L型鈣離子通道阻滯劑貝尼地平對去卵巢小鼠骨代謝的研究

馬忠平 黃健 張志峰 楊云 葉楠

內蒙古醫科大學第二附屬醫院關節外科，內蒙古 呼和浩特 010030

骨質疏松癥作為臨床上最為常見的骨代謝異常狀態，以骨密度下降為主要特點，常常增加患者的骨折風險[1]。國外研究提示，高血壓病和骨質疏松癥存在著密切的聯系，絕經期后婦女骨量丟失明顯加速，骨形成明顯不足，而老年高血壓病患者體內持續的高血壓狀態引起血管硬化損傷，加速骨量流失[2]。貝尼地平是臨床上常用的L型鈣離子通道阻滯劑，在降低血壓的同時對成骨細胞有明顯的促進成骨作用[3]，但該藥物對骨代謝作用至今仍未見報道。

1 材料和方法

1.1 材料

雌性10周大C57/BL6小鼠，體重20～23 g，購至內蒙古農業大學實驗動物中心；主要實驗儀器與試劑：(1)主要儀器：倒置光學顯微鏡(Nikon，TE2000-U)，熒光顯微鏡(Olympus，FV-1000)，顯微CT(SCANCO Medical，μCT80)，石蠟切片機(Leica公司)。(2)主要試劑：一抗Runx2(CST公司)，一抗OCN(CST公司)，偶聯異硫氰酸熒光素山羊抗兔二抗(Abcam公司)，伊紅(Sigma公司)，蘇木素(Sigma公司)，乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA，Sigma公司)，甘油(Sigma公司)。

1.2 動物飼養與造模

隨機將30只10周大C57/BL6小鼠平分為3組，分別為：假手術組(Sham)10只，去卵巢組(OVX)10只，去卵巢加藥組(OVX+BD)10只；假手術組切除卵巢周圍少量脂肪墊后縫合，去卵巢組完整切除雙側卵巢，去卵巢加藥組在完整切除雙側卵巢后灌胃貝尼地平20 mg/(kg·d)。所有小鼠正常飲食，常規飼養3個月后，斷頸處死，取股骨4 ℃下4%多聚甲醛固定24小時，EFTA-甘油溶液4 ℃脫鈣1個月。

1.3 組織學檢測

股骨石蠟包埋，切片(厚度5 μm)，行伊紅蘇木素染色，倒置光學顯微鏡觀察股骨下段骨小梁數量，拍照，Image-Pro Plus(version 6.0，IPP，美國)軟件測量骨小梁作色區域面積定量。

1.4 顯微CT掃描

標本固定后行顯微CT掃描股骨下段，掃描厚度20 μm，骨小梁三維重建后定量骨密度(bone mineral density，BMD)，骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)，骨小梁數量 (trabecular number,Tb.N).

1.5 免疫組織化學

股骨切片脫蠟至水，微波抗原修復10 min，0.25%Triton X-100 室溫破膜30 min，1×TBST清洗3遍，每遍5 min，5%BSA常溫封閉20 min，RUNX2一抗(1∶50)4 ℃孵育過夜，1×TBST清洗3遍，每遍5 min，二抗(1∶50)室溫孵育1小時，1×TBST清洗3遍，每遍5 min，DAB顯色，蘇木素復染，倒置顯微鏡觀察，拍照, Image-Pro Plus(version 6.0，IPP，美國)軟件計數染色陽性細胞數。

1.6 免疫熒光檢測

股骨切片脫蠟至水，微波抗原修復10 min，0.25%Triton X-100 室溫破膜30 min，1×TBST清洗3遍，每遍5 min，5%BSA常溫封閉20 min，OCN一抗(1∶50)4 ℃孵育過夜，1×TBST清洗3遍，每遍5 min，偶聯異硫氰酸熒光素山羊抗兔二抗二抗(1∶50)室溫孵育1小時，1×TBST清洗3遍，每遍5 min，帶DAPI封片劑封片，熒光共聚焦顯微鏡觀察股骨下段熒光強弱拍照，Image-Pro Plus(version 6.0，IPP，美國)軟件計數染色陽性細胞數。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 貝尼地平對股骨下段骨小梁的組織學影響

股骨下段行HE染色(圖1)發現去卵巢加藥組小鼠的骨小梁數量明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.05)，但仍然低于假手術組小鼠(圖1，表1)，差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖1 各組小鼠股骨下段HE染色Fig.1 HE staining of distal femur in different groups of mice

2.2 BD對股骨下段骨代謝參數的影響

股骨下段顯微CT掃描(圖2)發現，和去卵巢加藥組小鼠(圖2，表1)相比，去卵巢組小鼠的BMD、Tb.Th、Tb.N均明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；而各組中假手術組(圖2，表1)的BMD、Tb.Th和Tb.N最高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖3 各組小鼠股骨下段RUNX2免疫組織化學染色(放大倍數100×)Fig.3 RUNX2 IHC staining of distal femur in different groups of mice (magnification 100×)

