小鼠皮膚心臟聯合移植模型的建立及移植物功能監測

胡 鈺，吳大威，翟秀宇，陳 默，王遠濤*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 病理科，吉林 長春130033；2.吉林大學第一醫院 泌尿外二科)

小鼠皮膚心臟聯合移植模型的建立及移植物功能監測

胡 鈺1，吳大威2，翟秀宇2，陳 默2，王遠濤2*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 病理科，吉林 長春130033；2.吉林大學第一醫院 泌尿外二科)

目的 探討小鼠皮膚心臟聯合移植模型的建立及移植物功能的監測。方法 以BALB/C小鼠、C57BL/6小鼠做為供、受者，單純皮膚移植組采用尾-背法行皮膚移植，單純心臟移植組采用腹腔異位心臟移植法行心臟移植，皮膚心臟聯合移植組序貫采用尾-背皮膚移植及腹腔異位心臟移植模型。術后采用腹部觸診的方法，監測心臟移植物功能，通過觀察殘存移植皮片大小，監測皮膚移植物功能。結果 皮膚心臟聯合移植組皮膚移植物存活時間較單純皮膚移植組略有延長(皮膚心臟聯合移植物v.s.單純皮膚移植組，8天v.s.7天)，但兩組皮膚移植物存活時間比較沒有顯著差別(P=0.1290)。單純心臟移植組心臟移植物和皮膚心臟聯合移植組心臟移植物平均存活時間均為9天(MST=9天)，兩組心臟移植物存活時間無顯著差別(P=0.6077)。結論 小鼠皮膚心臟聯合移植模型穩定，移植物功能監測簡單方便，適用于移植免疫學方面的研究。

移植；模型；小鼠

(ChinJLabDiagn,2017,21:1256)

隨著分子生物學技術的發展，出現了各種轉基因和基因敲除小鼠，為研究移植免疫反應提供了更多的工具。1973年Corry等[1]建立了小鼠腹部心臟移植模型，因其屬于血管化器官移植模型，排斥反應強度中等，術后監測簡便，且小鼠具有品系較純、試劑來源廣、免疫學檢測方便等優點，現已廣泛應用于移植免疫學研究中。而小鼠皮膚移植模型是研究免疫排斥反應的基本方法之一[2]，皮膚移植物內有含有較多的樹突狀細胞，因此最容易發生快速且嚴重的排斥反應，所以在移植免疫學研究中常用皮膚移植來檢測排斥或耐受[3]。本實驗借鑒了原有的皮膚及心臟移植手術技術，建立了小鼠皮膚心臟聯合移植模型，沒有增加手術難度，結果穩定，移植物功能監測簡便，為移植免疫學研究提供了一種新的小鼠模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

C57BL/6小鼠60只,BALB/C小鼠45只，均為雌性，約6-8周齡,體重約20 g左右，所有試驗用小鼠均來源于吉林大學第一醫院動物實驗中心。單純皮膚移植組：BALB/C小鼠5只作為供體，C57BL/C小鼠20只作受體，單純行尾-背皮膚移植；單純心臟移植組：BALB/C小鼠20只作為供體，C57BL/C小鼠20只作受體，單純行腹部異位心臟移植。皮膚心臟聯合移植組：BALB/C小鼠20只作為供體，C57BL/C小鼠20只作受體，先行尾-背皮膚移植后，立即行腹部異位心臟移植。

1.2 手術器械及試劑

手術顯微鏡一臺購于日本徠卡公司;顯微手術器械購于德國Roboz公司;10-0血管縫合線購自美國Ethicon;其他絲線均購自上海醫用縫合線廠;油沙條購于美國 Gauze，邦迪創可貼購于美國Johnson。水合氯醛及肝素由吉林大學基礎醫學院提供。

1.3 小鼠腹部異位心臟移植方法

1.3.1 供心制備 麻醉采取4%水合氯醛(10-12 μl/g) 腹腔注射。供鼠麻醉成功后,供鼠取仰臥位，四肢向外伸展后用3M貼固定于鼠板上。術區剃毛、消毒后，取劍突下至恥骨聯合縱行切口進入腹腔,撥開腸管顯露下腔靜脈，并經下腔靜脈注入1%肝素鹽水0.3 ml肝素化，剪斷腹主動脈并向上剪開胸骨、膈肌，暴露心臟。6-0絲線結扎下腔靜脈，集束結扎右肺門處脈管后去除右肺。于肺動脈分叉處橫斷；30G細針穿刺升主動脈，以10 ml冰鹽水灌洗心臟，并于頭臂干分支處切斷主動脈。集束結扎心臟周圍剩余脈管。取下供心并置于4℃冰鹽水中保存備用。

