冠通方對兔心肌缺血再灌注損傷心肌細胞凋亡形態學的影響

韋 斌，王 強，姜 浩，朱志華，陳廣琴，尹 瑋，駱 虹

·基礎醫學論著/研究·

冠通方對兔心肌缺血再灌注損傷心肌細胞凋亡形態學的影響

韋 斌1，王 強1，姜 浩2，朱志華1，陳廣琴1，尹 瑋1，駱 虹1

目的 觀察冠通方對兔心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡的病理變化，進一步證實冠通方對心肌細胞的保護作用。方法 將48只新西蘭大白兔隨機分為假手術組、模型對照組、中藥對照組、冠通方大劑量組、冠通方中劑量組、冠通方小劑量組，每組各8只。各組分別連續灌胃14 d，制備左室心肌病理切片。比較各組病理切片在光鏡下心肌細胞病理形態學結構變化，使用原位末端標記法(TUNEL法)測定各組凋亡細胞指數。結果 冠通方大、中劑量組心肌細胞在光鏡下的結構形態得到較好的保護，冠通方大、中劑量組細胞凋亡指數較模型組顯著下降(P<0.05)。結論 冠通方可以減輕心肌缺血再灌注心肌細胞的損傷，有效減少心肌缺血再灌注后心肌細胞的凋亡，從而達到保護心肌細胞的作用。

心肌缺血再灌注損傷；冠通方；機制研究

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是心臟缺血性病變再通后常見的并發癥，可導致心肌細胞超微結構、功能、代謝及電生理等方面發生進一步損傷，并可出現嚴重的心肌細胞內凋亡基因的表達增高或心肌細胞凋亡。冠通方的近期藥理研究表明[1]：使用冠通方預處理可使缺血再灌注損傷(IRI)大鼠模型的損傷心肌組織中白細胞介素-8(IL-8)表達下降，白細胞介素-10(IL-10)表達增高，有效抑制炎癥機制及壞死機制，起保護心肌的作用。本研究通過后期動物實驗觀察不同劑量的冠通方干預兔心臟再灌注損傷后心肌細胞的凋亡及病理形態改變，進一步驗證了冠通方對心肌細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物 48只新西蘭大白兔，購自廣西醫科大學實驗動物中心[生產許可證號SCXK(桂)2011-0003]，體質量2.5 kg～3 kg，適應性飼養1周后開始分組。

1.2 實驗藥物 冠通方組成：田七45 g，生曬參100 g，丹參150 g，地龍150 g，全瓜蔞150 g，絞股藍150 g，麥冬150 g，陳皮100 g。由廣西中醫藥大學制藥廠按上述配方制成顆粒劑(每包含生藥4 g)，分裝規格為每包3.5 g。復方丹參滴丸(每粒27 mg)，由天津天士力制藥股份有限公司生產(國藥準字Z10950111，生產批號101210)。

1.3 實驗試劑及儀器 TUNEL檢測細胞凋亡試劑盒為德國Roche公司生產，-20 ℃保存，使用前置于4 ℃溶解混合；DAB顯色液試劑盒為北京中杉金橋生物有限公司生產，4 ℃保存，使用前置于室溫與稀釋液以1∶25稀釋混合，現配現用；蛋白酶K溶液為北京中杉金橋生物有限公司生產，-20 ℃保存，使用前置于4 ℃以1∶25稀釋，現配現用；磷酸鹽緩沖液(PBS)為北京中杉金橋生物有限公司生產，粉劑-4 ℃保存，使用前置于37℃與蒸餾水0.01mol/L稀釋，pH為7.2～7.4，現配現用；其余甲醛、酒精、二甲苯等均為國藥集團化學試劑有限公司生產，室溫避光密封保存。全自動脫水機(德國Leica，ASP300S)，石蠟切片機(德國Leica，RM2245)，奧林巴斯顯微鏡(日本OLYMPUS，BX53)，病理圖文攝像頭(日本OLYMPUS，DP73)，小動物呼吸機(北京智鼠多寶生物科技有限公司，DW-3000)。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥 將48只新西蘭大白兔按隨機數字表法隨機分為6組，分別為假手術組、模型對照組、中藥對照組[復方丹參滴丸54 mg/(kg·d)]、冠通方大劑量組[3.6 g/(kg·d)]、冠通方中劑量組[1.8 g/(kg·d)]、冠通方小劑量組[0.9 g/(kg·d)]，每組8只。用藥劑量根據人兔臨床用藥劑量換算公式[2]換算成兔用藥量。實驗動物行分籠飼養，于每天早上灌胃給藥，假手術組和模型對照組予蒸餾水灌胃。各組均連續灌胃14 d，于末次給藥1 h后進行標本采集。

