FZD1在腎癌中表達及其臨床意義

田鮮艷?莫艷麗?楊志雄?蘇文媚

[摘要] 目的 檢測FZD1在配對腎癌及癌旁組織，腎癌細胞系與正常細胞系中mRNA表達水平，探討其表達與臨床病理特征之間關系。 方法 運用RT-PCR熒光定量方法，從基因水平檢測FZD1在52對腎癌組織和癌旁組織，腎癌細胞株（ACHN）和正常人腎近端小管上皮細胞株（HK-2）中表達量差異。 結果 FZD1的表達量與患者年齡、性別及病理分型無關（P>0.05），但與腫瘤直徑、AJCC臨床分期、Fuhrman分級、淋巴結轉移、遠處轉移密切相關（P<0.05）。FZD1在腎癌組織和腎癌細胞中表達均上調，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 FZD1在腎癌中表達明顯升高，且與不良預后有關，可能作為腎癌臨床預后生物標志物之一。

[關鍵詞] 腎癌；FZD1；預后；臨床意義

[中圖分類號] R737.11 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）09-24-04

Expression and clinical significance of FZD1 in renal cell carcinoma

TIAN Xianyan1 MO Yanli2 YANG Zhixiong3 SU Wenmei3

1.Department of Oncology，Jiangmen Central Hospital，Jiangmen 529030，China；2.Department of Oncology， Zhanjiang Central Hospital，Zhanjiang 524033，China；3.Cancer Center， Affiliated Hospital of Guangdong Medical College， Zhanjiang 524002，China

[Abstract] Objective To detect mRNA expression level in renal cell carcinoma cell line and normal cell line in FZD1 matching renal cancer and adjacent tissues to explore relationship between its expression and clinical pathological characteristics. Methods Fuorescence quantitative RT-PCR method was used to test expression level of FZD1 in renal carcinoma cell line （ACHN） and proximal renal tubular epithelial cell line （HK-2） of normal people in 52 couples of renal cell carcinoma tissues and adjacent tissues. Results Expression level of FZD1 was not related to age，gender and pathological type of patients（P>0.05），but it was closely related to tumor size，AJCC clinical stage，Fuhrman grade，lymph node metastasis and distant metastasis （P<0.05）.Expression levels of FZD1 in renal cell carcinoma tissues and renal carcinoma cell were both improved（P<0.05）.The difference was statistical significant. Conclusion Expression level of FZD1 in renal cell carcinoma is significantly improved and it is related to poor prognosis，which can be regarded as one of biomarkers of clinical prognosis of renal cell carcinoma.

[Key words] Renal cell carcinoma；FZD1；Prognosis；Clinical significance

腎癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一，目前手術治療是腎癌早中期主要的治療手段[1-2]，而轉移性或復發性晚期腎癌對放化療不敏感[3]，5年生存率僅達10～11%[4-5]。隨著基因芯片在腎癌中的運用，從分子水平研究腎癌發生發展過程，可為腎癌提供更多診斷標志物和生物治療靶點。卷曲蛋白-1（frizzled-1，FZD1）可促進胰腺癌細胞侵襲，增加小細胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、神經母細胞瘤等化療藥物耐藥性，是膽囊癌臨床預后評估標志物之一。有研究通過長鏈非編碼RNAs（LncRNAs）芯片技術，篩選出與腎癌表達差異的LncRNAs，其中發現lnc-FZD1-2在腎癌組織中較正常組織表達上調9倍[6]。國內學者研究顯示FZD7在腎透明細胞癌組織中陽性表達率顯著高于癌旁組織[7]。關于FZD1基因在腎癌中的表達相關報道較少，本研究選取52例配對的腎癌組織和癌旁組織和腎癌細胞株（ACHN）和正常腎上皮細胞株（293T），通過RT-PCR法檢測，觀察FZD1表達差異和其與腎癌臨床病理特點的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年1月～2015年9月我院52例僅行手術且未行其他治療的患者的腎癌組織及配對癌旁正常組織（切緣距腫瘤>2cm），均經病理證實腎癌組織含腎癌細胞，癌旁正常組織不含癌細胞。標本均取得我院醫學倫理委員會批準和經過患者簽署知情同意書。腎癌病理分期參照美國癌癥聯合會（AJCC）第7版2010年腎癌分期標準。標本

切除后將樣本切成小塊，立即加入RNA保護劑，置于-80℃冰箱備用。

1.2 細胞培養

人腎癌細胞株ACHN和腎小管上皮細胞株HK-2均由中山大學腫瘤防治中心實驗室惠贈。細胞株常規于10%胎牛血清（Gibco，BRL，Grand Island，NY）、1%的青鏈霉素雙抗（吉諾生物醫藥技術有限公司，20160125）DMEM培養基（Gibco，BRL，Grand Island，NY）在37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。

