丹參素拮抗氧化應激所致骨質疏松并通過PI3k/Akt通路減少成骨細胞的凋亡

王秉義 潘劍

蘭州大學第二醫院骨科，甘肅 蘭州 730030

近年來，骨質疏松發病率也呈增加的趨勢，骨質疏松已經成為一個世界性的公共衛生問題[1]。氧化應激作為骨質疏松的一個危險因素己受到高度重視，各種類型的骨質疏松的發病過程中都伴隨氧化應激水平的升高和凋亡的發生[2,3]。因此，具有抗氧化活性的物質有可能是防治骨質疏松的新靶點[4]。訖今為止，研究最多的天然抗氧化治療骨質疏松的藥物是白藜蘆醇[5]。白藜蘆醇能夠清除細胞內的ROS，減緩衰老進程并可維持骨密度。丹參中丹參素等水溶性酚酸類成分是天然抗氧化有效成分，結構和白藜蘆醇極其相似，含有多個酚經基，可以提供活性氧阻止脂質過氧化反應，能提高機體SOD活性，清除ROS，減少ROS對機體細胞造成的損害，改善細胞缺血缺氧，可預防心腦血管疾病[6]。本文探究丹參素拮抗氧化應激造成成骨細胞凋亡的作用，為骨質疏松的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

4月齡清潔級SD大鼠60只，雌性，體重為(240±10)g，置于安靜、恒溫恒濕、無強光刺激的環境中飼養。大鼠由蘭州大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(甘)2013-0006。

1.2 主要試劑與設備

醋酸撥尼松(批號060328)，廣東華南藥業；丹參素(純度>85%，批號20140816)，鴻生生物；白藜蘆醇(純度>98%，批號20140908)，鴻生生物；一抗(Bax、AIF、cyto-C、pAkt及β-action)，美國Santa Cruz公司；PI3K抑制劑Ly294002(批號：K1047)，Cayman Chemical公司；胰酶、山羊抗兔IgG-HRP、Western免疫印跡的化學發光檢測試劑盒，購自美國Sigma公司；α-MEM培養基購自GIBco公司。雙能X線骨密度檢測儀(Lunar美國)，Western blot發光與凝膠成像系統，美國ALPHA公司；XYJ80-2低速離心機，江蘇南京金壇恒豐儀器廠；D37520高速離心機，德國Heraeus公司；電泳儀，美國Biorad公司；電泳槽，美國Biorad公司；SDS_B型倒置生物顯微鏡，中國重慶光電儀器有限公司。

1.3 大鼠分組與給藥

將60只雌性大鼠隨機分為6組：正常對照組、模型組、丹參素高中低劑量組(30、20、10 mg/kg 體重)和對照藥白藜蘆醇組(5 mg/kg 體重)，每組10只。模型組給大鼠灌胃醋酸潑尼松5mg/kg 體重，給藥體積為10 mL/kg，用0.5%CMC-Na配制0.5mg/mL的濃度。正常對照組大鼠每天灌注同樣體積的0.5%CMC-Na。丹參素組和白藜蘆醇組每日先給予模型組同樣劑量的醋酸潑尼松，之后分別給予丹參素和白藜蘆醇。均按給藥體積為10 mL/kg，用0.5%CMC-Na配制。以上給藥每日次，上午給予醋酸撥尼松，下午給予受試藥物，連續14w。

1.4 骨密度BMD測定

麻醉處死動物后取右股骨、第四腰椎骨，-4 ℃保存備用。測定時待骨組織自然恢復至室溫，采用雙能X線骨密度儀進行骨密度測定。

1.5 細胞培養及分組

小鼠成骨細胞MC3T3-E1培養于含10 %的α-MEM培養基當中，置于37 ℃，體積分數5%的細胞培養箱中培養，胰酶常規傳代。實驗分為4組：A組(正常組)不加任何處理；B組(醋酸潑尼松組)加入終濃度為5 μg/mL 醋酸潑尼松；C組(醋酸潑尼松+丹參素干預組)加入終濃度為20 μg/mL，D組(醋酸潑尼松+丹參素+Ly294002組)加入終濃度為20 μmol/mL的Ly294002。

1.6 骨組織切片原位末端轉移酶標記法(TUNEL)染色

取各組大鼠部分骨組織，進行石蠟包埋。在視交叉后1～4 mm處切取10 μm冠狀位骨組織片，每隔4片選取1片，每只大鼠選取5片備用。進行常規脫蠟水合之后加入蛋白酶K(蛋白酶K終濃度為0.8mg/mL)，于37 ℃水浴孵育30 min。每個待檢測樣本中加入50μL TUNEL反應混合液(按照TdT：熒光素標記dUTP為1：9的比例配制)。每組樣本中加入100 μL DNase I反應液，加入含有HRP的熒光素抗體進行37 ℃水浴孵育30 min，采用二氨基聯苯胺(DAB)進行染色，經蘇木素復染之后，于400倍顯微鏡下觀察細胞凋亡。如若鏡下出現細胞核成桔紅色、細胞質不著色、染色質呈塊狀凝聚或者裂解為顆粒狀的細胞，即為陽性染色細胞。根據骨組織細胞凋亡指數(AI)的計算公式，骨組織細胞凋亡指數(AI)=陽性細胞數/(陽性細胞數+陰性細胞數)×100%。

