生物轉化γ-氨基丁酸釀酒酵母的篩選及其在桑葚酒釀造中的應用

曾林，譚霄，張慶*，楊穎，唐潔

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川省食品生物技術重點實驗室，四川 成都，610039)2(西華大學 古法發(fā)酵(釀造)生物技術研究所，四川 成都，610039)3(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南，250101)

生物轉化γ-氨基丁酸釀酒酵母的篩選及其在桑葚酒釀造中的應用

曾林1,2，譚霄1，張慶1,2*，楊穎3，唐潔1

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川省食品生物技術重點實驗室，四川 成都，610039)2(西華大學 古法發(fā)酵(釀造)生物技術研究所，四川 成都，610039)3(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南，250101)

為獲得產γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric，GABA)并釀造桑葚酒性能良好的酵母菌，采用紙色譜定性分析從四川泡菜中分離篩選出3株產GABA酵母菌，經生理生化和18S rRNA測序分析，菌株JM009和JM037被鑒定為釀酒酵母(S.cerevisiae)，菌株JM024被鑒定為C.tanzawaensis。通過高效液相色譜對酵母菌GABA表達能力評估發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母 JM037發(fā)酵產GABA的能力較強，達670 mg/L。進一步對其進行耐受性和桑葚發(fā)酵性能分析，結果表明，釀酒酵母JM037對酒精、SO2、葡萄糖和pH的綜合耐受性良好，并在發(fā)酵桑葚果汁后，乙醇產量在168 h達到38.36 g/L，殘?zhí)琴|量濃度在216 h降至3.06 g/L，GABA質量濃度在144 h提高到1 145 mg/L，以安琪酵母為參考，乙醇產量和殘?zhí)琴|量濃度差異不大，但釀酒酵母JM037具有獨特的產GABA能力。因此，釀酒酵母 JM037具有釀制富含GABA桑葚酒的潛力。

γ-氨基丁酸；釀酒酵母；耐受性；篩選；鑒定；桑葚酒

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric，簡稱GABA)是由谷氨酸脫羧生成的一種非蛋白質類氨基酸，廣泛存在于微生物、植物和動物中[1]。在脊椎動物中，GABA以一種重要的抑制性神經遞質存在于中樞神經系統(tǒng)中[2-3]，具有降低血壓、利尿、增強記憶等多種生理功能[4-5]。隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強，富含GABA 的功能性食品已經成為研究和開發(fā)的熱點。

神經生理及神經醫(yī)學的研究表明，在人腦中，GABA是一種重要的活性物質，可由腦部的谷氨酸在谷氨酸脫羧酶(GAD)作用下轉化而成，但隨著年齡的增長和精神壓力的加大，GABA的轉化和積累比較困難，而通過日常飲食補充可有效改善這種狀況[6]。1994年，TAKAYO等[7]在研究水浸泡處理米胚芽的氨基酸分布時，發(fā)現(xiàn)經過發(fā)酵處理的米胚芽中，GABA含量積累到200～300 mg/kg。最近，日本科學家已利用米胚芽等原料開發(fā)制造的富含GABA的功能食品配料，廣泛地應用于飲料、果醬、調味料等制品中[8]。此外，還有報道采用微生物發(fā)酵法開發(fā)高濃度GABA飲料，以及利用乳酸菌等制作的富含GABA功能食品，可以直接作為抗高血壓，改善腦機能及肝功能的功能食品。KIM等[8]利用短乳桿菌發(fā)酵制備富含GABA黑樹莓果汁，GABA含量為505 mg/kg；NEJATI等[9]利用植物乳桿菌發(fā)酵制備富含GABA酸奶，GABA含量為77.4 mg/kg；在我國，有關GABA食品的研究報道較少，吳岱熹等[10]利用米曲霉和大米為原料制備富含GABA清酒，GABA含量為439 mg/L。但是對于產GABA酵母菌篩選，并應用于桑葚酒的釀造，制備富含GABA桑葚酒尚未報道。

