環介導核酸等溫擴增技術對疑似結核病患者的篩查效果

孫嬌 王悅 孫秀華 彭嬌 邢黎莉 孫炳奇

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·論著·

環介導核酸等溫擴增技術對疑似結核病患者的篩查效果

孫嬌 王悅 孫秀華 彭嬌 邢黎莉 孫炳奇

目的 評價環介導核酸等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術對疑似結核病患者的篩查效果。方法 選取沈陽市第十人民醫院2015年5月至2016年6月收治的疑似結核病患者604例，收集標本604份，其中痰標本503份，胸腔積液抽取液98份，支氣管肺泡灌洗液3份，分別行涂片抗酸染色鏡檢(簡稱“涂片鏡檢”)、改良羅氏固體培養(簡稱“固體培養”)、MGIT 960液體培養(簡稱“液體培養”)和LAMP檢測，以臨床診斷結果為標準，評價4種檢測技術對結核病患者的檢測效能，采用χ2檢驗比較結核分枝桿菌的陽性檢出率，以P<0.05為差異有統計學意義。結果 以臨床診斷結果為參照，LAMP檢測、涂片鏡檢、液體培養、固體培養的敏感度分別為72.78%(262/360)、51.67%(186/360)、66.67%(240/360)和59.17%(213/360)；特異度分別為88.11%(215/244)、99.59%(243/244)、99.59%(243/244)和99.59%(243/244)，并且具有良好的一致性(Kappa值依次為0.58、0.46、0.61和0.54)。LAMP檢測對病程<1年患者的陽性檢出率[45.76%(189/413)]明顯高于涂片鏡檢[27.12%(112/413)]、液體培養[37.05%(153/413)]和固體培養[31.48%(130/413)](χ2=62.41、16.62、40.95，P值均=0.000)。當患者出現的臨床癥狀≤5個時，LAMP的陽性檢出率(44.37%，268/604)明顯高于涂片鏡檢(28.15%，170/604)、液體培養法(36.75%，222/604)和固體培養法(32.12%，194/604)(χ2值分別為76.22、21.59和47.21，P值均=0.000)。LAMP檢測對涂片鏡檢陰性，液體培養及固體培養陰性標本具有較高的陽性檢出率[分別為28.78%(120/417)，(21.49%(78/363)和25.90%(101/390)]。結論 LAMP技術檢測結核分枝桿菌較涂片鏡檢、液體培養和固體培養檢測效能高，適用于病程短、臨床癥狀較輕(1～5個癥狀)、涂陰和培陰的疑似結核病患者的篩查。

核酸擴增技術； 結核，肺； 多相篩查； 對比研究

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的一種全球性的慢性傳染病，2015年全球新發患者估算約為1040萬例，但由于缺乏檢測病原菌準確、快速、有效的技術手段，造成很多患者漏診，實際報告的患者例數遠遠低于這一數據[1-3]。近年來，分子生物學診斷方法發展迅猛，并以其高敏感度、高特異度和耗時短等優點而備受推崇。然而，同傳統的涂片抗酸染色法(簡稱“涂片鏡檢”)、MGIT 960液體培養(簡稱“液體培養”)和改良羅氏固體培養(簡稱“固體培養”)相比較，分子生物學的檢測費用相對較高，這也限制了此類技術在經濟欠發達地區的廣泛應用。既能發揮分子生物學技術的檢測優勢，又能避免該檢測技術的過度使用，已成為必須面對的難題。筆者以臨床確診的患者為檢測參照，對比分析了環介導等溫擴增檢測(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術與涂片鏡檢、液體培養和固體培養對疑似結核病患者的檢測結果，以期發現適合LAMP技術的人群，達到快速、經濟、有效、準確地診斷結核病的目的。

資料和方法

一、一般資料

1.患者的基本情況：選取沈陽市第十人民醫院2015年5月至2016年6月收治的疑似結核病患者604例，其中男426例，年齡16～93歲，平均(52.08±17.63)歲；女178例，年齡11～89歲，平均(49.87±19.88)歲。采集各類標本604份(每例患者提供1份標本，痰標本優先)，其中痰標本503份(晨起痰)，胸腔積液抽取液98份，支氣管肺泡灌洗液3份。最終臨床確診的肺結核患者為360例，未確診患者為244例(由于缺乏檢測病原菌準確、快速、有效的技術手段，造成目前臨床診斷的結核病患者例數遠遠低于實際患者數)。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

