葛瑞林對慢性心力衰竭大鼠心肌組織及血液中TRX和ASK1表達的影響

徐建博 張茹冰 陳穎 陳哲 劉雋東 陳振棟

葛瑞林對慢性心力衰竭大鼠心肌組織及血液中TRX和ASK1表達的影響

徐建博 張茹冰 陳穎 陳哲 劉雋東 陳振棟

目的探討葛瑞林（Ghrelin）對慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌組織及血液中硫氧還蛋（TRX）和凋亡信號調節激酶1（ASK1）表達的影響。方法選擇SD雄性大鼠60只，采用結扎左冠狀動脈前降支建立大鼠CHF模型，按隨機數字表法分為對照組和觀察組，各30只。觀察組給予尾靜脈注射Ghrelin，對照組給予尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液。在第2、20、45天時，光鏡和電鏡觀察各組大鼠心肌組織形態學及心肌細胞超微結構情況。第45天時，多道生理儀檢測左心室功能的變化情況；免疫組化法檢測TRX及pASK1表達水平；RT-PCR檢測TRX及ASK1mRNA表達水平。結果HE染色在第2、20、45天時，對照組心肌細胞損傷均比觀察組明顯。第45天時，對照組心肌細胞超微結構損傷比觀察組更明顯；觀察組左心室射血分數（EF）和左心室短軸縮短率（FS）較對照組高（均P＜0.05）；觀察組ASK1免疫組化面積比和ASK1 mRNA表達水平均低于對照組，TRX免疫組化面積比和TRXmRNA表達水平明顯高于對照組（均P＜0.01）。結論Ghrelin可下調CHF心肌組織中ASK1的表達，上調TRX表達，從而改善CHF心臟生物學功能。

心力衰竭心肌病理學心肌細胞細胞凋亡

慢性心力衰竭（CHF）是臨床中常見的心血管疾病，是心血管病的最終歸宿[1]。數據顯示，我國CHF的患病率約為0.9%，且女性多于男性，臨床上對CHF難以逆轉治療。隨著CHF被作為醫學界重點研究的課題，目前CHF的治療途徑已有本質轉變[2]。凋亡信號調節激酶1（ASK1）是近來研究比較熱門的一種細胞轉導通路上啟動細胞凋亡的關鍵蛋白，它在機體功能作用上起到非常重要的作用。心肌組織中硫氧還蛋（TRX）具有抗凋亡、抗氧化、抗炎、保護再灌注損傷等作用。葛瑞林（Ghrelin）是從胃黏膜分離純化的多肽生長激素促分泌受體（GHSR）釋放肽，研究證明Ghrelin具有明顯的心血管保護作用[3]。Ghrelin可上調TRX及下調ASK1的表達，達到改善心功能作用。本研究通過對CHF大鼠進行Ghrelin干預治療，旨在為CHF的預防和治療提供理論依據，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料健康成年SD大鼠（體重250g左右）60只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，每籠飼養5～6只，自由攝食及飲水，飼養環境溫度20℃左右，相對濕度50%左右，光照明暗時間比為1∶1。主要實驗儀器及試劑：TGL-10K離心機（上海圣科儀器設備有限公司）、RM2265切片機（德國LEICA公司）、FA2204C電子天平（常州杰博森儀器有限公司）、UV-2000紫外分析儀（上海科學儀器廠生產）、DYCZ-20A電泳槽（北京市六一儀器廠制造）、JEM-1400透射電子顯微鏡（日本電子公司），Ghrelin[吉爾生化（上海）有限公司，批號：20140307，規格：5mg]、D-Lys3-GHRP-6（美國Cell Signaling公司，批號：150509NOP，規格：5mg）、ASK1（美國Cell Signaling公司，批號：20140907，規格：96T）、TRX（美國Cell Signaling公司，批號：20140313，規格：96T），引物由上海博亞生物技術有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組采用結扎大鼠冠狀動脈前降支建立大鼠CHF模型，所有大鼠禁食12h，禁水6h后，按照3.0ml/kg標準進行10%水合氯醛腹腔注射，麻醉后通過手術將心臟輕擠出，用0號無損傷線結扎大鼠的左前降支，從左向右進針（深度0.3cm，寬度0.2cm），快速縫扎小束心肌，觀測搏動減弱、左心室前壁部分顏色變淺，則模型建立成功，術后給予大鼠青霉素預防感染及保溫，完全蘇醒后送回鼠籠飼養。采用隨機數字表法分為觀察組和對照組，各30只，術后12h，對照組尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液[25μg/（kg·d）]，觀察組尾靜脈注射Ghrelin[25μg/（kg.d）]，給藥周期：模型制備成功后第2～45天。