1.3 組織和細胞株總RNA的提取

取適量冰凍組織置于研缽，加入液氮迅速研磨成粉末狀，加入適量Trizol（Takara，Japan）進行裂解；按照試劑盒步驟分別加入氯仿、異丙醇等試劑進行提取總RNA，所有槍頭、EP管均采用滅酶處理。在紫外分光光度計測定其純度和濃度，RNA取純度在260/280比值在1.8～2.1，并進行濃度配平，置-80℃冰箱備用。取1μg總RNA按照Takara反轉錄反應試劑盒進行兩步法反轉錄成cDNA，反應條件為37℃ 15min，85℃ 5sec，4℃。

1.4 RT-PCR

取2μl反轉錄好的cDNA，分別加入SYBR GreenⅡ（Takara，Japan）試劑、相應特異性前后引物，在LightCycler （Roche Diagnostics，USA）熒光定量PCR儀進行RT-PCR熒光定量測定CP值，以GAPDH作為內參進行標準化校正。特異性引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計及合成。FZD1前引物序列：5-GAGTTCGTGCCAATCCTGAC-3，后引物序列：5-GTCTGTCCATCCTCCCTCTG-3；內參GAPDH前引物序列：5-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3，后引物序列：5-CAGTGATGGCATGGACTGTG-3。取10uL反應體系，條件為：預變性，95℃ 30s，擴增，95℃ 5s，60℃ 30s，40循環。采用2-ΔΔCT（目的基因CP-內參CP）方法分析所得數據。運用配對t檢驗分析配對腎癌組織和癌旁正常組織中FZD1表達水平。實驗重復3次，每樣本設3個復孔。

1.5 統計學處理

每個實驗重復三次，數據使用SPSSl7.0軟件進行統計分析。計量資料以（）表示，采用t檢驗，計數資料以百分比表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎癌組織中FZD1與臨床病理特征的關系

本研究通過分析52例腎癌組織的臨床資料結果顯示，FZD1的表達量與患者年齡、性別及病理分型無關（P>0.05）但與腫瘤直徑、AJCC臨床分期、Fuhrman分級、淋巴結轉移、遠處轉移密切相關（P<0.05），見表1。

2.2 RT-PCR檢測FZD1在腎癌組織和配對癌旁正常組織的表達差異

采用RT-PCR法檢測FZD1在腎癌組織和配對癌旁正常組織的相對表達量，利用2-ΔΔCT法分析，以GAPDH為內參標準化處理：ΔCT=CTFZD1-CTGAPDH，ΔΔCT=CT腎癌組織-CT癌旁組織，通過2-ΔΔCT計算FZD1相對表達量結果顯示：FZD1在腎癌組織中相對表達量為：0.0032±0.0003；在配對癌旁正常組織相對表達量為：0.0015±0.00013。FZD1在腎癌組織中表達量較癌旁正常組織明顯升高，差異有統計學意義（t=39.23，P<0.05），見圖1A。

2.3 ACHN與HE-2細胞株中FZD1表達差異

RT-PCR檢測FZD1在ACHN與HK-2細胞株中表達，采用2-ΔΔCT法分析，ΔCT=CTFZD1-CTGAPDH， ΔΔCT=CTACHN-CTHE-2，FZD1在ACHN腎癌細胞株中表達量為：0.0048±0.0004，在HK-2細胞株中中表達量為0.0017±0.0001，差異有統計學意義（t=53.84，P<0.01），見圖1B。

3 討論

腎癌是常見的腫瘤之一，其發生率在世界范圍內差異較大，在歐洲和北美發生率較高，而在亞洲和南美則發生率較低[8]。因腎癌對放療及化療均不敏感，主要靠手術切除癌灶，目前仍缺乏有效的能夠控制轉移性或復發性晚期腎癌病情的治療手段，所以腎癌預后不佳[9]。

FZD1屬于FZD家族（frizzled gene），是Wnt信號通路的受體蛋白，異常激活Wnt信號通路可參與40多種實體腫瘤的發生，與腫瘤發生侵襲、化療藥物耐藥、臨床預后差等密切相關。FZD1作為Wnt信號通路的受體蛋白，同樣被發現其在人體多種腫瘤組織中表達異常。Yu S等[10]發現在骨肉瘤細胞株中，過表達E2F1能促使FZD1基因及蛋白的表達，使得成骨細胞進行分化及礦化。研究報道，FZD1在卵巢癌組織中表達量比在良性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中均明顯上調[11-12]；在膽囊腺癌組織中同樣發現FZD1 mRNA高表達，與慢性膽囊炎比較存在顯著性表達差異：FZD1在膽囊腺癌（59.0%），癌旁組織（26.1%）、腺瘤（20.0%）、息肉（13.3%）、慢性膽囊炎（11.4%）中表達水平逐漸降低，提示FZD1表達可能與膽囊腺癌發生發展有關。該研究團隊通過進一步分析FZD1與膽囊癌臨床病理特征關系結果顯示，在膽囊低分化腺癌、腫塊最大徑≥2cm、淋巴結轉移和侵犯周圍組織者FZD1陽性表達率明顯高于高分化腺癌、腫塊最大徑<2cm、無淋巴結轉移、未侵犯到周圍組織者，說明FZD1是膽囊癌的預后生物學標志物之一[13]FZD家屬其他成員在惡性腫瘤也有高表達[14-15]。