1.4.2 模型建立 經耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后，背位固定，四肢皮下連接心電圖電極，記錄標準Ⅱ導聯心電圖。頸部正中切開皮膚，鈍性分離頸前肌，切開氣管，插入Y型氣管插管， 連接微型人工呼吸機(潮氣量10 mL/kg～15 mL/kg，頻率40次/min)。沿胸骨左緣3～4肋間隙開胸，暴露心臟。采用5～0線結扎冠狀動脈左前降支(LAD)法制備心肌缺血再灌注模型，為避免實驗動物心肌梗死面積過大導致死亡，冠狀動脈阻斷點應在冠狀動脈左前降支向下5 mm～10 mm處選擇結扎位點，以心電圖出現ST段弓背抬高和結扎線以下心肌組織顏色變暗、局部節段性運動不良為結扎成功。待結扎40 min后剪斷手術線實現再灌注，灌注時間為2 h。以缺血區轉紅并反應性充血、收縮活動逐漸恢復、ST段恢復1/2以上為再灌注成功。假手術組只穿線不結扎，余操作同上。

1.4.3 標本采集及指標檢測

1.4.3.1 IRI心肌組織HE染色病理切片 造模實驗結束后，處死兔子，剪下心臟，造模實驗結束后，處死兔子，剪下心臟，取左心室心肌(包括缺血邊緣區、心肌缺血區、冠狀動脈結扎區心肌組織)。將標本置于10%中性甲醛液中固定，經全自動脫水機脫水14 h，常規石蠟包埋，石蠟切片厚4 μm，常規脫蠟至水，進行HE染色、封片，鏡下觀察心肌組織基本病理改變。

1.4.3.2 TUNEL法染色 參考羅氏TUNEL檢測細胞凋亡試劑盒說明書進行，用0.3%過氧化氫溶液封閉30 min；20 mg/L蛋白酶K消化膜蛋白及核蛋白；加入TUNEL反應液，37 ℃孵育60 min；加入FITC標記抗體，DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明，封片。

1.4.3.3 心肌細胞凋亡指數測量 在光鏡下觀察心肌細胞凋亡情況，電鏡下呈棕色顆粒者為染色陽性的凋亡心肌細胞。心肌細胞凋亡指數觀察：每只兔子觀察4張切片，每張切片在高倍鏡下(400×)隨機觀察5個不同視野，每個視野計算凋亡細胞個數和所有細胞個數，以凋亡陽性細胞數/總細胞數的百分比為心肌細胞凋亡指數，取平均值。

2 結 果

2.1 各組心肌組織HE染色病理形態比較 假手術組心肌細胞形態結構完整，細胞排列整齊，無明顯病理損傷。MIRI模型組心肌細胞質增多，細胞腫脹明顯，細胞排列紊亂、橫紋不清，并呈現點片狀壞死灶，提示細胞壞死程度嚴重。冠通方小劑量組可見心肌細胞水腫，排列紊亂，細胞漿增多，有明顯的病理損傷。對照組和冠通方大、中劑量組心肌細胞腫脹較輕，心肌細胞偶有壞死，細胞排列有序。詳見圖1。

假手術組 模型組 中藥對照組

冠通方大劑量組 冠通方中劑量組 冠通方小劑量組

2.2 各組心肌細胞凋亡情況比較 光鏡下呈棕色的心肌細胞核為凋亡的陽性細胞，呈藍色則為非凋亡的陰性細胞。本研究結果表明：冠通方大、中劑量組凋亡細胞數較模型組顯著減少。詳見圖2。各組心肌細胞凋亡指數比較見表1。

假手術組 模型組 中藥陽性對照組

冠通方大劑量組 冠通方中劑量組 通方小劑量組

組別n凋亡指數假手術組80.91±0.32模型組828.13±7.62 中藥對照組812.83±4.611)冠通方大劑量組813.02±5.831)冠通方中劑量組816.37±5.281)冠通方小劑量組821.22±6.14 與模型組比較,1)P<0.01。

3 討 論

細胞凋亡是細胞死亡的一種形式，其參與缺血再灌注損傷的病理過程，是缺血再灌注損傷引起心肌細胞死亡的主要原因，成為缺血再灌注損傷影響組織心臟功能的重要途徑和表現形式。已有許多研究表明，MIRI與細胞凋亡密切相關[3-5]。因此，減少心肌細胞凋亡是減少缺血再灌注心肌損傷的有效途徑。

MIRI中醫病機包括氣虛、血瘀、痰飲不同的病理過程。謝連娣等[6]指出，氣虛導致血瘀和痰飲的形成，血瘀和痰飲導致氣虛程度進一步加重。急性心肌梗死時血液供應驟然停止，失去了血液的濡養和運載；急性心肌梗死時，血栓堵塞血液的正常運行，邪正交爭，正氣損傷；再灌注時突然過多的血液等待運送到組織遠端，增加心臟的負擔，均導致氣虛的形成。心氣虛無力推動血液運行，造成微血管栓塞，形成“血瘀”。氣虛血瘀可以導致水液代謝受到影響，水液留聚，形成“痰飲”。 多數學者亦認為缺血再灌注損傷的過程涉及氣虛、血瘀、痰飲、痰瘀化熱化毒；以氣虛為本，血瘀痰飲為標。