2.研究項目：大多數的文獻研究均按照標本類型進行分析[4-8]，可經過數據分析發現，LAMP對不同年齡、病程、臨床癥狀和肺部病變嚴重程度不同的患者其篩查效果是不同的，因此筆者嘗試依據患者的不同臨床特點(年齡、病程、臨床癥狀數量和肺部病變嚴重程度)分別進行數據分析，以期發現LAMP技術對不同臨床特點患者檢測效果的差異。(1)本組患者年齡分布情況：<20歲16例，20～歲149例，40～歲239例，≥60歲200例。(2)本組患者病程分布情況：<1年413例，1～5年117例，6～10年31例，11～20年13例，>20年30例。(3)本組患者臨床癥狀發生個數分布情況：分析結核病患者常見的7個臨床癥狀(發熱、咳嗽、咯痰、咯血、消瘦、盜汗和胸痛)，≤2個癥狀83例，3個癥狀167例，4個癥狀194例，5個癥狀113例，6個癥狀42例，7個癥狀5例。(4)本組患者肺部發生空洞的情況：有空洞133例，無空洞471例。

二、診斷標準

1.疑似肺結核：為胸部影像學檢查符合結核病影像學特征者，具體診斷標準參見《肺結核診斷標準(WS288-2008)》[9]。

2.肺結核臨床診斷：所有研究對象均經臨床癥狀及體征、胸部影像學檢查、標本細菌學檢查，來確診肺結核(診斷標準參見《肺結核診斷標準(WS288-2008)》[9])。

三、檢測方法

本研究分別采用LAMP檢測、涂片鏡檢、液體培養和固體培養對標本中結核分枝桿菌進行檢測，所有檢測均在標本采集后2 h內進行，避免因標本長期保存、細菌活力下降而造成檢測結果異常。

1.涂片鏡檢：對采集的標本進行熒光法涂片鏡檢(金胺O染色)，標本的收集、涂片、鏡檢流程按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[10]進行操作。結果報告抗酸桿菌陰性為連續觀察300個不同視野，未發現抗酸桿菌；若發現1條以上，即報告為陽性。

2.結核分枝桿菌細菌培養：取1 ml標本，向其加入1～1.5 ml的4%N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH枸櫞酸鈉溶液進行消化，旋緊蓋子，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩10～20 s，直至標本充分液化。將離心管室溫靜置15 min，加入磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)至40 ml，3000×g離心20 min。取100 μl和500 μl處理后的樣品分別接種至分枝桿菌生長指示管[10]和改良羅氏培養基[11]中，37 ℃溫箱培養。當生長指示管呈陽性結果，同時該培養物涂片抗酸染色也為陽性時，報告液體培養陽性。固體培養結果判定為接種后第3天和第7天觀察培養情況，此后每周觀察1次，直至第8個周末，無菌落生長報告培養陰性，發現典型結核分枝桿菌菌落形態即報告為陽性。

3. LAMP檢測：本研究中LAMP檢測所用試劑盒(loop amp PURE DNA提取試劑盒和loop amp MTBC檢測試劑盒)為日本榮研株式會社的商品化試劑盒，所有操作均嚴格遵循操作說明書。將60 μl樣本加入吸附劑試管中，充分混勻并加熱裂解(90 ℃，5 min)。然后，將吸附試管裝到樣本處理管上，搖晃幾次后得到初提的核酸，在樣本處理管上加上滴注蓋，輕壓樣本處理管將樣本滴入到反應管中。蓋上管蓋，充分混合后即可進行LAMP反應，反應結束后直接放入熒光目視檢測單元，通過自帶的紫外線激發熒光觀察反應結果。陽性：發出綠色熒光；陰性：未發出熒光。

四、 統計學分析

1.統計學方法：采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，以臨床診斷結果為檢測參考，計算各種檢測方法的敏感度、特異度、一致性、陽性預測值和陰性預測值。采用χ2檢驗比較4種檢測方法對結核分枝桿菌不同情況下的陽性檢出率，以P<0.05為差異有統計學意義。Kappa值≥0.75兩者一致性較好；0.4

2.相關公式：敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%；一致性=(真陽性例數+真陰性例數)/(真陽性例數+假陽性例數+真陰性例數+假陰性例數)×100%。