1.2.2 組織形態學觀察分別在第2、20、45天時，每組取大鼠10只，麻醉（10%水合氯醛）后開胸，在左心房注射5ml 10%氯化鉀，取出心臟并固定（4%多聚甲醛）24～ 48h，切片（厚度：2～3mm）后制作成石蠟，4℃備存。將厚度3μm的切片經HE染色后光鏡觀察。取大鼠心肌組織作為標本，切成長條（1mm×1mm×2mm），2.5%戊二醛和1 %的四氧化鋨進行固定，梯度丙酮脫水進行樹脂包埋，將超薄切片（60nm）采用檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重電子染色15min，采用透射電鏡（加速電壓：60～80kV，放大倍數：6 000～20 000倍），觀察其心肌組織的超微結構。1.2.3心肌組織中TRX和ASK1表達檢測

1.2.3.1采用免疫組織化學方法觀測心肌中TRX和ASK1的表達將石蠟包埋組織切片（厚度3μm），常規脫蠟后，加入3%過氧化氫溶液50μl，在恒溫箱（20℃）孵育10min，對內源性過氧化物酶的活性進阻斷，PBS沖洗3次，加入50μl的一抗，4℃下過夜后，加入二抗，20℃下孵育15min，取DBA試劑盒中的A、B、C試劑加至切片顯色，放入顯微鏡下觀察，顯色后用純凈水洗掉，終止顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。以免疫組化陽性染色面積比來表示TRX及ASK1的表達水平。

1.2.3.2采用RT-PCR技術檢測心肌組織中TRX和ASK1 mRNA的表達（1）取各組大鼠心肌組織100mg，放置在-70℃冰箱備存；（2）嚴格按照Trizol試劑說明書提取心肌組織總RNA；（3）采用Access RT-PCR系統將組織總RNA擴增成DNA目的片段；（4）PCR產物經EB染色和2%瓊脂糖凝膠電泳后，采用紫外分析儀進行觀察，并采用HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統進行定量分析，用TRX和ASK1 mRNA與GAPDH的灰度比值表示TRX和ASK1 mRNA的相對表達水平。

1.2.4 多道生理儀檢測左心室功能的變化情況第45天時測兩組左心室射血分數（LVEF）與左心室短軸縮短率（LVFS）。

1.3 統計學處理采用SPSS 19.0統計軟件，測得計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組組織形態學比較光鏡觀察顯示，第2、20、45天時，對照組心肌結構破壞比觀察組嚴重，梗死部位心肌組織比觀察組變的更薄，毛細血管比觀察組減少明顯；電鏡觀察結果顯示，第45天時對照組心肌纖維斷裂比觀察組重，心肌纖維化比觀察組更明顯（圖1）。

2.2 兩組LVEF和LVFS比較第45天時，觀察組LVEF和LVFS分別為（48.93±1.15）%、（26.54±1.04）%，對照組LVEF和LVFS分別為（36.72±1.27）%、（18.64± 1.12）%，觀察組均明顯高于對照組（均P＜0.05），見圖2。

圖1 兩組組織形態學比較（a、c、e分別為第2、20、45天時光鏡下對照組心肌組織形態學，b、d、f分別為第2、20、45天時光鏡下觀察組組心肌組織形態學；g為電鏡下第45天時對照組心肌組織超微結構情況，h為觀察組心肌組織超微結構情況）