1.7 免疫熒光檢測成骨細胞MC3T3-E1中pAkt表達水平

當細胞生長到90%融合時，用0.25%的胰酶消化細胞，均勻傳代后，以密度為5×104的細胞密度鋪24空板。第二日早晨分為不同組別進行加藥處理。將孔板分為4組，每組6個孔，加藥培養24 h。將長好細胞的孔板用PBS沖洗3次，每次10 min。再以4%的多聚甲酵固定1 h。固定好的孔板再用PBS沖洗3次，每次10 min。加入0.2%的曲拉通作透化處理，PBS沖洗后以5%BSA溶液在37 ℃水浴中封閉50 min。在吸盡封閉液后加入(1∶200)的p-AKT抗體在4 ℃條件下孵育過夜。用PBS緩沖液沖洗孔板，吸取一抗殘液，避光下加入FITC標記的二抗，37 ℃解育1 h后在加入(1∶100)的Hest33342染核處理，經過PBS沖洗后在突光顯微鏡下觀察，并拍照。

1.8 Western blot 實驗

從上述各組大鼠骨組織中以及成骨細胞MC3T3-E1分別提取總蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移蛋白至NC膜上，進行脫脂奶粉封閉2 h之后用PBS洗膜，分別加入一抗(Bax、AIF、cyto-C和pAkt)(1∶1000稀釋)，4 ℃孵育過夜。進行常規洗膜之后，加入II抗即辣根過氧化酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG抗體(1∶2000稀釋)并置于室溫中反應1 h。經洗膜之后采用Image J軟件測定各條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與相應的β-actin灰度值的比值作為Bax、AIF、cyto-C和pAkt蛋白的表達水平。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠骨密度BMD測定

與對照組相比，模型組大鼠腰椎、右股骨的BMD值均有降低(P<0.05)，給予低、中、高劑量的丹參素及白藜蘆醇治療后BMD值逐漸升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，低、中劑量丹參素與白藜蘆醇差異明顯，高劑量丹參素與白藜蘆醇差異不明顯，見表1。

表1 各組大鼠中骨密度BMD值±s，n=10)Table 1 BMD of rats in each group (±s，n=10)

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，**P<0.05

2.2 各組大鼠骨組織中細胞凋亡指數

從圖1中可以看出，與正常對照組(0.193±0.023%)相比，模型組骨組織中陽性細胞數目最多，細胞核呈桔紅色，細胞質不著色、染色質呈塊狀凝聚或者裂解為顆粒狀，細胞凋亡指數最大(0.741±0.026%)(P<0.05)；與模型組相比，丹參素各劑量組(從高劑量到低劑量依次為0.385±0.071%、0.296±0.069%、0.193±0.075%)和白藜蘆醇組(0.286±0.053%)骨組織中細胞凋亡均明顯減少(P<0.05)。

圖1 各組大鼠骨組織中細胞凋亡檢測Fig.1 The apoptosis in rat bone tissue in each group

2.3 各組大鼠骨組織中Bax、AIF、cyto-C蛋白表達量

如表2所示，與正常對照組相比，模型組大鼠骨組織中凋亡相關蛋白Bax、AIF、cyto-C表達量明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，丹參素各劑量組和白藜蘆醇組骨組織中細胞凋亡相關蛋白Bax、AIF、cyto-C表達量均明顯減少(P<0.05)，低、中劑量丹參素與白藜蘆醇差異明顯，高劑量丹參素與白藜蘆醇差異不明顯，有統計學意義。

表2 各組大鼠骨組織中Bax、AIF、cyto-C蛋白表達量±s，n=10)Table 2 The expression of Bax, AIF, and cyto-C protein in rat bone tissue in each group (±s，n=10)

注：與對照組相比,*P<0.05；與模型組相比,**P<0.05

圖2 各組大鼠骨組織中Bax、AIF、cyto-C蛋白表達Fig.2 The expression of Bax, AIF, and cyto-C protein in rat bone tissue in each group

