葛根素通過Nrf2-ARE信號通路抵抗氧化應激對創傷性腦損傷的神經保護作用

陳江生 陳保東 凌畢益 宋明浩 李志祥

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葛根素通過Nrf2-ARE信號通路抵抗氧化應激對創傷性腦損傷的神經保護作用

陳江生 陳保東 凌畢益 宋明浩 李志祥

目的 探討葛根素對創傷性腦損傷(TBI)模型大鼠的神經保護作用及腦組織紅系衍生的核因子相關因子2(Nrf2)一抗氧化反應原件(ARE)信號通路參與的機制。方法 選擇健康成年雄性大鼠體重250～300 g構建TBI模型，將大鼠分為4組：創傷組(A組)、假手術組(B組)、葛根素治療的創傷組(C組)和葛根素治療的假手術組(D組)；通過采用改良的神經功能缺損評分(mNSS)評價神經功能，腦組織干濕重稱量法評價腦水腫，Nissl染色，TUNEL染色評價腦損傷體積和神經元的凋亡，使用酶活試劑盒檢測損傷48 h后抗氧化酶SOD，GSH，和GSSG的活性以及氧化應激產物MDA和NO的水平，最后使用western blot和RT-PCR的方法檢測Nrf2-ARE信號通路及其下游分子HO-1，NQO1的表達水平。結果 TBI手術后損傷組mNSS評分明顯增高(P<0.05)，葛根素治療組能夠明顯降低mNSS評分(P<0.05)。TBI手術后損傷組腦水腫加重及神經元凋亡增加(P<0.05)，葛根素治療組能夠明顯挽救腦水腫及神經元凋亡(P<0.05)。TBI手術12 h后損傷組腦內抗氧化酶SOD，GSH，和GSSG的活性增加及氧化應激產物MDA和NO的水平升高(P<0.05)，葛根素治療組能夠明顯降低抗氧化酶SOD，GSH，和GSSG的活性以及氧化應激產物MDA和NO的水平(P<0.05)。western blot和RT-PCR顯示葛根素不改變Nrf2的翻譯和表達，但是RT-PCR顯示葛根素能夠明顯促進Nrf2-ARE信號通路下游分子HO-1，NQO1的表達。結論 葛根素可能通過Nrf2-ARE信號通路抵抗氧化應激對創傷性腦損傷發揮神經保護作用。

葛根素 Nrf2-ARE信號通路 創傷性腦損傷 氧化應激

創傷性腦損傷主要包括原發性腦損傷和繼發性腦損傷，是威脅45歲以下成年人群致死致殘的重要原因，給家庭和社會帶來嚴重負擔，目前并沒有有效的治療藥物[1]。有研究表明氧化應激反應是引起繼發性腦損傷的主要病理機制[2-3]，而Nrf2-ARE信號通路參與調解創傷性腦損傷中的氧化應激反應[4]。葛根素在多種疾病模型中能夠顯著地清除氧自由基而發揮抗氧化作用[5]。本研究通過探討葛根素對創傷性腦損傷的神經保護作用、氧自由基的清除以及對Nrf2-ARE信號通路的影響，從而為創傷性腦損傷的治療提供新的干預措施和新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和試劑 選擇成年健康雄性SD大鼠 80只，體質量230～260 g，周齡 7～8周，從史萊克實驗動物有限公司購買。主要試劑: Nissl和TUNEL檢測試劑盒購自美國羅氏生物公司，蛋白提取試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。GSSG、GSH、 SOD酶活試劑盒，MDA和NO檢測試劑盒 (由南京建成生物工程研究所提供)批號分別為20080829,20080801,20071129,20080801,20080801; 兔抗Nrf-2單克隆抗體(由Santa Cruz biotechnology公司提供)。RT-PCR逆轉錄試劑盒(由碧云天生物科技有限公司提供)和引物合成(由上海生工生物科技有限公司提供)。