本研究利用紙色譜定性分析篩選產GABA酵母菌，并對其進行生理生化試驗和分子鑒定，再通過HPLC對酵母菌發(fā)酵產GABA的能力進行評估，進一步對高產GABA酵母菌進行耐受性和桑葚酒初步發(fā)酵性能分析。這不僅拓寬了產GABA菌株資源，而且為后續(xù)開發(fā)富含GABA桑葚酒提供有效數(shù)據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泡菜液,取于四川新繁食品有限公司；PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g)、YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖 20 g，蛋白胨 20 g，酵母膏10 g)、酵母合成培養(yǎng)基(葡萄糖20 g，酵母提取物5 g，蛋白胨l0 g),pH均調節(jié)至pH6.0；GABA(含量≥99%),上海金穗生物科技有限公司；L-谷氨酸鈉(L-MSG，含量≥98.5%),成都市科龍化工試劑廠；DH5α感受態(tài)細胞,TaKaRa Biotechnology(Dalian)；pGEM-T載體,天根生化科技有限公司；安琪釀酒酵母,安琪酵母股份有限公司。

Allegra X-15R冷凍離心機,貝克曼庫爾特公司；720BR/01492電泳凝膠成像分析系統(tǒng)，Biometra T1 PCR儀,BIO-RAD公司；BHC-1300ⅡA2生物安全柜,蘇州安泰空氣技術有限公司；Waters2695液相色譜儀(配有Waters2998紫外檢測器),美國Waters公司。

1.2 酵母菌株的分離

取泡菜汁或各種發(fā)酵蔬菜樣品25 g，加入225 mL無菌生理鹽水的均質袋中，用拍擊式均質器Bagmixer均質5 min。取適量均質液用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋后涂布于酵母合成培養(yǎng)基進行分離，28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落劃線純化3次。

1.3 產GABA酵母菌菌株的初篩

酵母菌菌株接種到PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h作為發(fā)酵種子，按4%的接種量接入50 mL YEPD(含1%L-MSG)的250 mL三角瓶中，28 ℃、120 r/min發(fā)酵72 h。發(fā)酵液于8 000 r/min條件下離心5 min，取上清液，備用。

采用紙色譜定性分析法初篩產GABA酵母菌。展開劑組分：V(正丁醇)∶V(冰乙酸)∶V(水)=5∶3∶2，再添加1.2%茚三酮。以L-MSG標品溶液(5 g/L)和GABA標品溶液(5 g/L)為對照，吸取2 μL發(fā)酵液，在濾紙上逐個點樣，并編號。再將濾紙在30 ℃恒溫展開，展開后將濾紙放進70 ℃烘箱中顯色10 min[11]。

1.4 生化特征分析

按照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[12]中的鑒定方法進行。

1.5 生化特征分析

根據李可[13]等的方法提取真菌DNA。18S rRNA擴增引物：18S-F(5’-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’) 和18S-R(5’-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3’)。擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸55 s，36循環(huán)后72 ℃保持10 min。

擴增產物連接到pGEM-T 載體后克隆入感受態(tài)細胞E.coliDH5α中，提取重組質粒對18S rRNA測序。所得序列提交至NCBI進行Blast比對，利用MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 GABA表達能力評估

利用HPLC對初篩菌株產GABA能力進行復篩。參照張術聰?shù)萚14]的方法對發(fā)酵液中GABA進行柱前衍生。HPLC分析條件：色譜柱為島津-GL INERTSIL ODS-3(4.6 mm×150 mm，5 μm)；紫外檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；流動相A為甲醇，流動相B為醋酸鈉(pH 6.2)∶甲醇∶四氫呋喃(84∶25∶1，V/V/V)；流速1 mL/min；梯度洗脫時，流動相 B比例為：0～6 min，80%～50%；6～9 min，50%～20%；9～10 min，20%～0%；10～11 min，維持0%；11～15 min，返回80%。

1.7 耐受性分析

采用杜氏管發(fā)酵法測定酵母菌對乙醇、SO2、葡萄糖和pH耐受性。在10 mL YEPD 液體培養(yǎng)基的帶杜氏管的試管中，分別加入不同酒精梯度( 6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%和20% vol)、不同SO2質量濃度(100、150、200、250、300、350和400 mg/L)、不同葡萄糖質量分數(shù)(10%、20%、30%、40%、50%、60%和70 %)、不同pH(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5)，并分別接入產GABA酵母菌(接種量為1×108CFU/mL)28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)5 d，以安琪酵母菌為對照，觀察杜氏管中氣泡產生情況[15]。

