HIF-1α和COX-2在力學誘導大鼠終板軟骨細胞退變模型中的表達及意義

徐永明，高智，肖良，徐宏光，張曉玲

（1.皖南醫學院第一附屬弋磯山醫院脊柱外科，安徽 蕪湖 241001；2.中國科學院上海生命科學院骨科細胞與分子生物學實驗室，上海 200025）

醫學與護理

HIF-1α和COX-2在力學誘導大鼠終板軟骨細胞退變模型中的表達及意義

徐永明1，高智1，肖良1，徐宏光1，張曉玲2

（1.皖南醫學院第一附屬弋磯山醫院脊柱外科，安徽 蕪湖 241001；2.中國科學院上海生命科學院骨科細胞與分子生物學實驗室，上海 200025）

目的：探討缺氧誘導因子1α（HIF-1α）和環氧化酶2（COX-2）在間歇性循環牽張力作用下誘導大鼠終板軟骨細胞退變中的表達情況及意義.方法：應用胰酶消化法獲得大鼠終板軟骨細胞，用FX-5000T儀器給予終板軟骨細胞施加10%牽張力、0.5Hz、8h/d的力學刺激誘導終板軟骨細胞退變，實驗中設對照組（無力學刺激）和實驗組（10%、0.5Hz、8h/d力學刺激），甲苯胺藍染色觀察細胞形態及二型膠原分泌情況，RT-PCR及Western blotting分別檢測軟骨細胞中HIF-1α、COX-2的mRNA和蛋白水平變化.結果：大鼠終板軟骨細胞給予一定力學刺激后出現退變改變，軟骨相關合成基因表達水平降低，實驗組中HIF-1α、COX-2的mRNA及蛋白水平表達均較對照組增高，差異具有統計學意義（P〈0.05）.結論：HIF-1α、COX-2在力學誘導大鼠終板軟骨細胞退變模型中表達水平均增高，進一步推測其與椎間盤退變過程有關.

HIF-1α；COX-2；椎間盤退變；力學刺激

頸腰痛作為骨科一種常見病，隨著社會的發展，其發病率不斷增加，嚴重影響著人們的生活質量以及日常工作.椎間盤退變目前認為是引起該疾病的主要因素之一[1]，目前多數學者認為引起椎間盤退變是由多種因素相互作用所導致的結果.前期有研究表明在髓核細胞中缺氧誘導因子1α（HIF-1α）表達明顯，敲除該因子后小鼠髓核細胞出現大量死亡，導致椎間盤發生退變改變[2].Agrawal等報道HIF-1α可通過調控蛋白聚糖（ACAN）mRNA和蛋白合成影響椎間盤退變[3]，HIF-1α在腰椎間盤退變過程中伴有重要角色[4].同時相關研究證明環氧化酶2（COX-2）可通過上調VEGF的表達進而影響椎間盤中微血管生成[5].我們前期研究報道大鼠終板軟骨細胞給予一定力學刺激后與軟骨相關的SOX9、二型膠原（COL2A1）、ACAN等有基因及蛋白水平發生變化，軟骨細胞發生退變改變[6]，然而HIF-1α、COX-2在力學誘導終板軟骨細胞退變模型中的鮮有報道，希望通過本研究進一步明確HIF-1α及COX-2與椎間盤退變之間關系，為明確椎間盤退行性疾病的病因提供一種新的認識.

1 材料與方法

1.1 大鼠原代終板軟骨細胞分離及培養

6只Sprague Dawley大鼠（6-8w、體重160±10g）購買至上海斯萊克實驗動物有限公司大鼠，處死后用75%酒精浸泡消毒15min，消毒后在無菌超凈臺中取出整段腰椎，組織剪剔除多余的組織后用含1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）配制的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2-3次，眼科剪將清洗后的終板軟骨組織剪成碎片（約1mm3），將獲得碎片樣終板軟骨組織給予0.25%胰酶（Gibco，美國）消化45min后再加入0.2%的II型膠原酶（Sigma，美國）消化4-6h，懸液過濾3次后以1500r/min離心5min，去除消化液后用PBS洗滌2次，最后加入含10%胎牛血清（Gibco，美國）的DMEM/F12（Hy-Clone，美國）培養液吹打混勻后接種至10cm培養皿中并放置入培養箱內培養（37℃含5%CO2），根據細胞生長情況每2-3d更換培養液1次，細胞融合至85-90%時按1：3傳代，本實驗中取P2代細胞進行實驗.

