酸能力較好的菌株，斜面4℃保存。

1.3.4 菌種的紫外誘變

（1）分別取初篩所得2株菌轉入YPD培養基，進行菌種活化。分別吸取酵母菌懸液5 mL于平板上，打開20 W紫外燈，距離20 cm，分別照射0 min、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min。

（2）將誘變后的菌液加入到2倍體積的新鮮YPD培養基中，避光放置在28℃培養箱中，2 h后取出。

（3）將未照射的對照菌液和經紫外燈照射的菌液稀釋涂布在YPD固體培養基上，并用黑布包裹，28℃恒溫培養48 h。

（4）挑取長出的40個菌落轉接到YPD液體培養基中24 h，進行菌種活化。

（5）按1%接種量將活化的酵母菌液接種到模擬藍莓汁培養基中，以28℃、100 r/min搖床培養4 d后，用濃度為0.5 mol/L的氫氧化鈉標準溶液滴定酵母菌液和空白培養基，選出1株降酸量最大的菌株，斜面4℃保存。

1.3.5 菌種鑒定

將獲得的酵母菌株，在YPD培養基活化后涂布到WL營養培養基上，28℃培養5 d后觀察，根據菌落顏色及形態與藍莓酒相關酵母類別鑒別表（表1）進行對比，初步確定菌種種類[11]。

挑取篩選菌株中具有典型形態的菌株，送中科院微生物研究所進行分子生物學鑒定。

1.3.6 篩選菌株發酵性能分析

（1）發酵速率測定：將分篩選出的菌株以及1株商業酵母分別活化接入到模擬藍莓汁培養基中，每間隔24 h稱1次培養瓶的重量，發酵溫度為25℃，每次與前一次的差值即為CO2的質量損失[12]。

（2）OD600nm值的測定：將篩選得到的菌株以及1株商業酵母分別活化接種到模擬藍莓汁培養基中，每隔2 h進行取樣，測其OD600nm，至穩定末期，繪制曲線。

（3）酵母發酵產物的測定：發酵結束后，對發酵液的殘糖和酒精含量進行測定，判斷該菌株對糖的轉化能力及轉化效率。

1.3.7 篩選菌株耐受性分析

（1）酒精耐受性：將模擬藍莓汁培養基的酒精度調整為12%vol，接入已活化的酵母菌，在28℃下靜置培養，每隔3 h測其OD600nm，記錄數據，繪制生長曲線。

（2）糖耐受性的測定：將模擬藍莓汁培養基的糖濃度調整為20%，接入已活化的酵母菌，接種量為1×106cfu/mL，在28℃條件下靜置培養，每隔3 h振蕩測OD600nm，記錄數據，繪制生長曲線。

1.3.8 指標的測定

（1）總酸滴定

參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》。

（2）酒精度測量

參考GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度（酒精度）的測定》。

（3）降酸能力測定

以降酸量衡量降酸能力，公式如下：

式中：X—樣品的降酸量，g/L；C—氫氧化鈉標準溶液的物質的量濃度，mol/L；V0—空白培養基消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；V1—樣品滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；V2—吸取樣品的體積，mL；S1—0.075。

2 結果與分析

2.1 菌種的篩選

挑取100株分離獲得的菌株進行降酸量計算，得到的降酸范圍在0.2～3.7 g/L之間，選取降酸效果明顯的20株繪制出圖1，由圖1可看出，菌種9號和13號的降酸量分別為3.7 g/L、3.4 g/L，降酸效果最好，因此選取菌種9號及13號進行紫外誘變。

挑取40株紫外誘變后分離獲得的菌株進行降酸量計算，得到的降酸范圍在3.8～5.2 g/L，選出10株降酸好的菌，繪制降酸量見圖2。從圖2可以看出，誘變后的菌株之間降酸效果差別不大，但相比自然篩出的菌株降酸能力顯著提高。選6號為最終的菌株，進行菌種鑒定。

表1 WL營養培養基對藍莓酒相關酵母的鑒別

圖1 酵母菌降酸量

圖2 酵母菌降酸量

2.2 菌種鑒定

篩選出的6號酵母菌在WL營養培養基上生長的菌落顏色為奶油色至綠色，表面為球形突起，光滑，不透明，奶油狀的菌株，菌株形態見圖3，與表1對比，初步確定為釀酒酵母。

圖3 篩選菌株在培養基上的菌落形態

對分離菌株的rDNA ITS區進行克隆和測序，堿基序列如下：

TTTCCGTAGGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT AAAGAAATTTAATAATTTTGAAAATGGATTTTT TTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACT GGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGC CGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAG GCCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACG GTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAA TTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAG TTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATT CGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACAC AAACAATTTTATCTATTCATTAAATTTTTGTCAA AAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAA ATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGT TCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG ATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATC ATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGG TATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATT TCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGA TACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCT TTTCATTGGATGTTTTTTTTTCCAAAGAGAGGT TTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACG GTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCT TTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATA AGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCA

與Saccharomyces cerevisiea模式菌株S288C的rDNA ITS區序列(GenBank accession number:Z73329)進行對照和比較，分析結果顯示，分離菌株ITS區堿基序列與Saccharomyces cerevisiea模式菌株的相應堿基序列相似率為99.5%，分離的酵母菌株可確定為釀酒酵母。