1.3.2 受體手術 受鼠麻醉后固定于鼠板。術區剃毛、消毒后，經腹正中切口進入腹腔。向右上推開腸管,并用濕鹽水紗布覆蓋，充分顯露腎動靜脈至髂血管水平的下腔靜脈及腹主動脈。血管夾同時阻斷下腔靜脈及腹主動脈，分別于腹主動脈及下腔靜脈做縱行切口，切口長度與供心主動脈及肺動脈寬度一致，采用兩點固定，連續縫合。吻合完畢后,緩慢松開血管夾，棉簽輕觸心臟，促進供心復跳。關閉腹腔，腹部切口絲線連續縫合，受鼠置于燈下保溫至蘇醒。術后不限食水。

1.3.3 移植心功能監測 術后第3天開始行腹部移植心觸診，根據移植心跳動由強到弱分為4-0級，每日記錄，以指尖不能觸及移植心跳動作為移植心排斥的時間。

1.3.4 小鼠尾-背皮膚移植方法 切取供鼠尾巴，縱行剖開，取尾部全層皮膚，制備成大小約1×1 cm2的皮片備用。麻醉后受鼠背部剃毛，并剪掉與備用皮片相等大小的背部全層皮膚，5-0絲線四角固定移植皮片，油紗布覆蓋皮片，邦迪創可貼將油紗布固定。3天后拆除創可貼，觀察移植皮片存活情況，皮膚移植物排斥早期會在移植皮片上出現潰瘍、壞死，部分融合成片，隨后壞死的部分皮膚出現干燥、結痂，當殘存正常的移植皮片小于原皮片的20%時判定為排斥。

1.3.5 小鼠皮膚心臟聯合移植方法 受鼠先行尾-背皮膚移植，隨后翻身即刻行腹部異位心臟移植，具體方法同前描述。

2 結果

2.1 一般手術情況

本研究單純皮膚移植組共行皮膚移植20例，術后1例因小鼠自身撕咬導致移植物脫落，手術成功率為95%(19/20)，手術時間為5.15±0.27 min；單純心臟移植組共行手術20例，其中1例術中復跳不佳，1例出現吻合口出血，手術成功率為90%(18/20)，手術時間為57.60±1.38 min；皮膚心臟聯合移植組共完成手術20例，其中1例術中出現心臟移植物吻合口出血，1例出現麻醉意外，手術成功率為90%(18/20)，手術時間為62.10±1.66 min，與單純心臟移植組比較，兩組手術時間差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 皮膚移植物存活情況

單純皮膚移植組皮膚移植物MST為7天，而皮膚心臟聯合移植組皮膚移植物中位存活時間略有延長(MST=8天)，但兩組間差異無統計學意義(P>0.05)(見圖1)。

圖1 小鼠皮膚移植物存活曲線

2.3 心臟移植物存活情況

單純心臟移植組和皮膚心臟聯合移植組手術成功36例，術后5天開始兩組心臟移植物均出現不同程度的搏動減弱，移植心體積增大，兩組心臟移植物MST均為9天(見圖2)，無統計學差異(P>0.05)。

圖2 小鼠心臟移植物存活曲線

2.4 移植物病理結果

皮膚移植物排斥期間均可見移植皮片壞死、潰瘍、結痂，HE染色顯示殘存的皮膚移植物組織層次及附屬物結構不清，局部可見片狀壞死及大量單核細胞浸潤(見圖3)。

圖3 皮膚移植物HE染色結果

心臟移植物行H&E染色，觀察移植心內炎性細胞浸潤情況?？梢娦募〖毎帕形蓙y，間質水腫，心臟移植物內可見大量單核細胞浸潤(見圖4)。

圖4 心臟移植物HE染色結果

3 討論

皮膚移植物中含有的蘭格漢斯細胞，是一種抗原提呈能力很強的樹突狀細胞，能將抗原迅速提呈給受體效應性T細胞，主要通過Ⅰ類抗原提呈途徑介導快速的皮膚移植物排斥反應，與其他血管化的大器官移植相比，小鼠皮膚移植發生的排斥反應更加快速而猛烈，因此，皮膚移植也是各類同種異體器官或組織移植中最難成功的。但皮膚移植操作相對簡單，移植物存活觀察方便，所以在移植免疫的實驗研究中常用做首選的觀察方法[4]。皮膚移植的方法很多，傳統的背-背皮膚移植法需要將皮下組織去除，皮片處理花費時間較長；耳-背皮膚移植法操作簡單，但皮片較小，數量有限。本研究采用的是尾-背皮膚移植法，一個供體尾部皮膚取材后可以給5個受體行皮膚移植，而且采用四角固定，邦迪創可貼覆蓋，大大減少了由于受鼠自身撕咬造成的移植物脫落，本研究中皮膚移植40例，僅1例出現上述情況，成功率高，手術時間僅5分鐘左右，速度快，效果滿意。

