原發性骨質疏松癥腎陽虛證骨組織全基因表達譜研究

李生強 馮爾宥 謝冰穎 謝麗華 陳娟 許惠娟 葛繼榮*

1. 福建省中醫藥研究院基礎醫學研究所骨質疏松證候基因組學研究室，福建 福州 350003 2. 廈門大學附屬福州市第二醫院關節外科，福建 福州 350007

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是老年人中的常見病、多發病，是以骨量減少、骨組織微細結構破壞導致骨脆性增加和骨折危險性增加為特征的一種系統性、全身性骨骼疾病。中醫學把骨質疏松癥歸為“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范疇[1]，主要是由于腎精不足、骨失滋養導致的全身骨骼的慢性退行性疾病，腎虛是其核心病機。在臨床上以腎陰虛證、腎陽虛證及陰陽兩虛證較為常見[2]。腎陽，又稱命門之火，為人體陽氣之根本，腎陽虛的程度與疾病的發生發展有緊密的聯系，但腎陽虛證的本質仍有待進一步研究。

高通量組學技術的發展為中醫證本質的研究提供了新的技術平臺。課題組前期已從外周血入手，采用芯片技術分析骨質疏松癥腎陽虛證的基因表達譜特征。本實驗采用人全基因組表達譜芯片檢測骨質疏松癥腎陽虛證的骨組織基因表達譜，與骨質疏松癥腎陰虛證組、骨質疏松癥無腎虛證組和正常骨密度對照組比較，篩選骨質疏松癥腎陽虛證與其他3組的共同差異基因，探討腎陽虛證相關基因的信息學特征。

1 材料和方法

1.1 研究對象

從福州市第二醫院門診隨機選擇即將進行髖關節置換術的患者，檢測骨密度，依據中醫辨證分型，將原發性骨質疏松癥患者分為腎陽虛證組3例、腎陰虛證組3例、無腎虛證組3例，正常骨密度對照組3例，共12例，年齡52～68歲，平均(62.35±4.64)歲。

納入標準：①符合骨質疏松癥診斷標準者，參照《中國人骨質疏松癥建議診斷標準(第二稿)》[3]；②符合中醫證候診斷標準者，參照全國中西醫結合虛證與老年病研究專業委員會1986年制定的《中醫虛證辨證參考標準》[4]；③患者均知情同意。排除標準：①不符合西醫診斷及中醫辨證標準者；②繼發性骨質疏松癥者；③合并有心腦血管、胃腸道等嚴重疾病者；④肝、腎功能檢查異常者。

1.2 主要儀器和試劑

雙能X射線骨密度儀(美國Hologic Discovery WI)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，RNEASY Mini Kit(QIAGEN公司)，人4×44K全基因表達譜芯片(Agilent公司)，核酸檢測儀Nanodrop ND-1000 (美國Thermo scientific公司)，芯片雜交爐(Agilent公司)，基因芯片掃描儀Agilent DNA Microarray Scanner(Agilent公司)。

1.3 骨密度測定

采用美國Hologic Discovery WI型雙能X線骨密度儀(精度：<1%)檢測患者腰椎正位(L2-4)、大轉子和Ward’s區骨密度(g/cm2)。

1.4 RNA提取及質量驗證

從髖關節置換術取下的人股骨頭中，取硬質骨1 g，迅速置于液氮中保存。使用Trizol一步法提取人骨組織中的總RNA，通過Nanodrop ND-1000讀取260 nm和280 nm處的吸光度值(A)，測定RNA溶液的純度。經l%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀察，檢測RNA的完整性。

1.5 cDNA/aRNA樣品合成和標記

總RNA經線性化擴增后，cy3-UTP標記，熒光標記后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit純化，用Ambion的RNA Fragmentation Reagents對標記好的cRNAs進行片段化處理。

1.6 基因芯片雜交及掃描

采用美國Agilent公司的人全基因表達譜芯片(4×44K基因)，在芯片雜交爐中65 ℃雜交17 h，然后洗脫、染色。最后用Agilent DNA Microarray Scanner掃描儀掃描。