圖2 第45天時兩組大鼠LVEF和LVFS比較

2.3 第45天時兩組大鼠TRX和ASK1表達情況比較見表1、圖3。

表1 第45天時兩組大鼠的TRX和ASK1表達比較

由表1、圖3可見，觀察組ASK1免疫組化面積比和ASK1 mRNA相對表達量均低于對照組，TRX免疫組化面積比和TRX mRNA明顯高于對照組（均P＜0.01）。

圖3 第45天時兩組大鼠TRX和ASK1表達情況（a為觀察組ASK1免疫組化情況，b為對照組ASK1免疫組化情況，c為觀察組TRX免疫組化情況，d為對照組TRX免疫組化情況）

3 討論

隨著我國社會老齡化程度不斷加劇，CHF的發病率也隨之不斷增長。CHF是臨床上一種常見的復雜性綜合征，具有很高的病死率，患者5年生存率與癌癥相接近[4]。CHF誘發原因較多，可包括感染、體力勞動過重、心律失常、情緒激動、輸血或輸液過快過量、嚴重貧血、大出血等原因從而使心臟負荷加重，心臟舒縮功能發生異常，出現血管舒縮功能異常和循環血量障礙[5]。CHF的主要病理機制為內分泌和神經系統被激活，導致心室重構。很多研究顯示，心內的神經-內分泌-免疫調節網絡系統通過嚴密精細的調節機制，使各種細胞因子、神經遞質、激素及神經肽等信息分子相互刺激和制約，從而達到系統內部相對穩定及自我調節[6]。在CHF發生及發展過程中，諸多誘因會使心肌受損，并使三大系統之間穩定性遭到繼發性破壞，導致細胞凋亡及心室重構，形成不可逆的惡性循環。目前CHF的生物學治療已成為熱門的研究課題。

ASK1是有絲分裂原激活蛋白激酶的上游激酶，是細胞絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK）家族成員之一[7]。ASK1在正常的細胞中會受多種蛋白調控，通常為無活性狀態，當機體發生病理變化時，ASK1結合蛋白發生系列改變，從而ASK1被激活，并對炎性細胞因子及應激刺激作出應答，進而激活SEKI-JNK及MKK3/MKK6-p38，發生信號級聯反應，成為細胞凋亡的關鍵因素[8]。相關研究發現，ASK1會參與心肌細胞的存活、生長、增殖、分化、炎癥反應及凋亡，通過激活JNK（ASK1-MKK4/MKK7-JNK）和p38（ASK1-MKK3/ MKK6-P38MAPK），并通過凋亡途徑進而誘導CHF的發生與發展。

TRX系統主要包括TRX、TRX還原酶（TRXR）及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），是一種對抗氧化應激的二硫還原酶系統[9]。TRX系統對細胞存活及功能而言不可或缺，并在細胞死亡、病毒感染及免疫應答中發揮關鍵性作用。TRX是細胞內一種具有多種生物學功能的主要抗氧化劑，且分布廣泛[10]。TRX可通過參與機體氧化還原反應，對細胞的生存和增殖產生影響，并對多種轉錄因子的活性進行調節，參與心肌組織的應激反應，在CHF的病理生理過程中起到重要作用。TRX與ASK1關系密切，是調控ASK1的關鍵調節因子，是ASK1的內源性抑制劑，機體正常時，兩者會緊密結合，當受到炎性細胞因子及應激刺激時，兩者的結合發生松動，從而使ASK1被分離激活。相關研究發現，TRX可降解ASK1，并對ASK1的活性化產生抑制[11]。