1.2 TBI模型建立 本實驗的動物模型采BenchmarkTM顱腦損傷撞擊器建立TBI模型。具體操作如下：使用2%戊巴比妥(50 mg/kg)通過腹腔注射進行麻醉，完全深度麻醉后將大鼠固定在外傷模型裝備架上；在大鼠頭部消毒后在正中切口，暴露顱骨，以Bregma為中心坐標xy軸坐標(-2.5 mm，-2.5 mm)處使用顱骨打磨器鉆出直徑5 mm骨孔作為撞擊點，用5 mm直徑的撞擊頭以3 m/s的速度撞擊選定的顱骨位置，打擊深度為2 mm，打擊時間為120 ms；然后取出撞擊器把頭皮縫合，并放回飼養籠。假手術組同樣進行手術操作但不予以重物撞擊。在撞擊過程中20%～25%的大鼠當即死亡，正常蘇醒的大鼠無后續的死亡發生。當大鼠蘇醒后給予腹腔注射葛根素(60 mg/kg)48 h后麻醉大鼠取腦進行后續試驗。

1.3 神經功能評價 mNSS評分用于神經功能評價，總分最高為18分，最低為3分，其中包括運動對稱性、自發運動、攀爬能力、提尾時雙前肢對稱性、驚嚇反應、觸須反應等六大方面。根據每個測試項目中大鼠行為能力給予0～3分評分，具體標準參照文獻[6]。

1.4 Nissl和TUNEL染色 按照試劑盒標準步驟進行Nissl和TUNEL染色，在400倍鏡下進行拍照和觀察凋亡細胞情況，以細胞核染上棕黃色顆粒表示 TUNEL陽性細胞，Nissl染色的區域面積來計算大腦的完整性面積。

1.5 抗氧化酶活性以及氧化應激產物測定 造模成功后給予葛根素48 h后取出大鼠腦組織，根據酶活試劑盒檢測損傷抗氧化酶SOD，GSH和GSSG的活性以及氧化應激產物MDA和NO的水平，測量值標準化到假手術組。

1.6 RT-PCR 用 Trizol沉淀法提取總 RNA,按照逆轉錄試劑盒的操作步驟進行逆轉錄反應；所得 c DNA用于后續實時熒光定量 PCR反應；同時將GAPDH作為內在參照基因；同時將 PCR產物進行測序以及做熔解曲線, 以保證以上 PCR反應產物良好的特異性，計算△Ct值用來比較給藥前后 m RNA的表達變化。每個PCR反應都進行3個復孔。

1.7 Western Blot 將樣品使用RIPA進行總蛋白的提取, Bradford法進行蛋白水平測定；每孔上樣 20 μg蛋白, 10% SDS-PAGE分離樣品, 電泳完成后進行常規轉膜, 封閉；5% BSA稀釋一抗 (兔抗 Nrf-2單克隆抗體), 4 ℃孵育過夜；第2 d用TBST進行洗膜, 將膜浸入二抗稀釋液(1∶10000)中, 室溫孵育2 h；TBST進行洗膜后加入 ECL發光試劑, 暗室進行曝光, 顯色, Image J 軟件用于數據分析。

2 結 果

2.1 葛根素提高大鼠創傷后神經功能評分

創傷后48h與假手術組相比，創傷組有明顯的神經功能損傷癥狀，mNSS的評分下降，而葛根素治療的創傷組顯示腹腔注射葛根素后能明顯改善大鼠的神經功能，表現為mNSS的評分增加，而單獨給予葛根素于假手術組無明顯差異(圖1)。

圖1 葛根素提高大鼠創傷后mNSS的評分 與A組相比，創傷組有明顯的神經功能損傷癥狀，mNSS的評分下降，而葛根素治療的創傷組顯示腹腔注射葛根素后能明顯改善大鼠的神經功能，與A組比較，?P<0．05

2.2 葛根素改善TBI大鼠神經元損傷

細胞凋亡能夠反映神經元變性，本實驗通過Nissl和TUNEL染色觀察神經元變性的面積和比例。結果表明創傷后48h與假手術組相比，創傷組有明顯的神經元變性，Nissl和TUNEL染色顯示神經元變性的面積和比例增加，而葛根素治療加創傷組顯示腹腔注射葛根素后能明顯降低神經元變性的面積和比例，而單獨給予葛根素于假手術組無明顯差異(表1)。