2.3 酵母發酵性能測定

2.3.1 酵母發酵速率測定

比較篩選酵母與商業酵母的發酵性能，結果見圖4。由圖4可以看出，篩選酵母的CO2產生速率及產生量與商業酵母相比，基本一致，具有良好的發酵性能。

圖4 不同酵母菌發酵速率的比較

2.3.2 OD600nm值的測定

將篩選所得的酵母和商業酵母進行生長特性的比較，結果見圖5。由圖5可看出，篩選酵母和商業酵母比較，生長曲線相似，篩選酵母的遲滯期與商業酵母相比沒有明顯的區別，對數期生長較快，細胞分裂快，具備良好的發酵生長特性。

圖5 酵母生長性能比較分析

2.3.3 酵母發酵產物測定

發酵結束后，對發酵液中的殘糖含量及乙醇含量進行測量，測得發酵液的殘糖量為3.4 g＜4.0 g，說明菌能夠充分利用培養基的糖，有良好發酵糖的能力。酒精度為7.2%vol，達到期望的酒精度數，說明該菌具有較高的轉化率。

2.4 酵母耐受性評定

2.4.1 酒精耐受性

酒精對細胞的抑制作用比較復雜，重點體現在它能夠抑制酵母菌的存活、增殖速度和發酵力3個方面。本實驗比較了篩選酵母和商業酵母在外加酒精培養基中生長的差異來考察酵母菌的酒精耐受性，生長曲線見圖6。由圖6可知，篩選酵母和商業酵母相似，在酒精度為12%vol時生長情況正常，說明篩選出的酵母具有良好的酒精耐受性。

圖6 初始酒精度12%vol YPD培養基中的生長曲線

2.4.2 糖耐受性的測定

在葡萄酒工業中，糖是酒精發酵的基質，也是酵母賴以生存的能源物質，含糖量為20%及以上時，酵母菌的生長發酵就會受到抑制，結果見圖7。由圖7可看出，在葡萄糖濃度為20%的培養基中篩選酵母的生長曲線與商業酵母相似，說明篩選的酵母菌具有良好的糖耐受性。

圖7 初始糖濃度為20%YPD培養基中酵母生長曲線

3 結果與討論

本研究通過自然篩選和紫外誘變從藍莓果皮上篩出的酵母降酸效果良好，降酸量達5.2 g/L，同時對糖的發酵及酒精的轉化率也較高，酒精轉化率達91%。與常規的蘋果酸-乳酸發酵相比，在不影響基本工藝的要求下，一定程度上彌補了耗時長及不易控制等缺點，實現了發酵的同時降酸，簡化了工藝，具有較大優勢。

本研究采用紫外誘變的方式篩出降酸顯著的菌株，這可能是由于紫外處理造成釀酒酵母的基因突變，從而實現降酸能力的提高。縱觀近幾年眾多學者、專家的研究，其改造手段主要是利用基因工程技術和原生質體融合技術對降酸酵母進行基因改造。人們設想，把乳酸菌中的MLF基因通過遺傳轉化導入葡萄酒酵母中，使葡萄酒酵母在酒精發酵的同時，賦予其MLF降酸的功能[13]。目前，已對MLF基因及其調節基因進行了定位和序列分析，轉基因方法已用于葡萄酒酵母工程菌的育種[14]。但對于進行基因改造的酵母，仍面臨著許多問題，如基因是否表達以及是否完全表達及其安全性、菌株的遺傳穩定性等問題[15]，這對于之后的研究及大規模工業化生產來說，仍需要更深入的研究和探索。

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Screening of an Acid-Reducing Yeast Strain for Blueberry Wine Production and Determination of Its Properties

LI Di and LI Jingyuan
(College of Food Science and Engineering,Qingdao Agricultural University,Qingdao,Shandong 266109,China)

Excessive acid in blueberry wine will damage the harmony of wine body.In this study,yeast strains obtained from the skin of blueberry were used as the starting strains.After natural selection and UV mutagenesis screening,a yeast strain with good performance in deacidification was selected,and the strain was identified.The results showed that,the deacidification amount of the strain was 5.2 g/L.The strain was identified as S.cerevisiae based on WL culture medium and molecular biology.Such strain could convert sugar into alcohol thoroughly and the conversion rate reached up to 91%.After the fermentation,the residual sugar content was 3.4 g and the content of alcohol was 7.2%vol.Besides,the strain had good tolerance for high sugar and high alcohol.The screened strain could achieve fermentation and deacidification simultaneously and it was a good choice for the production of blueberry wine.

microbe;blueberry wine;acid-reducing yeast;screening

TS262.7；TS261.4；TS261.1

A

1001-9286（2017）07-0046-06

10.13746/j.njkj2017082

國家自然基金青年基金（31501458）；青島農業大學高層次人才科研基金（6631113350）。

2017-04-07；

2017-06-21

李迪（1995-），女，本科，研究方向為葡萄酒釀造；E-mail：lidi17854266337@163.com。

李靜媛（1985-），女，博士研究生，講師，研究方向為葡萄酒釀造；E-mail：jyli@qau.edu.cn。

優先數字出版時間：2017-05-04；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170504.0841.001.html。