結 果

1. 不同標本類型經4種方法檢測的結果分析：對604份標本分別進行LAMP檢測、涂片鏡檢、液體培養和固體培養，結果顯示LAMP檢測具有很高的敏感度、特異度及一致性，尤其是對胸腔積液的檢測，其敏感度遠遠高于涂片法及培養法，詳見表1，2。

2. LAMP技術對不同標本類型及患者的檢測效果：LAMP對痰標本、胸腔積液的陽性檢出率明顯優于涂片鏡檢和培養法(P值均<0.01)，而肺泡灌洗液由于標本數量過少，故無法進行統計學分析；對<20歲患者的陽性檢出率與涂片鏡檢、液體培養和固體培養差異無統計學意義(P值均>0.05)，而對>20歲患者的檢出率差異均有統計學意義(P值均<0.01)；對病程<1年患者的陽性檢出率明顯高于涂片鏡檢和培養法(P值均<0.01)，但對于病程>5年的患者，上述檢測技術之間的差異無統計學意義；對肺部有或無空洞患者的陽性檢出率均明顯高于涂片鏡檢法和培養法。詳見表3。

3.臨床癥狀的數量與不同檢測方法陽性檢出率的關系：統計數據發現，隨著患者癥狀的不斷增多，各種檢測方法的陽性檢出率逐漸增高，當患者的臨床癥狀≤5個時，LAMP的陽性檢出率(44.37%，268/604)明顯高于涂片鏡檢(28.15%，170/604)、液體培養法(36.75%，222/604)和固體培養法(32.12%，194/604)(χ2值分別為76.22、21.59和47.21，P值均=0.000)，但當患者的臨床癥狀≥6個時，LAMP的陽性檢出率(3.81%，23/604)與涂片鏡檢(2.81%，17/604)、液體培養法(3.15%，19/604)和固體培養法(3.31%，20/604)差異無統計學意義(χ2=2.50,P=0.114；χ2=1.13，P=0.289；χ2=0.44，P=0.505)，詳見表4。

表1 不同標本類型經4種方法檢測的結果分析(例)

表2 不同標本類型經4種方法檢測的效能比較

注 敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%；一致性=(真陽性例數+真陰性例數)/(真陽性例數+假陽性例數+真陰性例數+假陰性例數)×100%；Kappa值≥0.75兩者一致性較好；0.4

表3 604例疑似結核病患者不同情況下4種檢測方法的陽性檢出率統計

注a：LAMP與涂片鏡檢檢出率比較的統計值；b：LAMP與MGIT960培養檢出率比較的統計值；c：LAMP與羅氏培養檢出率比較的統計值

表4 604例患者臨床癥狀數量與不同檢測方法陽性檢出率的關系

注 括號外數值為患者例數，括號內數值為發生率(%)或陽性檢出率(%)；a：LAMP與涂片鏡檢比較的統計值；b：LAMP與MGIT960培養比較的統計值；c：LAMP與羅氏比較的統計值；“-”無法計算

4. LAMP檢測結果與不同標本陽性結果報告時間的關系：在液體培養陽性的241份標本中，隨著陽性結果報告時間的延長，LAMP的陽性檢出率不斷下降，從96.92%降至62.50%，均偏低于液體培養法，但11～15 d是檢出率最高的時間；同樣的結果也出現在固體培養中，當陽性結果報告時間從7 d延長至56 d時，LAMP的陽性檢出率也從100.00%降至66.67%，其中有1例標本固體培養陽性結果報告時間為7 d(博奧基因芯片法進行菌種鑒定為結核分枝桿菌)，詳見表5。

5.LAMP對涂陰或培陰標本的陽性檢出率：LAMP對涂片鏡檢陰性、液體培養陰性、固體培養陰性的患者具有較高的陽性檢出率[28.78%(120/417)，21.49%(78/363)和25.90%(101/390)]，達到20%～30%；而對于LAMP-TB檢測陰性的標本，涂片鏡檢、液體培養和固體培養檢測則只有不到10%的陽性檢出率[5.11%(16/313)、8.95%(28/313)和7.67%(24/313)]。詳見表6。

表5 兩種培養法陽性結果報告時間與LAMP檢測結果的關系

注 “-”為未統計

表6 LAMP對涂陰、培陰標本的陽性檢出率

注 括號外數值為標本份數，括號內數值為陽性檢出率(%)