上世紀90年代在胃組織中成功提取出Ghrelin，它可刺激機體的食欲，增加攝食量，進而影響脂肪和能量代謝，并會劑量依賴性調節胃酸分泌和胃腸蠕動；Ghrelin可增強機體的免疫及抗炎能力[12]。本研究結果顯示，第45天時，觀察組LVEF和LVFS明顯高于對照組（P＜0.05），這是因為Ghrelin會對血管產生擴張作用，從而減輕后負荷，改善心臟泵血功能，增加LVEF和LVFS，并對心肌細胞起到保護作用，從而改善心臟功能。本研究結果顯示，在第2、20、45天時，通過光鏡可觀察到對照組心肌細胞損傷均比觀察組更明顯；且電鏡發現對照組心肌細胞超微結構損傷要比觀察組更明顯，這可能是因為注射Ghrelin后會維持機體代謝平衡，CHF大鼠的平均動脈壓可受到Ghrelin調節，并能使平均動脈壓降低；Ghrelin可有效抗細胞增殖，可代償性地抑制平滑肌細胞的增生及遷移，減輕心肌損傷并改善心肌萎縮，從而減緩CHF的進展。本研究結果發現，第45天時，兩組大鼠TRX和ASK1表達情況，觀察組ASK1免疫組化面積比和ASK1 mRNA相對表達量均低于對照組，TRX免疫組化面積比和TRX mRNA明顯高于對照組（P＜0.05），這可能因為Ghrelin具有抗炎作用，與抑制IL-8、氧化應激及細胞因子的產生有關；有研究發現，血清活性Ghrelin的水平與氧化應激呈負相關，Ghrelin可間接加固TRX與ASK1的結合，同時促進TRX的釋放效應，從而降低ASK1的活化。

綜上所述，Ghrelin對CHF大鼠心臟功能不全或損傷均具有改善作用，可上調肌組織中TRX并降低ASK1表達，為臨床CHF的治療提供理論依據。

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Effect of Ghrelin on expression of TRX and ASK1 in myocardium and blood of chronic heart failure rats

XU Jianbo,ZHANG Rubing, CHENYing,et al.Department of Critical Care Medicine,First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154002,China

ObjectiveTo investigate the effect of Ghrelin on the expression of thioredoxin(TRX)and apoptotic signal kinase 1(ASK1)in myocardium and blood of chronic heart failure(CHF)rats.MethodsCHF was induced by ligating the left anterior descending coronary artery in 60 male SD rats,then the CHF rats were randomly divided into two groups with 30 animals in each.CHF rats in study group were treated with intravenous injection of Ghrelin;those in control group were treated with intravenous injection of normal saline.The myocardium morphology andultrastructure were observed by light and electron microscopy on d2,d20 and d45 after CHF induced;left ventricular function was evaluated by polygraphy;expression of TRXand ASK1 proteins in myocardial tissue were detected by immunohistochemistry;the expression of TRX and ASK1 mRNA was detected by RT-PCR.ResultsThe myocardial injury of rats on d2,d20 and d45 after modeling in control group was more severe than that in study group.Electron microscopy also showed that the myocardial damage on d45 in control group was more severe than that in study group.(P＜0.05);the left ventricular ejection fraction(LVEF)and left ventricular fraction shortening(LVFS) in study group were higher than those in the control group(P＜0.05).The immunohistochemical ASK1 positive area and the expression ASK1 mRNA in myocardia tissue on d45 in the study group were lower than those in the control group,wile the immunohistochemical TRXpositve area and the expression of TRXmRNA in myocardial tissue were significantly higher than those in the control group(P＜0.05).ConclusionGhrelin can downregulate ASK1 expression and upregulate TRX expression in CHF myocardium,and decrease the content of ASK1 and increase the content of TRX in the blood,so as to improve the biological function of CHF.

Heart failureMyocardiumPathologyCardiac muscle cellsApoptosis

2017-02-27）

（本文編輯：沈昱平）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.13.2017-394

黑龍江省教育廳基礎研究類（自然類）面上項目（JMSUJCM2016-048）

154002佳木斯大學附屬第一醫院重癥醫學科

陳振棟，E-mail：chenzhendong0507@163.com