表1 Nissl和TUNEL染色觀察神經元變性的面積和比例

注：與A組比較，*P<0.05

2.3 葛根素增加抗氧化酶活性并降低氧化應激產物水平

創傷后48 h與假手術組相比，創傷組抗氧化酶 SOD，GSH，和GSSG的活性明顯增高，且氧化應激產物MDA和NO的水平也同時增高，而葛根素治療的創傷組顯示腹腔注射葛根素后能明顯進一步增加抗氧化酶 SOD，GSH，和GSSG的活性，同時明顯降低氧化應激產物MDA和NO的水平，而單獨給予葛根素于假手術組無明顯差異(表2)。

表2 創傷后抗氧化酶 SOD，GSH，和GSSG的活性以及 氧化應激產物MDA和NO的水平

注：與A組比較，*P<0.05

2.4 葛根素激活Nrf2-ARE信號通路下游分子

Western blot和RT-PCR結果顯示葛根素不改變Nrf2的翻譯和表達，但是RT-PCR顯示葛根素能夠明顯促進Nrf2-ARE信號通路下游分子HO-1，NQO1的表達(表3)。

表3 葛根素能夠明顯促進Nrf2-ARE信號通路 下游分子HO-1，NQO1的表達

注：與A組比較*P<0.05

3 討 論

創傷性腦損傷主要包括原發性腦損傷和繼發性腦損傷，是威脅45歲以下成年人群致死致殘的重要原因，給家庭和社會帶來嚴重負擔，目前并沒有有效的治療藥物[1]。繼發性腦損傷是指原發性損傷后的膠質細胞過度活化、炎癥應激反應、氧化應激等復雜反應的綜合反應，繼發性腦損傷是創傷性腦損傷后慢性神經變性及神經功能損傷的主要機制。目前認為氧化應激是繼發性腦損傷的核心的病理環節，研究表明氧化應激反應是引起繼發性腦損傷的主要病理機制[2-3]。研究表明氧化應激主要通過細胞膜脂質過氧化產生丙二醛(MDA)而對血管內皮造成損傷，其中損傷機制是通過增加細胞內Ca2+濃度，降低NO的分泌，導致血管收縮功能受損[7]。MDA， NO的水平可反映氧化應激下組織受損程度[8]。本實驗發現腹腔注射葛根素后能明顯地降低氧化應激產物MDA和NO的水平，降低神經元變性的面積和比例，改善大鼠的神經功能。機體具有自主清除過量氧化應激產物并抵抗過度氧化系統，包括SOD， GSH，和GSSG等多種抗氧化酶，這些抗氧化酶在機體受到氧化應激損傷時起到重要的防御作用，但這種作用的維持有限，當受到過度損傷時機體的抗氧化體系并不能完全清除傷害[9-10]。本實驗結果顯示創傷后48 h與對照組相比，創傷組有明顯抗氧化酶 SOD，GSH和GSSG活性的增高，但是氧化應激產物MDA和NO的水平也同時增高，而葛根素治療的創傷組顯示腹腔注射葛根素后能明顯進一步增加抗氧化酶 SOD，GSH，和GSSG的活性，同時明顯地降低氧化應激產物MDA和NO的水平，因此葛根素是通過增加抗氧化酶 SOD，GSH，和GSSG的活性來清除氧化應激產物。