冠通方方中田七善于活血化瘀，消腫止痛，其化瘀血而不傷新血；丹參性寒涼血，又善活血化瘀，清瘀熱，消癰腫，除煩安神；地龍咸寒，善于活血祛瘀通絡，同時又能清熱化痰；瓜蔞甘寒微苦，善于清熱化痰，理氣寬胸，消腫散結，同時又具有潤腸通便，瀉腑安臟之功；生曬參善于大補元氣，同時又有生津之功；絞股藍甘苦性寒具有益氣養陰，消熱解毒，清熱祛痰之功；麥冬甘苦微寒，清熱養陰生津；陳皮辛散溫通，善于行氣燥濕化痰。諸藥合用則具有益氣養陰，清熱解毒化痰，行氣活血化瘀通絡之功[7]。田七又名三七，主產于云南、廣西等地。現代基礎研究表明：三七中含有三七總皂苷(PNS)，三七的主要成分是三七總皂苷，已經有報道關于PNS有良好的抗氧化作用[8]，并能抵抗自由基對心肌缺血再灌注后導致的心肌細胞損傷。此外，三七皂苷可抑制脂質過氧化反應，減輕心肌細胞的受損情況，增強抗氧化效果，并具有抑制血小板聚集，促進纖維蛋白溶酶的活性，降低血液黏度，促進血栓溶解，改善血液流動的作用。顧國嶸等[9]通過酶學、形態學、免疫組織化學等研究表明，PNS缺血預處理24 h后能明顯減少缺血-再灌注導致的心肌細胞壞死和凋亡，對缺血-再灌注心肌起到延遲保護作用，證明三七治療缺血性心臟病的基礎。PNS能擴張冠脈，增加心肌營養血流量，改善心肌微循環，明顯降低心肌耗氧量。同時PNS的抗脂質過氧化作用也是其保護缺血-再灌注心肌的重要方面。丹參的抗氧化成分有丹參酮類、丹參素、丹酚酸類化合物、原兒茶醛、咖啡酸及迷迭香酸，有研究指出[10-11]，丹參酮ⅡA可抑制細胞膜上的NADH/NADPH氧化酶的激活，提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性，清除氧自由基并抑制脂質過氧化反應，發揮保護血管內皮細胞的作用。研究表明[12]丹參凍干粉對經皮冠狀動脈介入治療(PCI)后MIRI有保護作用，其可能的機制是抑制炎癥反應，改善內皮功能。

本研究通過冠通方對兔MIRI心肌細胞凋亡研究時發現，冠通方可有效發揮心肌細胞保護作用，使MIRI細胞凋亡趨勢下降、減少心肌病理損傷，為心肌細胞后期修復打好了堅實的基礎。冠通方對MIRI損傷心肌的保護作用是多機制、多靶點、綜合作用，因此冠通方對心肌細胞的保護機制依然需要后續探索研究。

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(本文編輯郭懷印)

The Influence of Guantong Decoction on Pathologic Morphology and Myocardial-Cell Apoptotic Index in Rabbits with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

Wei Bin，Wang Qiang，Jiang Hao，Zhu Zhihua，Chen Guangqin，Yin Wei，Luo Hong

Ruikang Hospital，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530011，Guangxi，ChinaCorresponding Author:Wang Qiang

Objective To observe the effect of Guantong decoction(GTD) on pathologic morpho logy in rabbits with myocardial ischemia reperfusion injury .Methods Forty-eight New Zealand white rabbits were randomly divided into 6 groups，namely sham group，normal control group，GTD high dose group，GTD moderate dose group，GTD low dose group and drug control group.The rabbits were taken medicine for 14 days with designated drugs.GTG groups were taken different dose medicine of GTD，and sham operation group and normal control group were pretreated by distilled water.The model of myocardial ischemia-reperfusion injury were established by ligating the left anterior descending artery of New Zealand rabbits for forty minutes after taken medicine for one hour and no coronary artery injury were in sham group.The heart were made into pathological sections and stained with HE and TUNEL.Apoptotic index was detected with electron microscope in times of four hundreds.Results Myocardial injury cells and apoptotic index of GTD high dose group and moderate dose group were less than normal control group and GTD small dose group (P<0.05).Conclusion GTD can effectively protect myocardial cell in rabbits with myocardial ischemia reperfusion injury.

myocardial ischemia reperfusion injury；Guantong decoction；mechanism research

國家自然科學基金項目(No.81160436)

1. 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院(南寧530011)；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院

王強，E-mail: wq7212@163.com

信息：韋斌，王強，姜浩，等.冠通方對兔心肌缺血再灌注損傷心肌細胞凋亡形態學的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(13)：1569-1572.

R542.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.13.008

1672-1349(2017)13-1569-04

2017-02-16)