1.2 力學誘導大鼠終板軟骨細胞退變模型建立

將上述方式所獲得P2代細胞按密度1.5×105個接種至每孔中含2ml培養液（含10%胎牛血清的DMEM/F12）的6孔BioFlexTM加力板（Flexcell國際公司，美國）中，實驗設立對照組(無力學刺激)和實驗組(10%循環牽張力，0.5Hz，8 h/d)，待細胞融合至70-80%時實驗組給予FX-5000T細胞應變加載系統（Flexcell國際公司，美國）施加上述力學條件刺激不同天數，兩組細胞均置于同一培養箱中培養（37℃含5%CO2）.

1.3 甲苯胺藍細胞染色

分別取10%循環牽張力，0.5Hz，8h/d力學刺激7d及無力學刺激的兩組大鼠終板軟骨細胞，吸除每孔中培養液分別加入1.5ml 4%多聚甲醛溶液固定45min，PBS洗滌2次后每孔加入2ml 1%的甲苯胺藍染色常溫浸染1h后，電動吸引器吸除多余染料，待自然晾干后熒光顯微鏡下及數碼相機進行拍照.

1.4 大鼠終板軟骨細胞RNA提取及RT-PCR

將上述力學刺激及無力學刺激的大鼠終板軟骨細胞用PBS洗滌3次后每孔加入1.5ml Trizol置于冰上充分裂解45min，按照廠家說明方法提取RNA,用Nano-Drop2000儀器（Thermo＆Scientific，美國）測定所獲的RNA濃度并分析其純度，OD260/OD280值在1.8-2.0之間的RNA樣本進行下一步實驗，按20μl體系反轉成cDNA，反轉后得到的cDNA稀釋12.5倍后點板進行RT-PCR，每個樣品設置4個復孔.設定反應條件：95℃預變30s；95℃變性5s；60℃退火延伸25s，擴增45個循環.取GAPDH為內部參照.用Roche LightCycler480軟件自動分析結果，計算2-△△Ct值，實驗中PCR所合成的基因均由上海生工公司合成，相關引物序見表1.

表1 RT-PCR引物序列

1.5 Western blotting檢測

按1.2所描述將兩組六孔板中細胞培養液去除后PBS洗滌3次，各孔加入150μl RIPA（含1%PMSF）裂解液置于冰上裂解45min，分別吸取每孔中的液體至1.5ml離心管中，12000r/min、4℃離心15min后用1ml槍頭吸除離心管底中透明果凍樣細胞碎片，小心吸取離心管上層液體并計算所得量，每孔分別取10μl液體用BCA定量法測定所得到蛋白濃度，剩余液體用4×蛋白loading buffer稀釋至1×并置于99℃、900r/min煮15min使蛋白變性，配制10%分離膠并按20μg每孔蛋白濃度上樣，十二烷基酸鈉聚丙烯酸銨（SDS-PAGE）凝膠電泳，分離膠跑30min后濃縮膠跑70min, 300mA4℃冷庫中轉膜150min.5%牛血清白蛋白(BSA)常溫搖床上封閉2h，一抗（5%BSA稀釋1:800），4℃冷庫搖床上孵育過夜后TBST洗滌三次，每次5min，用二抗（5%BSA稀釋1:2000）室溫搖床孵育1h后再次用TBST洗膜三次，凝膠成像系統（Tanon，中國）進行拍照，實驗中主要有關抗體GAPDH(Cell Signaling Technology,14C10,美國),SOX9(Abways,CY5400,中國),COL2A1(Bioworld,P02458,美國)，COX-2(Abways,CY3818,中國)，HIF-1α（Abways，CY2173，中國）.

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 體外力學刺激后大鼠終板軟骨細胞形態發生變化

實驗中大鼠終板軟骨細胞在間歇性循環牽張力（10%、0.5Hz、8h/d）刺激7天后，倒置相差顯微鏡下觀察發現細胞形態由多角狀形逐漸變為長梭形狀，局部細胞形態較為紊亂，甲苯胺藍染色見實驗組軟骨細胞二型膠原分泌較對照組減少（見圖1）.