2.4 免疫熒光檢測各組成骨細胞MC3T3-E1中pAkt的表達情況

如圖3所示，從免疫熒光結果看，A組和B組 pAkt蛋白無明顯區別，而C組pAkt蛋白表達明顯比B組增加，D組pAkt蛋白表達明顯比C組減少。

2.5 成骨細胞MC3T3-E1中Bax、AIF、cyto-C和pAkt的表達情況

從Western-blot檢測蛋白表達結果看，B, D 2組中Bax、AIF和cyto-C蛋白表達明顯增高，分別與A組、C組相比差異有顯著性意義(P<0.05)。而C組與B組相比調亡相關蛋白Bax、AIF和cyto-C的表達明顯降低。差異有顯著性意義(P<0.05)。然而，A、B兩組中pAkt表達量相比并無顯著差異，C組pAkt表達量明顯高于D組(P<0.05)。

圖3 各組成骨細胞MC3T3-E1中pAkt免疫熒光表達Fig.3 The immunofluorescence expression of pAkt in MC3T3-E1 cells in each group

圖4 各組成骨細胞MC3T3-E1中Bax、AIF、cyto-C和pAkt的表達Fig.4 The expression of Bax, AIF, cyto-C, and pAkt proteins in MC3T3-E1 cells in each group

組別BaxAIFcyto-CpAktA組0.145±0.0230.136±0.0240.129±0.0220.203±0.019B組0.786±0.021*0.769±0.016*0.698±0.021*0.302±0.015C組0.256±0.014#0.325±0.018#0.295±0.034#0.732±0.013D組0.732±0.021**0.699±0.018**0.678±0.016**0.296±0.024**

注：與A組相比,*P<0.05；與B組相比,#P<0.05；與C組相比,**P<0.05

3 討論

骨質疏松癥(osteoporosis)是一種以骨量低下，骨微結構損壞，導致骨脆性增加，易發生骨折為特征的全身性骨病[7,8]。在骨質疏松的發病過程中，氧化應激(ROS)甚至凋亡都扮演了重要的角色，各型的骨質疏松中都普遍伴有不同程度的成骨細胞調亡和氧化應激[9,10]。氧化應激通過抑制成骨細胞前體細胞成熟，使成骨細胞分化率明顯降低[11]，通過對成骨細胞的礦化作用的抑制[12]，誘導其凋亡。氧化應激也通過對骨髓基質細胞系和成骨細胞前體細胞系的分化的抑制發揮作用[13-15]。眾所周知，長期大劑量應用糖皮質激素(Glucocorticoid, GO)能夠誘導繼發性骨質疏松，即糖皮質激素也是誘發機體產生氧化應激并導致生理功能受阻的重要因素[16, 17]。因此拮抗成骨細胞的凋亡以及氧化應激反應，可以發揮減少骨質疏松現象的作用[18]。

天然抗氧化劑丹參素是丹參中的一種水溶性多酚酸類成分，具有抗骨質疏松的作用[19, 20]。PI3K/AKT信號傳導通路作為細胞生長，分化，凋亡等細胞生理代謝的常見通路[21]。為了探究丹參素抗骨質疏松的作用是否與拮抗細胞凋亡以及PI3K/AKT信號傳導通路有關，在本研究中，我們采用醋酸潑尼松制備大鼠骨質疏松模型，探究了丹參素對骨質疏松大鼠中骨組織細胞凋亡指數以及凋亡相關蛋白表達的影響。白藜蘆醇是目前治療骨質疏松常用藥物，因此被研究中采用白藜蘆醇處理組作為陽性對照組。從圖1和圖2可以得知，丹參素能夠抑制醋酸潑尼松誘導骨質疏松大鼠中骨細胞的凋亡，明顯降低細胞凋亡蛋白Bax、AIF、cyto-C的表達，并且呈現劑量依賴性關系。與白藜蘆醇組相比，不同濃度丹參素處理組對骨質疏松大鼠中骨細胞凋亡的拮抗能力各不相同，隨著劑量濃度增加而增加。這表明丹參素對骨質疏松大鼠具有保護作用，并且高劑量丹參素處理組對骨質疏松大鼠保護能力高于白藜蘆醇組。對于其機制研究，我們發現丹參素能夠上調成骨細胞MC3T3-E1中pAkt的表達，這表明PI3k/Akt通路在丹參素拮抗成骨細胞MC3T3-E1的凋亡過程中起到關鍵作用。通過抑制該通路之后，丹參素的抗凋亡作用大大被抑制。因此，我們推斷丹參素拮抗骨質疏松中骨細胞的凋亡是通過PI3k/Akt通路發揮作用的。但丹參素抗調亡的作用方式可能不是唯一的。它可能通過其他方式發揮作用。它或許激活了許多與凋亡相關的酶類，例如某些鋅指蛋白。也可能通過某些細胞因子起作用，如胰島素生長因子，轉移因子等等。這些還都待進一步研究。本研究發現的丹參素拮抗氧化應激引起的成骨細胞的凋亡，這可能會是治療骨質疏松的新途徑，期待在未來的應用中得到檢驗。