1.7 芯片數據處理與分析

雜交后的芯片經芯片掃描儀讀取數據點后，將數據導入分析軟件，對于兩組比值的自然對數絕對值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達基因。共同差異表達基因是在獲得多組差異表達基因的基礎上，采用Excel的函數vlookup進行分析獲得。最后通過NCBI、OMIM、DAVID、KEGG等數據庫對差異表達基因進行相關功能分析。

1.8 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨質疏松癥腎陽虛證差異表達基因的篩選

骨質疏松癥腎陽虛證組與正常對照組相比，篩選差異表達基因2631條，其中表達上調1118條，表達下調1513條；骨質疏松癥腎陽虛證組與腎陰虛證組相比，篩選差異表達基因3976條，其中表達上調1622條，表達下調2354條；骨質疏松癥腎陽虛證組與無腎虛證組相比，篩選差異表達基因6184條，其中表達上調2581條，表達下調3603條。骨質疏松癥腎陽證組與其他3組的差異基因中，1037條為共同差異表達基因。這些差異表達的基因為腎陽虛證的特異表達基因，其中上調的有486條，下調的有551條。按功能對其進行大致分類，可分為免疫相關、通道轉運蛋白、骨鈣代謝相關基因、信號轉導、轉錄調控等幾類(見表1)。

表1 原發性骨質疏松癥腎陽虛證與其他3組骨組織比較部分差異基因Table 1 Differentiated genes in the bone tissue in primary osteoporosis with kidney-yang deficiency syndrome

2.2 骨質疏松癥腎陽虛證組與其他3組比較的共同差異表達基因GO基因信息學分析

對1087條差異表達基因進行GO基因信息學分析，發現這些差異表達基因參與了137個生物學代謝途徑，其中主要包括：參與生物過程調節，如發育過程調節、多細胞機體調節、生物合成過程調節；參與分子功能，如生長因子結合，多糖、激素受體結合等。此外，這些差異基因還是細胞的重要化學組成，如細胞外基質、細胞外區域等。

2.3 骨質疏松癥腎陽虛證差異表達基因Pathway分析

在kegg網站對差異表達基因進行pathway分析，發現這些基因參與了22條信號通路，補體與凝血級聯反應、Hedgehog、TGF-beta、細胞周期、維生素消化與吸收、神經活性的配體-受體相互作用等22條信號通路。

3 討論

“證”是中醫對疾病某一階段機體整體反應狀態的病理概括[5]，它是整體病理狀態的反映，是復雜交錯動態變化的。“證”是辨證論治的起點和核心，證本質的研究是中醫現代化研究的熱點與難點，如能獲得突破性進展，必將使中醫理論研究取得質的飛躍。

過去幾十年，國內學者從生化指標、基因多態性、單基因表達等方面進行腎陽虛證本質研究，取得了一定成績。但由于研究手段、規模的限制，至今未能取得實質性進展。基因芯片等組學技術的發展為中醫微觀整體提供了強大的工具。沈自伊院士[6]提出，遵循中醫學研究本身的內在規律，充分利用功能基因組學的研究成果，建立中醫證的表達譜，將是21世紀中醫藥學的主要發展趨勢。沈自伊院士采用以藥測證的方式對腎虛和腎陽虛大鼠的下丘腦、腎上腺、垂體及淋巴細胞的基因表達譜進行比較研究，認為腎陽虛證的主要物質基礎是甲狀腺激素促進能量代謝的氧化磷酸化過程[7]。

與血液分離白細胞相比，從骨組織中直接提取總RNA研究骨質疏松癥更能整體、客觀地反映骨組織內基因表達的情況，更能了解活體中的骨代謝狀態。因此，本研究采用病證結合的方式，以全基因表達譜芯片技術對骨質疏松癥腎陽虛證進行其分子實質的探索。與前期課題組從血液細胞進行研究的腎陰虛證、腎陽虛證基因芯片結果[8-9]相比，骨組織基因芯片差異表達的基因數目更多，涉及的信號通路也更多，原發性骨質疏松癥腎陽虛證的相關基因與與補體與凝血級聯反應、Hedgehog、TGF-beta、細胞周期等多種信號通路均相關。