大量研究表明Nrf2-ARE信號通路參與調解創傷性腦損傷中的氧化應激反應[4]。葛根素是否通過調節Nrf2-ARE信號通路來參與創傷性腦損害的抗氧化應激過程？本研究發現葛根素不改變Nrf2的翻譯和表達，但是RT-PCR顯示葛根素能夠明顯促進Nrf2-ARE信號通路下游分子HO-1，NQO1的表達。Nrf2是機體降低活性氧、抵御氧化應激的重要轉錄因子[11]。正常情況下Nrf2在胞漿中與抑制因子Keap1結合, 處于失活性狀態。在誘導 Nrf2激活后Nrf2與 Keap1分離, 轉入細胞核中, 進而識別并結合抗氧化反應元件 (ARE), 啟動下游基因表達,增強細胞抗損傷能力, 從而有效防御有害物質的攻擊[4]。Nrf2調控下游主要基因分別為解毒酶基因和抗氧化基因、應激基因等。其中醌 氧 化 還 原 酶 1[NAD (P) H: quinoneoxidoreductase-1， NQO1]和血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1， HO-1)發揮對抗氧化應激作用。以往研究表明 HO-1在腦外傷后表達下降并能夠預測腦梗死后神經變性的預后情況[12-13]。NQO1同時也是Nrf2下游調控表達的細胞保護性蛋白，在多種退行性疾病中起到重要作用[14]。葛根素在多種疾病模型中能夠顯著地清除氧自由基發揮抗氧化作用[15]。本研究通過探討葛根素對創傷性腦損害的神經保護作用、氧自由基的清楚以及對Nrf2-ARE信號通路的影響，發現葛根素可能通過激活 Nrf2入核進而激活下游解毒酶和抗氧化靶基因酶的表達、清除MDA和NO, 提高細胞的抗氧化酶 SOD，GSH，和GSSG的活性, 減輕創傷性腦損害的神經功能損傷，從而為創傷性腦損害的治療提供新的干預措施和新的理論基礎。

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(2016-10-16收稿)

Puerarin protects traumatic brain injury through Nrf2-ARE pathway to resist oxidative stress

ChenJiangsheng,ChenBaodong,LingBiyi,etal.

DepartmentofNeurosurgery,Songgangpeople’sHospital,BaoanDistrict,Shenzhen518105

Objective To investigate the puerarin protective effect on traumatic brain injury (TBI) model rats through tissue red derivative of nuclear factor related factor 2 (Nrf2) antioxidant/electrophilic response element (ARE) signal pathway.Methods TBI model was constructed using healthy adult male rats weigh 250～300 g. Animals were divided into four groups: injury group (group A) and control group (group B), puerarin treatment of injury group (group C), and puerarin treatment of control group (group D). Modified neural function defect scale (mNSS) were used to evaluate neural function, brain wet weight evaluation method was used for the weighing cerebral edema, Nissl staining, TUNEL staining was used to evaluate brain damage volume and neuronal apoptosis. Using enzyme activity kits detect the activities of antioxidant enzymes SOD, GSH, MDA and oxidative stress productor GSSG and NO at 12 hours after injury. Finally using western blot and rt-pcr methods to detect the expression of Nrf2-ARE signaling pathway and its downstream molecular HO-1, NQO1 levels.Results After TBI surgery, mNSS scores were significantly higher (P<0.05), puerarin treatment significantly reduced mNSS score (P<0.05) and improved brain function after TBI. After TBI surgery increased edema and neuronal apoptosis (P<0.05), puerarin treatment group significantly rescued cerebral edema, neuron apoptosis (P<0.05). At 48 h after TBI surgery the activity of antioxidant enzymes SOD, GSH, MDA and oxidative stress product GSSG and NO were increased (P<0.05), puerarin treatment significantly reduced the activities of antioxidant enzymes SOD, GSH, MDA and oxidative stress product GSSG and NO (P<0.05). Western blot and RT-PCR results showed that the puerarin did not change the translation and expression of Nrf2, but the RT-PCR results showed that puerarin significantly enhanced the Nrf2-ARE signaling pathways downstream molecular HO-1, and NQO1.Conclusion Puerarin has protective effect on traumatic brain injury through Nrf2-ARE signaling pathways to resist oxidative stress.

Puerarin Nrf2-ARE signaling pathway Eraumatic brain injury Oxidative stress

2015年深圳市科技計劃項目(JCYJ20150403115305748)

518105 深圳市寶安區松崗人民醫院神經外科(陳江生 凌畢益 宋明浩 李志祥)；深圳市第二人民醫院神經外科(陳保東)

R64

A

1007-0478(2017)02-0091-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.02.002