圖4 各組小鼠股骨下段OCN免疫熒光染色(放大倍數100×)Fig.4 OCN IF staining of distant femur in different groups of mice (magnification 100×)

2.3 BD對股骨下段RUNX2表達的影響

對各組股骨下段行RUNX2免疫組織化學染色(圖3)發現，去卵巢加藥組(圖3，表1)股骨下段RUNX2陽性細胞數量明顯多于單純去卵巢組(圖3，表1)，差異具有統計學意義(P<0.05)；而假手術組(圖3，表1)RUNX2表達量在各組中表達最強，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.4 BD對股骨下段OCN表達的影響

各組小鼠股骨下段OCN免疫熒光染色(圖4)發現，去卵巢加藥組(圖4，表1)股骨下段OCN表達明顯高于單純去卵巢組(圖4，表1)，差異具有統計學意義(P<0.05)，但仍低于假手術組(圖4，表1)，差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖2 各組小鼠股骨下段顯微CT掃描重建Fig.2 μCT scan of distal femur in different groups of mice

組別HE染色(ccm)BMD(mgHA/ccm)Tb.Th(mm)Tb.N(l/mm)RUNX2陽性細胞數(/ccm)OCN陽性細胞數(/ccm)Sham組81.6667±12.0610754.6873±66.60870.0825±0.01295.1247±0.8950141.4255±10.094539.0452±9.0679OVX組23.5000±9.4604330.6000±53.52790.0385±0.00991.8320±0.682589.3607±24.318419.5373±3.0733OVX+BD組44.6667±11.3959515.9692±52.13380.0655±0.00664.0995±1.1469118.0877±10.989231.3866±8.1857

3 討論

貝尼地平作為臨床上用的降壓藥，具有L型、N型和T型三亞型通道阻滯作用，可舒張血管，能降低血壓和增加冠脈流量[4]。國外的一些體外實驗明確了貝尼地平促進成骨的作用[3,5]，但具體機制尚不清楚。另外，貝尼地平在體內的作用是否和以往的體外實驗相吻合目前尚不得而知。本課題旨在探討貝尼地平對骨代謝的影響。

本實驗通過去卵巢模仿絕經期后婦女骨質疏松模型[6]，探討在雌激素水平缺乏情況下，貝尼地平對小鼠骨代謝的影響。本研究通過組織學檢測以及股骨下段顯微CT掃描，通過假手術組和去卵巢組小鼠股骨下段的骨小梁數量和骨密度對比，發現去卵巢組小鼠相關參數均明顯下降，可驗證骨質疏松造模成功；另外，通過單純切卵巢組和切卵巢加藥組小鼠骨代謝相關指標對比，可發現模型組各項指標均優于單純切卵巢組，明確了貝尼地平對股骨下段骨小梁數量的影響以及促進骨代謝參數的恢復，去卵巢加藥組的小鼠股骨下段骨小梁作色區域明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.05)，骨密度、骨小梁厚度及骨小梁等定量指標和單純去卵巢小鼠相比均明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.05)，可以明確在體內環境下，貝尼地平具有對抗雌激素水平下降的骨質疏松作用。

為進一步探討貝尼地平在體條件下促進骨形成的體內分子生物學聯系，本課題對股骨下段石蠟切片進行了成骨關鍵蛋白OCN和重要轉錄因子RUNX2免疫熒光以及免疫組織化學檢測。OCN是成骨細胞特性的調控蛋白，在成骨細胞成熟和分化過程中起著至關重要的作用[7]，來自胞外促進成骨的信號分子通過膜受體的信號方法及細胞質中的第二信使信號轉導，將明顯上調胞核內OCN的表達，進而上調成骨相關蛋白質的轉錄與表達，促進成骨并調節骨的礦化及成熟[8]，通過OCN免疫熒光染色發現貝尼地平加藥組小鼠股骨下段OCN表達明顯高于單純切卵巢組，差異具有統計學意義(P<0.05)，但仍低于假手術組小鼠，差異具有統計學意義(P<0.05)；此外，成骨細胞重要的轉錄因子RUNX2是胞質中廣泛分布的促進成骨的轉錄因子[9]，RUNX2的表達受WNT/β-catenin信號通路直接調控，而WNT/β-catenin是成骨細胞行使生物學功能最為重要的信號通路[10]，因此，RUNX2表達的增加可間接反映WNT/β-catenin信號通路的活性[11]；本實驗中發現，在去卵巢組小鼠的股骨下段RUNX2表達量明顯低于假手術組和去卵巢加藥組。