3.1 免疫功能相關基因

差異基因中參與免疫調節、炎癥反應的基因有：C2、C3、C6、IL7、MAL2、LSP1、VPREB1、CD52、BCL11A等。前面6條基因表達均呈下調趨勢。本實驗結果顯示腎陽虛證免疫代謝相關基因表達水平下調，提示骨質疏松癥腎陰虛證患者免疫水平降低，這一點與筆者前期腎陰虛證的發現是一致的[8]，但參與免疫功能的基因并不相同。已有許多研究表明，免疫力低下是腎陽虛證的表現之一。譚從娥[10]從腎陽虛證患者外周血入手，篩選到腎陽虛證顯著表達基因70條，其中18條與免疫相關，認為腎陽虛證患者存在免疫功能異常，免疫功能基因的異常表達是腎陽虛證發生的分子基礎之一。后譚從娥又以方測證的思路，采用右歸丸治療，建立右歸丸療效相關的差異表達基因功能網絡，認為調節機體的免疫功能是右歸丸治療腎陽虛證的重要療效機理之一[11]。本研究免疫相關的9條基因中，除6條基因表達下調外，另外3條基因表達上調，提示腎陽虛患者存在體內免疫功能紊亂。

3.2 通道、轉運蛋白相關基因

與通道、轉運蛋白相關的基因有：TMEM90B、SLC5A6、SLCO1C1、SLCO4A1、SLC6A16、SLC11A1、SLC22A15、TM7SF4、KCTD15、P4HTM等。鈉鈣交換蛋白是廣泛存在于動物細胞膜上的一種離子轉運蛋白，通過將細胞內的Ca2+泵出以及反向轉運將細胞外的Ca2+泵入維持細胞內Ca2+濃度的穩態，從而滿足細胞功能活動對Ca2+的需求[12]。鉀離子通道四聚化結構域KCTD15 基因屬于KCTD 家族成員之一[13]，其基因功能與生物膜和細胞骨架有關，且能夠影響細胞能量代謝過程期。階段敲低 KCTD15 基因能抑制3T3-L1 脂肪前體細胞分化[14]，說明它可能影響間充質干細胞的成骨分化。編碼通道、轉運蛋白的基因出現下調，表明腎陽虛患者離子交換與運輸均出現了紊亂，影響了骨代謝。

3.3 骨鈣代謝相關基因

與骨代謝相關的基因有：ESRRA、PCDHB5、PCDHB6、PCDHB15、MAST4、BMP4、BMP8A、OGN、POSTN、S100A9、PRG2、MICAL1等。PCDHB5,6,15是原黏粘蛋白beta家族簇成員，這些神經類細胞黏粘蛋白是膜蛋白，其具體功能未知，但是它們有可能在特定的細胞與細胞間的神經連接的建立上發揮關鍵作用。BMP4,8A是BMP家族成員，屬于TGF-beta超家族，與骨的代謝具有十分密切的關系[15]，在卵巢切除骨質疏松癥大鼠模型中，BMP4蛋白水平降低。它們在人類軟骨內成骨形成的發病中起著重要的作用，還參與肌肉發育、骨礦化等過程。POSTN在許多組織中都存在，作為成骨細胞及其前體細胞分泌產生的一種黏附分子，POSTN 可促進成骨細胞及其前體細胞在骨膜聚集、分化[16]。此外，它還被認為是機械應力相關基因[17]，腎陽虛證組PCDHB5,6、BMP4以及POSTN表達水平均降低，影響了成骨細胞的分化，加速骨的流失。

總之，本研究在骨質疏松癥與中醫證型相結合的基礎上，應用基因芯片技術研究絕經后骨質疏松癥腎陽虛證的基因表達譜。結果表明，絕經后骨質疏松癥腎陽虛證與免疫、骨鈣代謝、細胞信號轉導等相關，與其他疾病的腎陽虛證有相似之處，但也有自己的特點，這可能與筆者取材來自骨組織有關。腎陽虛證患者多免疫力低下的分子實質可能與免疫功能相關基因表達下降相關；而在其他骨鈣代謝、離子通道、轉運蛋白等相關基因方面，也表現出基因表達的紊亂。本研究只是對原發性骨質疏松癥腎陽虛證關聯基因的初步探討，今后筆者將以“異病同證”為思路，同時從其他疾病的腎陽虛證入手，進一步探討腎陽虛證的分子內涵。