2.2 力學刺激誘導大鼠終板軟骨細胞出現退變

大鼠終板軟骨細胞分別應用10%間歇性循環牽張力、0.5Hz、8h/d刺激1d、3d、7d后，RT-PCR與Western blotting分別檢測軟骨合成相關基因（SOX9、COL2A1、ACAN）及蛋白（COL2A1、SOX9）水平表達隨力學刺激時間延長表達水平逐漸降低，大鼠終板軟骨細胞出現退變改變（見圖2A-D）.

2.3 力學刺激對大鼠終板軟骨細胞中HIF-1α及COX-2 mRNA水平表達影響

圖1 對照組、實驗組甲苯胺藍染色鏡下和整體改變.

圖2 A-C 10%間歇性循環牽張力、0.5Hz、8h/d刺激1d、3d、7d后軟骨細胞中SOX9、COL2A1、ACAN基因水平變化（?為P〈0.05,??為P〈0.01），D10%間歇性循環牽張力、0.5Hz、8h/d刺激7d后軟骨細胞中蛋白水平變化

我們發現大鼠終板軟骨細胞體外給予力學刺激后，實驗組中COX-2 mRNA水平表達較對照組逐漸增高，HIF-1α在刺激1d時兩組之間mRNA水平變化無差異，但隨著力學刺激時間延長，3d、7d時mRNA水平表達在實驗組中均較對照組增高（見圖3A-B）.

圖3 A-B10%間歇性循環牽張力、0.5Hz、8h/d刺激不同天數兩組大鼠終板軟骨細胞中HIF-1α、COX-2基因水平變化（?為P〈0.05,??為P〈0.01），C兩組大鼠終板軟骨細胞中HIF-1α、COX-2蛋白水平改變

2.4 力學刺激對大鼠終板軟骨細胞中HIF-1α及COX-2蛋白水平表達影響

大鼠終板軟骨細胞體外給予10%間歇性循環牽張力、0.5Hz、8h/d分別刺激1d、3d、7d后，Western blotting檢測實驗組中HIF-1α及COX-2蛋白水平表達水平在3d、7d時均較對照組增高，蛋白表達水平與RT-PCR結果一致（見圖3C）.

3 討論

目前認為椎間盤退變與遺傳、生活環境方式、機體免疫以及急慢性損傷等諸多因素有關，但上述因素中何種因素作為啟動因素目前仍存在爭議，相關研究證實，椎間盤退變過程中生物力學影響具有重要意義，不恰當的力學刺激可導致椎間盤退變進而出現腰腿痛[7]，終板軟骨細胞退變將進一步引起椎間盤退變發生，因此明確力學在該過程中的調控機制尤為重要.

缺氧誘導因子（HIF）主要由HIF-1、HIF-2、HIF-3組成，是細胞低氧狀態下反應最重要的調節因子，能有有效緩解組織缺血、缺氧.其中HIF-1由α及β兩個亞基組成，HIF-1的活性主要有α亞基決定.環氧化酶（COX）又稱前列腺酶，目前主要發現COX-1、COX-2，其中COX-2可通過調劑血管內皮生長因子進而促進微血管通透性增加，影響血管生成[8].

盡管有研究報道HIF-1α、COX-2在人退變的椎間盤及髓核組織中表達水平較正常人中增高[2,5]，但目前該結論尚未在體外誘導軟骨細胞退變模型中得以驗證，本研究首先通過體外培養大鼠終板軟骨細胞，給予一定強度及頻率的牽張力刺激后誘導軟骨細胞發生退變，成功建立體外大鼠終板軟骨細胞退變模型后，通過RT-PCR及Western blotting方法分別檢測HIF-1α、COX-2基因及蛋白水平變化，初步檢測在退變的終板軟骨細胞中表達量較正常終板軟骨細胞高，說明HIF-1α、COX-2均參與終板軟骨細胞退變過程中相關調控，與椎間盤退行疾病有關，然而本實驗現對其引起終板軟骨細胞退變的機制不清，我們暫無法在細胞水平觀察COX-2是否在終板軟骨細胞退變過程中對VEGF也進行相關調控，力學刺激是否會引起細胞耗氧量的改變進而通過HIF-1α調控影響細胞退變，這將都是我們下一步研究重點，希望通過闡明力學作用、COX-2、HIF-1α這三者間關系，進一步加深對椎間盤退行性疾病有關認識.

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R681.5

A

1673-260X（2017）07-0023-03

2017-03-16

國家自然科學基金項目資助（81572185）