1.8 發(fā)酵性能分析

以安琪酵母菌為參考，將篩選酵母菌接種到PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h作為發(fā)酵種子，按6%的接種量接種于250 mL pH 3.75的滅菌桑葚汁(含5 g/LL-MSG和100 mg/L SO2)中，用滅菌蔗糖溶液調節(jié)糖度至20 °Brix后，28 ℃靜置培養(yǎng)，當殘?zhí)呛繛?%～9%時，轉移至15 ℃進行低溫陳釀，至殘?zhí)琴|量濃度降至4 g/L以下陳釀結束。每隔12 h取樣，測定不同取樣時間樣品的生物量濃度、乙醇質量濃度、殘?zhí)琴|量濃度和GABA質量濃度。

生物量濃度：采用分光光度法進行檢測，以OD600值和干重之間的關系曲線(1 OD600nm= 0.45 g/L)進行計算[16]。

乙醇質量濃度：采用氣相色譜法，參照謝文等[17]在檢測葡萄酒果酒等低含量酒精度的樣品時采用甲醇稀釋法，色譜條件：初始溫度45 ℃，保持5 min，以3 ℃/min 升溫至60 ℃，保持3 min，以20 ℃/min升溫至200 ℃，保持5 min。色譜柱為Rtx-Wax毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為高純度氦氣，載氣流速1.0 mL/min；進樣口溫度：200 ℃，分流比為1∶20。以正丙醇為內標物，用色譜級甲醇稀釋2倍后注入色譜柱進行分析。

殘?zhí)琴|量濃度：按照GB /T15038—2006的方法進行檢測。

GABA質量濃度：同試驗方法1.6。

2 結果與分析

2.1 產GABA酵母菌的初篩結果

從圖1可以看出，利用紙色譜定性方法從樣品中分離的67 株酵母菌菌株中篩選出3 株產GABA酵母菌，且底物L-MSG消耗明顯。根據茚三酮顯色反應的顏色深度初步判斷，酵母菌JM037發(fā)酵液中GABA含量較高。

a-JM009; b-JM024; c-JM037; d-GABA標準品; e-L-MSG標準品圖1 菌株發(fā)酵液紙色譜圖Fig.1 Chromatography of fermentation broth

2.2 產GABA酵母菌的生理生化及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

對篩選出的3 株產GABA酵母菌進行生理生化試驗，結果見表1。查閱《酵母菌的特征與鑒定手冊》，推測菌株JM009，JM037為酵母屬釀酒酵母(S.cerevisiae)；菌株JM024為C.tanzawaensis。為了更明確顯示各菌株的分類學地位和系統(tǒng)發(fā)育關系，3 株菌株全部進行測序，測得序列經Mallard 1.02檢測后，再通過軟件BioEdit 7.0檢測，無異常序列發(fā)現(xiàn)。選取相似菌株和代表菌株序列，用MEGA5.0軟件以Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果見圖2，JM009和JM037被鑒定為S.cerevisiae；JM024被鑒定為C.tanzawaensis，與生理生化試驗結果相符。

表1 生理生化試驗結果

圖2 基于酵母菌18S rRNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of yeast based on 18S rRNA gene sequence

2.3 GABA表達能力評估

利用HPLC定量分析對酵母菌產GABA能力進行評估。其標準曲線為Y=9E+06X-18007(R2=0.999 2)。因此，可用于酵母菌發(fā)酵液中的GABA進行定量分析。3 株酵母菌GABA高效液相定量結果如圖3所示。酵母菌JM037發(fā)酵產γ-氨基丁酸質量濃度最高，達670 mg/L。李亞莉等[18]從傳統(tǒng)發(fā)酵食品分離出1株假絲酵母，發(fā)酵液GABA質量濃度達700 mg/L；烏云達來等[19]從中國科學院微生物研究所工業(yè)微生物與生物技術研究室保藏菌株中分離出1株釀酒酵母，發(fā)酵液中GABA質量濃度約480 mg/L；因此，可進一步對篩選獲得的2 株釀酒酵母進行耐受性和桑葚酒發(fā)酵性能分析。