討 論

WHO結核病疫情報告指出，每年有大量的結核病患者被漏診，可能因為新發患者病程較短、缺乏明顯的臨床癥狀表現，多在常規體檢中發現肺部影像學改變而就診，此時如果實驗室檢查不能檢出病原菌，臨床醫生往往無法做出結核病診斷，造成延誤治療。目前，很多關于LAMP檢測結核分枝桿菌的研究[12-24]都是對其高的特異度和敏感度的評價，本研究也分析了相關數據，結果與上述文獻相符。然而，對于不同的人群，如病程長短和癥狀嚴重程度等的檢測，LAMP技術與傳統涂片鏡檢和培養法相比較，是否存在明顯的優勢還需要探討。

本研究顯示，LAMP對于不同標本類型的檢測，痰標本無疑是陽性檢出率最高的(51.49%，259/503)，但也發現，對胸腔積液的陽性檢出率也達到了31.63%(31/98)，明顯高于以往我院涂片鏡檢和培養法的結果(根據我院臨床檢驗數據統計結果，我院近3年胸腔積液MGIT 960液體培養共5810例，陽性424例，陽性檢出率僅為7.30%；固體培養349例，陽性15例，陽性檢出率為4.30%；涂片鏡檢4281例，陽性13例，陽性檢出率為0.28%)。上述結果提示傳統涂片鏡檢和培養法對胸腔積液中結核分枝桿菌的檢測效果不理想，導致臨床缺乏診斷結核性胸膜炎的重要證據。造成這種結果可能因為胸腔積液標本是液體性質，涂片時對玻片的附著力較差，在之后的沖洗及脫色過程中極易出現標本脫片現象，直接導致胸腔積液涂片鏡檢的陽性檢出率極低；另外，胸腔積液中結核分枝桿菌載菌量遠低于痰標本，導致液體培養和固體培養的陽性檢出率也不高。而LAMP技術是對結核分枝桿菌的核酸進行特異性擴增，其敏感度高，在胸腔積液檢測方面具有明顯的優勢。

表1，2結果顯示，在臨床未確診的患者中仍然有部分患者的LAMP檢測結果為陽性，因此，我們對全部604例疑似結核病患者的檢測結果進行了分析，并將LAMP檢測結果與涂片鏡檢和培養法進行比較。本研究對患者病程長短的分析發現，當患者病程<1年時，LAMP的陽性檢出率明顯高于涂片鏡檢及培養法(P值均<0.01)；病程為1～5年時，LAMP的陽性檢出率與液體培養差異無統計學意義(P>0.05)，但與涂片鏡檢和固體培養結果差異均有統計學意義(P值均<0.05)；當病程>5年時，LAMP與涂片鏡檢和培養法的陽性檢出率間差異均無統計學意義(P值均<0.05)。同樣，通過對患者臨床癥狀數量的分析發現，當患者癥狀≤5個時，LAMP的陽性檢出率明顯高于其他3種檢測方法(P值均<0.05)；而對于臨床癥狀≥6個的患者，LAMP檢測并無明顯優勢，可能因為癥狀重、病程長的患者多反復治療、遷延不愈，肺部病變較嚴重(如肺部出現空洞等)、排菌量較大，大多可以通過涂片鏡檢和培養法檢出，此時傳統涂片鏡檢和培養法足以保證病原學檢測的有效性，對于這類患者，沒有必要為了追求更高的陽性檢出率而放棄傳統檢測手段。不過，由于本研究的樣本量有限，結論可能存在偏倚，在今后的研究中會增加觀察的樣本量進一步驗證。

眾所周知，標本培養報告陽性結果的時間與標本的載菌量密切相關，標本載菌量越大，培養后報告陽性時間越短。本研究依據MGIT 960液體培養和固體培養報告陽性的時間長短不同對數據結果進行分類，發現隨著報告陽性時間的延長，LAMP對培養陽性標本的陽性檢出率呈下降趨勢，這與以往的研究結果可能有些不符[13]，可能是由于報告陽性時間越長的標本，其載菌量越小，LAMP的陽性檢出率也越低。但是，這樣的結果是否說明LAMP技術的檢測能力低于培養法呢？筆者進而比較了LAMP對涂陰或培陰標本的陽性檢出率，發現陽性檢出率能夠達到20%～30%；而反過來分析發現，涂片鏡檢和培養法對LAMP檢測陰性的標本陽性檢出率只有不到10%，提示LAMP技術的檢測優勢，即對涂陰培陰標本具有很高的陽性檢出率。

