異甘草素對小兒腦膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響及相關機制研究

孫瑞麗，朱淑霞，張燕燕，王行健

(濱州醫學院附屬醫院兒科，山東 濱州 256600)

[專題研究]

異甘草素對小兒腦膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響及相關機制研究

孫瑞麗，朱淑霞，張燕燕，王行健

(濱州醫學院附屬醫院兒科，山東 濱州 256600)

目的 研究異甘草素對腦膠質瘤U251細胞增殖、凋亡的影響，并探討其相關分子機制。方法 取對數生長期人腦膠質瘤U251細胞，用不同濃度(0、10、20、40、60、80μmol/L)異甘草素處理，每個濃度設5個復孔。異甘草素處理24h、48h、72h后，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞增殖能力，采用流式細胞術檢測細胞凋亡的變化，逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測FoxM1 mRNA的表達水平。結果 U251細胞經過濃度為0、10、20、40、60、80μmol/L的異甘草素處理24h、48h及72h后，細胞增殖均不同程度地受到抑制。在相同作用時間，不同濃度之間細胞增殖情況比較差異有統計學意義(F值分別為38.5、98.9、108.1，均P<0.05)；在相同異甘草素濃度，不同作用時間(24h、48h、72h)細胞增殖情況比較差異均有統計學意義(F值分別為11.4、20.8、43.1、53.9、30.4，均P<0.05)。不同濃度異甘草素作用于U251 細胞24h后，隨著異甘草素濃度的增加，細胞凋亡率增加(F=120.3，P<0.05)。不同濃度異甘草素處理U251細胞48h后，FoxM1 mRNA相對表達量分別為(71.2±5.1)%、(54.6±3.3)%、(35.4±4.1)%、(20.8±4.0)%，比較差異有統計學意義(F=83.5，P<0.05)。結論 異甘草素體外可有效抑制U251細胞的增殖并誘導其凋亡，其分子機制可能與下FoxM1基因的表達有關。

異甘草素；腦膠質瘤；增殖；凋亡；FoxM1

腦膠質瘤是小兒顱內最常見的原發性神經系統腫瘤，具有惡性程度高、生長增殖快、生存期短等特點，嚴重危害患兒身體健康。目前其常規治療以手術治療為主、放化療為輔。但因腦膠質瘤病理類型復雜，浸潤范圍廣，與正常組織分界不清，目前手術切除困難，其復發率也較高；另外膠質瘤對放射線敏感性較低，且傳統的化療藥物在殺傷膠質瘤細胞的同時又對人體正常細胞產生較強的毒副作用，且易出現多藥耐藥，容易導致化療失敗。中藥治療毒性低、療效好，且能與其他化療藥物配伍使用，具有廣闊的應用前景。異甘草素(Lsoliquiritigenin，ISL)是一種從甘草和蔥中提取的具有查耳酮結構的甘草黃酮類化合物，具有廣泛的生物和藥理活性, 具有抗氧化[1]、抗腫瘤[2]，逆轉耐藥[3]、保護心血管[4]等屬性，其抗腫瘤作用是近年來的研究熱點。有研究證實，ISL能抑制人類前列腺癌[5]、肺癌[6]、白血病[1]及乳腺癌[2]等多種癌細胞的增殖，并誘導細胞凋亡，但對腦膠質瘤細胞的影響較少報道。本試驗初步觀察 ISL對人腦膠質瘤細胞U251增殖與凋亡的影響，探討其可能的分子機制，為其臨床應用提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

人腦膠質瘤細胞株U251(武漢博士德生物技術有限公司)，異甘草素(大連美侖生物技術有限公司)，RPMI1640 培養基、胎牛血清(美國 Hyclone 公司)；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、PCR反應試劑盒(日本 TAKARA 公司)；四甲基偶氮唑[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT](碧云天生物技術有限公司)；流式細胞凋亡試劑盒(BD公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；PCR引物(生工生物工程上海有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養

將U251細胞株置于含10%胎牛血清及含青霉素(濃度為100U/mL)、鏈霉素(濃度為0.1mg/mL)雙抗的RPMI1640培養基中培養，在37℃、5%CO2培養箱中培養，2～3天傳代1次。

1.2.2四甲基偶氮唑法檢測細胞增殖能力

取對數生長期U251細胞，調整細胞密度為2.5×104/mL，每孔100μL接種于96孔板上。待細胞貼壁后，每組分別加入ISL，使其終濃度分別為0、10、20、40、60、80μmol/L。將各組細胞置于37℃、5%CO2培養箱中分別培養24h、48h及72h后，每孔加入20μL(5mg/mL)MTT孵育4h，棄去培養基，加入150μL DMSO溶解結晶，用酶標儀測定每孔在490nm處的吸光度值(A490)。實驗重復3次。計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率(IR)=(1-實驗組A490/空白組A490)×100%。