圖3 菌株發(fā)酵液中GABA的質量濃度Fig.3 GABA mass concentration in the liquid medium fermented by the isolates

2.4 產GABA酵母菌耐受性

2.4.1 酒精耐受性

從賈春鳳等[20]研究中可以看出，安琪酵母菌對酒精有較好的耐受性。以安琪酵母菌為參考，由表2可知，C.tanzawaensisJM024較敏感，在酒精含量為6%vol時氣體產生較少，而釀酒酵母 JM009和JM037分別在酒精含量為12%vol和14%vol時產生大量氣體，并且釀酒酵母JM009在酒精含量為18%vol時也有氣體產生，說明釀酒酵母 JM009和JM037分別所耐受的最高酒精含量為12%vol和14%vol。高玉妹等[21]研究發(fā)現(xiàn)，酒精含量對酵母的生長有一定的影響，在發(fā)酵初期，低含量的乙醇對釀酒酵母有積極的影響，促進發(fā)酵順利進行，當乙醇含量達到一定量(通常10% vol)時，又會對釀酒酵母產生毒害，延緩發(fā)酵。在果酒的釀制中，酒精含量一般在7%～18% vol，因此，釀酒酵母 JM009和JM037能應用于低度果酒發(fā)酵。

表2 產GABA酵母菌酒精耐受性結果

注: +: 杜氏管內滿1/4管; ++: 滿1/2管; +++; 滿管。

2.4.2 SO2耐受性

果酒在釀制過程中會加入SO2，在抗氧化、殺菌和護色等方面起到關鍵的作用[22]，一般添加量為50～150 mg/L，因此要求酵母菌菌株具有較高SO2耐受性。以安琪酵母菌為參考，由表3可知，釀酒酵母 JM037在SO2質量濃度達到250 mg/L時，有大量氣體產生，釀酒酵母JM009在SO2質量濃度達到300 mg/L時，也有較多的氣體產生，說明釀酒酵母JM009和JM037對SO2耐受性較好。

表3 產GABA酵母菌SO2耐受性結果

注: +: 杜氏管內滿1/4管; ++: 滿1/2管; +++: 滿管。

2.4.3 葡萄糖耐受性

在果酒釀造中，糖是酒精發(fā)酵的基質，也是酵母菌賴以生長的能源物質，但高質量濃度的糖會對酵母菌的生長和代謝產生抑制，同時，高滲透壓會導致酵母細胞水分流失，活性降低[23]。由表4可知，釀酒酵母JM009和JM037均能在葡萄糖質量濃度為300 g/L時產生大量氣體，隨著葡萄糖質量濃度的增加，氣體產量減少，當葡萄糖質量濃度達到600 g/L時無氣泡產生。說明釀酒酵母JM009和JM037能耐受300 g/L葡萄糖，略弱于安琪酵母菌的耐受性。于洋等[22]從釀酒葡萄中篩選的1株季也蒙有孢漢遜酵母YF-28能耐受250 g/L葡萄糖，一般果酒釀造的果汁中糖含量大約在250 g/L左右(按葡萄糖計)。本實驗篩選的釀酒酵母JM009和JM037在果酒的釀造上具有應用潛力。

表4 產GABA酵母菌葡萄糖耐受性結果

注: +: 杜氏管內滿1/4管; ++: 滿1/2管; +++: 滿管。

2.4.4 低pH耐受性

在低pH環(huán)境下，可抑制大部分有害微生物的生長代謝，對低pH耐受性較好的酵母菌菌株應用范圍必定較廣。由表5可知，釀酒酵母JM009和JM037能耐受pH 2.5以上的培養(yǎng)液，與安琪酵母菌相比，對低pH耐受性較差，但能保證大部分果酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵液在pH在3.5左右下生長良好。