研究結果還發現，對于一些培養陽性而LAMP檢測陰性的標本，可能因為此類標本載菌量較低，培養法前處理時加入的樣本量為1～2 ml，遠遠多于LAMP檢測的60 μl，因此培養法比LAMP更易檢測到標本中的結核分枝桿菌，造成培養陽性而LAMP陰性的結果。建議對于這類標本可以在檢測前進行濃縮處理，可以將標本離心后再進行LAMP檢測，這樣可以在一定程度上提高LAMP的陽性檢出率。然而，我們并不能因此就否定LAMP檢測技術的高敏感度，畢竟培養陽性而LAMP檢測陰性的標本是極少的一部分，從標本的總體檢測結果來看，其陽性檢出率還是明顯高于培養法。另外，對于那些培養陰性而LAMP檢測陽性的標本，筆者認為并不是標本中不存在結核分枝桿菌而造成LAMP檢測結果假陽性，而是因為標本載菌量低于培養法的檢測下限，建議對于這部分患者的診斷應積極結合LAMP的檢測結果進行臨床綜合診斷，行診斷性治療后會發現LAMP技術對培養陰性的標本具有很高的陽性檢出率。

通過研究數據分析發現，LAMP技術的優勢在于診斷那些病程短、癥狀較輕、標本含菌量少(甚至是涂陰與培陰的標本)的患者。然而，對于病程長、癥狀重的患者，LAMP檢測在陽性檢出率上并無明顯的優勢，且不能像培養法一樣提供藥物敏感性實驗的結果。故筆者認為，沒有必要將LAMP檢測作為這些患者的常規檢測手段，而是應該把有限的資金用在培養法及藥物敏感性試驗上，為臨床醫生用藥提供科學有效的技術支持。

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(本文編輯：孟莉 薛愛華)

Screening effect of loop-mediated isothermal amplification for suspected tuberculosis

SUNJiao,WANGYue,SUNXiu-hua,PENGJiao,XINGLi-li,SUNBing-qi.

TuberculosisLaboratory,Shenyang10thPeople’sHospital,Shenyang110044,China

SUNJiao,Email:zhiyuanmantian@hotmail.com

Objective To evaluate screening effect of loop-mediated isothermal amplification assay (LAMP) for suspected tuberculosis. Methods A total of 604 suspected tuberculosis patients from Shenyang 10th People’s Hospital between May 2015 and June 2016 were selected, and 604 specimens were collected, including 503 sputum, 98 pleural effusions and 3 bronchoalveolar lavage fluid. All specimens were examined by smear microscopy, solid culture, MGIT 960 liquid culture and LAMP, in order to test the different efficacy of four methods, based on clinical diagnosis. The positive detection rate was analyzed byχ2test, andP<0.05 was considered statistically significant. Results Compared with clinical diagnosis, sensitivities of these four methods were 72.78% (262/360), 51.67% (186/360), 66.67%(240/360) and 59.17% (213/360), respectively; and the specificities were 88.11% (215/244), 99.59% (243/244), 99.59% (243/244) and 99.59% (243/244), what’s more, the consistency was good (Kappavalue were 0.58, 0.46, 0.61 and 0.54, respectively). The positive detection rate of LAMP in patients with short course (less than 1 year) (45.76% (189/413)) was significantly higher than those of smear microscopy (27.12% (112/413)), MGIT 960 culture (37.05% (153/413)) and solid culture (31.48% (130/413)) (χ2=62.41, 16.62, 40.95, respectively, allP=0.000). In patients with less than 5 symptoms, positive detection rate of LAMP (44.37% (268/604)) was significantly higher than those of microscopy (28.15% (170/604)), liquid culture (36.75% (222/604)) and solid culture (32.12% (194/604)) (χ2=76.22, 21.59 and 47.21, respectively, allP=0.000). For smear negative, liquid culture negative and solid culture negative specimens, LAMP also had high positive detection rate (28.78% (120/417), 21.49% (78/363) and 25.90% (101/390), respectively). Conclusion LAMP is more effective than microscopy, liquid culture and solid culture. It is suitable for the screening of suspected tuberculosis patients with short course, mild clinical symptoms (less than 5 symptoms), smear negative and culture negative.

Nucleic acid amplification techniques； Tuberculosis，pulmonary； Multiphasic screening； Comparative study

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.010

110044 沈陽市第十人民醫院結核病實驗室

孫嬌，Email:zhiyuanmantian@hotmail.com

2017-02-13)