1.2.3細胞凋亡的檢測

取對數生長期 U251細胞，調整細胞密度2×105/孔接種于6孔板上，培養基終體積2.5mL，培養24h后收集細胞，后用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌2次(780g離心5min)后棄上清，依次加入500μL結合緩沖液(binding buffer)懸浮細胞、5μL磷脂酰絲氨酸蛋白抗體-異硫氰酸酯(Annexin V-FITC)、5μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混勻，室溫避光反應15min，1h內上流式細胞儀檢測。實驗重復3 次。

1.2.4逆轉錄-聚合酶鏈反應法檢測FoxM1 mRNA的表達

取對數生長期U251細胞接種于6孔板上，調整細胞密度為2×105個/孔，加入不同濃度(0、20、40、60μmol/L)異甘草素。分別于加藥48h后收集細胞，并提取細胞總RNA，測定RNA純度，A260/A280 =1.8～2.0，測定RNA濃度。逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)兩步法檢測FoxM1 mRNA的表達情況，β-actin為內參，引物序列為：正義鏈5′-TCAGGG￣ATGGTGAGAGATCC-3′，反義鏈 5′-GAATGGG￣CAAACCTTCA￣GTC-3′。FoxM1正義鏈5′-TGCAGCTA￣GGATTGAATCTTC-3′，反義鏈5′-GGAGCCCAGT￣CCATC￣AGAACT-3′。按下列條件進行RT-PCR反應：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，總共進行35個循環；最后72℃延伸10min。實驗重復3次。

1.3統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行分析。數據以“均數±標準差”表示，多組比較采用One-way ANOVA方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1異甘草素對U251細胞增殖的影響

U251細胞經0、10、20、40、60、80μmol/L的異甘草素處理24h、48h及72h后，細胞增殖均不同程度地受到抑制。在相同作用時間，不同濃度之間細胞增殖情況比較差異有統計學意義(F值分別為38.5、98.9、108.1，均P<0.05)；在相同異甘草素濃度，不同作用時間(24h、48h、72h)細胞增殖情況比較差異均有統計學意義(F值分別為11.4、20.8、43.1、53.9、30.4，均P<0.05)。24h、48h、72h的半數抑制濃度(IC50)值逐漸縮小，分別(50.5±4.3)、(38.9±0.8)、(22.3±0.6)μmol/L。依據以上結果，篩選20、40、60μmol/L的異甘草素用于后續試驗。不同濃度的異甘草素對U251細胞增殖抑制的影響見圖1。

圖 1 MTT法檢測不同濃度的異甘草素作用不同時間后人腦膠質瘤細胞株U251 細胞的增殖抑制率

Fig. 1 Proliferation inhibitory rates of U251 cells treated with ISL of different concentration (0, 10, 20, 40, 60, 80μmol/L) for different time detected by MTT

2.2異甘草素對 U251細胞凋亡的影響

不同濃度異甘草素(0、20、40、60μmol/L)作用于U251細胞24h后，AnnexinV-FITC/PI 染色雙法檢測細胞凋亡，凋亡率分別為(3.2±0.6)%、(8.7±1.9)%、(19.3±2.5)%、(37.8±3.6)%，隨著藥物濃度的增加凋亡率增加，差異有統計學意義(F=120.3，P<0.05)，見圖2。

注：A為異甘草素0μmol/L，B 為異甘草素20μmol/L，C為異甘草素40μmol/L，D為異甘草素60μmol/L；隨著異甘草素濃度的增加，U251細胞凋亡率增加；凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率=右下象限+右上象限。

圖 2 不同濃度異甘草素作用24h 對U251 細胞凋亡的影響

Fig. 2 Effect of ISL of different concentration on cell apoptosis of U251 cells at 24h

2.3異甘草素對U251細胞FoxM1基因表達的變化

通過分析實時熒光定量PCR法檢測FoxM1 mRNA的表達結果顯示，不同濃度的異甘草素(0、20、40、60μmol/L)處理U251細胞48h后，FoxM1 mRNA相對表達量分別為(71.2±5.1)%、(54.6±3.3)%、(35.4±4.1)%、(20.8±4.0)%，比較差異有統計學意義(F=83.5，P<0.05)，見圖3。