表5 產GABA酵母菌pH耐受性結果

注: +: 杜氏管內滿1/4管; ++: 滿1/2管; +++: 滿管。

2.5 釀酒酵母JM037發(fā)酵性能測定

以安琪酵母菌為參考，以菌體生物量、發(fā)酵過程的殘?zhí)?、GABA和乙醇生成量為指標，對釀酒酵母JM037發(fā)酵性能進行初步評估。由圖4-A可以看出，隨著時間的增加，釀酒酵母M037菌體生物量在180 h達到最大，此時發(fā)酵液中含有少量的殘?zhí)呛洼^高濃度的乙醇，使菌株細胞機能變弱，進而導致細胞自溶，菌株生物量基本保持不變，從圖4-B和圖4-C殘?zhí)窍乃俾屎鸵掖忌a速率可以看出，釀酒酵母JM037發(fā)酵速率比對照緩慢，對照組在120 h乙醇產量達到最大(48.57 g/L)，在156h殘?zhí)墙抵?.15 g/L，而釀酒酵母JM037在168 h乙醇產量達到最大(38.36 g/L)，在216 h殘?zhí)墙抵?.06 g/L。另一方面，安琪酵母菌可以產生酒精，但不產生GABA，釀酒酵母JM037在高產GABA(1145 mg/L)的同時，還具有良好的產酒精的能力，見圖4-D。因此，釀酒酵母JM037具有釀制富含GABA果酒的潛能。

圖4 釀酒酵母JM037發(fā)酵各項指標Fig.4 The indicators for fermentation of S. cerevisiae JM037

3 結論

從四川泡菜中初篩得到3 株具有產GABA能力的酵母菌。經生理生化和18S rRNA序列分析，菌株JM009和JM037被鑒定為釀酒酵母、菌株JM024被鑒定為C.tanzawaensis。通過HPLC對菌株GABA表達能力進行評估發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母 JM037產GABA能力最高。進一步對其進行耐受性及發(fā)酵性能測試分析，釀酒酵母JM037綜合耐受性良好，并在桑葚汁中靜置發(fā)酵條件下，釀酒酵母JM037既能高產GABA(1 145 mg/L)，還具有良好的產酒精(38.36 g/L)的能力。因此釀酒酵母JM037具有釀制富含GABA果酒的潛能。

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Screening for bioconversion γ-aminobutyric acid-producingSaccharomycescerevisiaeand its application in mulberry wine brewing

ZENG Lin1,2,TAN Xiao1,ZHANG Qing1,2*,YANG Ying,TANG Jie1

1(Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan, College of Food and Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)2(Biotechnology Institute of Ancient Brewing, Xihua University, Chengdu 610039, China)3(Food and Drug Institute of Shandong, Shandong, Jinan 250101, China)

In order to obtain yeasts which could produce γ-aminobutyric(GABA) and brew good performance mulberry wine, 3 strains of GABA-producing yeast were screened from Sichuan pickles by paper chromatography. Then, they were identified asS.cerevisiaeandC.tanzawaensisusing the physiological and biochemical tests and the phylogenetic analysis. The performance of GABA-producing yeasts was assessed by high-performance liquid chromatography (HPLC) method. The results showed that theS.cerevisiaeJM037 produced higher yield of GABA, and the content of GABA reached 670 mg/L. ThenS.cerevisiaeJM037 was further analyzed for its tolerance properties and mulberry wine brewing ability. The results showed thatS.cerevisiaeJM037 had good comprehensive tolerance properties and it GABA-producing capacity increased to 1145 mg/L at 144 h. Ethanol production was 38.36 g/L at 168 h, while residual sugar dropped to 3.06 g/L at 216 h. In addition, ethanol synthesis rate and the residual sugar consumption rate ofS.cerevisiaeJM037 was relatively slow compared with angel yeast, butS.cerevisiaeJM037 has a unique capacity to produce GABA. Therefore,S.cerevisiaeJM037 has potential for brewing fruit wine with GABA.

γ- aminobutyric acid;S.cerevisiae; tolerance properties; screening; identify; mulberry wine

碩士研究生(張慶副教授為通訊作者,E-mail：biozhangq@163.com )。

四川省應用基礎項目(2016JY0253)；教育部春暉計劃項目(Z2014060)；四川省食品生物技術重點實驗室項目(szjj2016-019)

2017-01-03,改回日期：2017-02-07

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706020