而小鼠異位心臟移植屬于血管化器官移植，更貼近臨床器官移植，且主要通過Ⅱ類抗原提呈途徑將移植物抗原提呈給受者效應性T細胞，現已被越來越多的應用于移植免疫的實驗研究。以往由于設備、器械和技術條件所限，心臟移植模型更多采用頸部血管套管心臟移植，即使用自制套管將受鼠頸部血管與供心血管連接[5]，雖然無需外科精密的血管吻合技術，但由于頸部空間相對較小，且需使用套管，容易形成血栓，套管與連接處易折曲，影響供心血供，移植心觸診困難，這些都可以對實驗結果造成影響，因此,目前國外大多推薦采用腹部異位移植模型[6]。本研究采用的為腹部異位心臟移植模型，40例心臟移植中僅3例出現外科情況導致失敗，相比國內外相關研究，成功率高。

本研究還首次建立了皮膚心臟聯合移植模型，皮膚心臟聯合移植組與單純心臟移植組的手術時間無明顯差別，說明聯合移植并沒有增加移植的技術難度，并沒有顯著延長術者的操作時間。皮膚心臟聯合移植組皮膚移植物排斥時間與單純皮膚移植組比較略有延長但無統計學差異，說明移植物排斥可能與移植物的大小、體積有關[7]，聯合移植組不僅要排斥皮膚移植物，還要排斥同源的心臟移植物，所需要的效應細胞數量巨大，所以造成效應細胞的相對不足，皮膚移植物排斥時間略延長。移植物病理提示出顯著的皮膚及心臟移植物排斥反應，說明此聯合移植模型完全適用于移植排斥反應的監測和相關研究。

因為皮膚移植和心臟移植抗原提呈的途徑不盡相同，免疫反應的機理不同，可能對移植物的排斥反應、免疫耐受的誘導造成影響，而本研究中皮膚心臟聯合移植模型的建立，為移植免疫學的實驗研究建立了一個全新的模型，為研究者提供了一個新的選擇，且技術難度不大，成功率高，移植物排斥反應監測簡便，結果確切，值得推廣。

[1]Corry RJ，Winn HJ，Russel PS．Primarily vaseularized allografts of hearts in mice．The role of H-2D．H-2K，and non-H-2 antigens in rejection[J]．Transplantation，1973，16(4)：343.

[2]Billingham RE,Medawar PB.The Technique of Free Skin Grafting in Mammals[J].J Exp Biol,1951,28:385.

[3]樊擁軍，張鳳蘊，張 飚，等.一種簡單的小鼠皮膚移植方法[J]．哈爾濱醫科大學學報，2000,34(5)：332.

[4]成 功，陳 明，孫則禹，等.建立小鼠皮膚移植排斥模型穩定獲得記憶T細胞[J]．中國比較醫學雜志,2008,18(4):32.

[5]Chen HA.New technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice[J].Transplantation,1991,52(6):1099.

[6]Demir Y,Chen Y,Metz C,et al.Cardiac allograft rejection in the absence of macrophage migration inhibitory factor[J].Transplantation,2003,76(1):244.

[7]Ulusal BG,Ulusal AE,Wei FC，et al.Allograft mass as a possible contributing factor to the skin transplant outcome[J].J Surg Res,2010,161(2):321.

Skin Plus Heart Transplantation In Mice And Graft Monitoring

HUYu,WUDa-wei,ZHAIXiu-yu,etal.

(DepartmentofPathology,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To explore the technique of mouse skin plus heart transplantation and the function of graft monitoring.Methods Methods:BALB/C and C57BL/6 mice were used as donors and recipients,respectively.Skin only group:C57BL/6 recipients

tail skin from BALB/C donors.Heart only group:C57BL/6 recipients received heart grafts from BALB/C donors.Skin plus heart group:C57BL/6 recipients received heart and tail skin grafts from BALB/C donors at the same time.Heterotopic palpation was performed to monitor the function of heart graft after transplantation,the function of skin grafts were monitored by observing the size of surviving grafts.Results Median survival time (MST) of skin grafts in skin only group was 7 days,the skin grafts survival time have slightly longer compared to skin only group,but there were no significant difference(MST=8 days,P=0.1290).There were no significant difference of heart grafts survival time in both heats only group and skin plus heart group(MST=9 days,P=0.6077).Conclusion Skin plus heart transplantation procedure is stable to perform.Heterotopic palpation of hearts grafts and observing the size of skin grafts are simple to monitor the function of grafts.The skin plus heart transplantation model by using this procedure and monitoring protocol is useful for immunological research related to transplantation.

Transplantation;model;mouse

國家自然科學基金(81671574)

1007-4287(2017)07-1256-04

R654.2

A

胡鈺，醫學博士，主治醫師。

2017-03-20)

*通訊作者