FZD1在卵巢癌和膽囊腺癌中高表達，在腎癌中是否也存在同樣高表達情況呢？與預期結果一致，本研究運用RT-PCR法檢測FZD1在腎癌組織、配對癌旁正常組織，腎癌細胞株、腎正常細胞株的表達，發現FZD1在腎癌組織中較配對癌旁正常組織明顯高表達，在腎癌細胞株中較腎正常細胞株同樣高表達，提示FZD1參與腎癌的發生發展過程，是通過激活Wnt經典途徑還是非經典途徑，仍需進一步實驗探究。經過分析FZD1表達水平差異與腎癌臨床病理特征之間的關系，結果顯示：FZD1的表達量高低與患者年齡、性別及病理分型無關（P>0.05），而與腫瘤直徑、AJCC臨床分期、Fuhrman分級、淋巴結轉移、遠處轉移密切相關（P<0.05），進一步提示FZD1成為腎癌預后的生物標志物方面有一定可能。FZD1異常激活的Wnt/β-catenin經典信號通路與各組織器官的衰老有關。如在小鼠骨骼肌中，FZD1在老齡小鼠中高表達，并且Wnt/β-catenin信號通路在骨髓間充質干細胞和肌源性細胞中表達隨著年齡增長而明顯升高，提示在老齡化過程中，FZD1通過激活Wnt/β-catenin信號通路抑制肌源性細胞分化而使機體發生衰老[16]。然而，FZD1是通過激活腎原癌基因促進細胞增殖，還是靶向結合某些凋亡調節基因從而改變凋亡途徑，導致凋亡減少，促進腎癌生長等分子機制尚未完全明確，需要后期更深入研究FZD1與腎癌的關系。我們可以通過siRNA干擾技術或是過表達技術調控FZD1在腎癌細胞中的表達，觀察上調或下調FZD1表達對腎癌細胞增殖、侵襲，轉移和凋亡等功能變化。

FZD1在腎癌細胞和組織中均高表達，且與臨床分期、Fuhrman分級、淋巴結轉移、遠處轉移等有密切關系，可為指導腎癌臨床預后及發現新的生物標志物提供一定的理論依據。

[參考文獻]

[1] Ficarra V，Schips L，Guillb F，et a1.Muhiinstitutional European validation of the 2002 TNM staging system in conventional and papillary localized renal cell carcinoma[J].Cancer，2005，104（5）：968-974.

[2] 唐雙陽，畢興，李東亮，等.334例腎細胞癌患者的預后因素分析[J].腫瘤，2015，35（7）：782-787..

[3] Basu B，Eisen T.Perspectives in drug development for metastatic renal cell cancer[J].Targeted Oncology，2010，5（2）：139-156.

[4] Guinan P，Saffrin R，Stuhldreher D，et al.Renal cell carcinoma： comparison of the TNM and Robson stage groupings[J].Journal of Surgical Oncology，1995，59（3）：186-189.

[5] 張進，王共先，郭劍明，等，腎細胞癌隨訪5年生存分析及預后相關因素的多中心研究[J].中華泌外科雜志，2015，36（2）：113-117.

[6] Blondeau J J，Deng M，Syring I，et al.Identification of novel long non-coding RNAs in clear cell renal cell carcinoma[J].Clinical Epigenetics，2015，7（1）：10.

[7] 王帥.Fzd7在腎癌中的表達情況及臨床意義[D].蘇州大學，2015.

[8] 曲東.長鏈非編碼RNA在腎癌靶向治療耐藥中的作用及機制研究[D].上海：第二軍醫大學，2016：1-136.

[9] Chow WH，Dong LM，Devesa SS.Epidemiology and risk factors for kidney cancer[J].Nature Reviews Urology，2010，7（5）：245-57.

[10] Kenney PA，Wood CG.Integration of surgery and systemic therapy for renal cell carcinoma[J].Urol Clin North Am，2012，39（2）：211-231.

[11] Yu S，Yerges-Armstrong LM，Chu Y，et al.E2F1 effects on osteoblast differentiation and mineralization are mediated through up-regulation of frizzled-1[J].Bone，2013，56（2）：234-241.

[12] Badiglian FL，Oshima CT，De OLF，et al.Canonical and noncanonical Wnt pathway：a comparison among normal ovary， benign ovarian tumor and ovarian cancer[J].Oncology Reports，2009，21（2）：313-320.

[13] 劉博文，李紅霞.卵巢癌組織中MDR-1、Wnt-1、FZD-1基因的表達變化及其與化療耐藥的關系[J]，山東醫藥，2010，50（26）：1-3.

[14] 何婉，成志強，黃思銓，等.FZD3基因和蛋白在大腸癌中的表達[J].貴州醫科大學學報，2016，（6）：681-685.

[15] 楊鵬生.原發性肝細胞癌中ACE2、FZD1的表達及其對預后影響[D].中南大學，2012.

[16] Liu H，Fergusson MM，Castilho RM，et al.Augmented Wnt Signaling in a Mammalian Model of Accelerated Aging[J].Science，2007，317（5839）：803-806.

（收稿日期：2017-03-17）