圖 3 不同濃度異甘草素作用48h對U251細胞FoxM1 mRNA基因表達的影響

Fig. 3 Effect of ISL of different concentration on expression of FoxM1 mRNA of U251 cells at 48h

3討論

3.1兒童腦膠質瘤的臨床特征及傳統治療的局限性

膠質瘤是兒童中樞神經系統最常見的腫瘤，發病率為2.0/10萬，發病高峰年齡為5～8歲，學齡前后發病較多，且統計發現男孩多于女孩，比例約為1.3:1，該病具有發病率高、致死率高、復發率高及生存期短等特點[7]。膠質瘤的臨床癥狀主要包括顱內壓增高及腫瘤壓迫兩方面，如頭圍增大、頭痛、嘔吐、視物模糊、行走不穩、生長發育異常及局限性癲癇，后期表現為神經方面功能缺失，如癱瘓等[8]。腦膠質瘤常規治療包括手術切除、放療及化療。手術切除是其主要治療手段，但因兒童膠質瘤位于中線部位居多，手術入路困難，術后并發癥多且嚴重。另外，放療對小兒正在發育的神經系統有難以預測的影響，所以有些待3歲后才能放療，因而化療逐漸成為治療兒童膠質瘤的重要手段。目前，主要的化療藥物包括替莫唑胺、順鉑及甲氨蝶呤，但化療藥物毒副作用大且易產生耐藥，復發率極高，平均生存時間仍小于14個月。因此從天然藥物中尋找新的低毒、高效的靶向基因治療抗腫瘤藥物，是目前國內外專家學者亟待解決的重要問題。

3.2異甘草素抑制U251細胞增殖，促進細胞凋亡

中國傳統醫藥在臨床上的應用歷史悠久，博大精深。異甘草素屬于黃酮類化合物，廣泛存在于甘草等植物中，具有廣泛的生化學特性。近年來，異甘草素對前列腺癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤具有抑制作用，其抗腫瘤作用逐漸被重視。為了探討異甘草素是否抑制腦膠質瘤細胞生長及促進凋亡，本研究以U251細胞為研究對象進行試驗。結果顯示，U251細胞經濃度為 0、10、20、40、60、80μmol/L的異甘草素處理24h、48h及72h后，細胞增殖均不同程度地受到抑制，呈顯著的劑量及時間依賴性。不同濃度異甘草素(0、20、40、60μmol/L)作用于U251細胞24h后，Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測U251細胞凋亡結果顯示，隨著異甘草素濃度的增加，細胞凋亡率增加。提示異甘草素能通過抑制U251細胞增殖、誘導細胞凋亡發揮抗腦膠質瘤的作用。

3.3異甘草素抗腫瘤作用機制

多種基因參與腦膠質瘤的發生和發展。叉頭框轉錄基因M1(forkhead box M1，FoxM1)是轉錄因子家族成員之一，該轉錄因子的作用涉及廣泛的生物學過程，包括細胞增殖、分化，細胞周期及凋亡、損傷修復等，其表達失調在胃癌、宮頸癌等多種腫瘤的發生及發展中發揮著重要作用[9-10]。因此，FoxM1在多種腫瘤中被認為是重要的分子標志與治療的潛在靶標，然而在腦膠質瘤作用的研究報道少見。Liu等[11]研究了FoxM1表達水平與急性粒細胞白血病(myeloid leukemia，AML)患者的臨床特點及預后的相關性，發現FoxM1基因高表達與白血病危險程度有關，且提示預后不良，因此FoxM1有望成為一個有前途的治療靶點及潛在的預后標志。顏世舉等[12]研究表明FoxM1過表達能導致骨肉瘤的發生，沉默FoxM1 mRNA 基因的表達能夠顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖，從而促進凋亡。本試驗通過RT-PCR法檢測FoxM1 mRNA的表達，結果顯示，不同濃度的異甘草素(0、20、40、60μmol/L)處理U251細胞48h后，隨著異甘草素濃度增加，U251細胞中FoxM1 mRNA表達水平逐漸下降，提示異甘草素可能通過下調FoxM1 mRNA基因的表達，發揮其抗腦膠質瘤的作用，其治療作用是否與FoxM1 mRNA基因有關還有待于進一步研究。

綜上所述，本研究證實異甘草素顯著抑制U251細胞增殖并誘導其凋亡，其相關機制可能與下調FoxM1基因的表達有關。本試驗初步證明了異甘草素的抗腦膠質瘤作用，為異甘草素應用于腦膠質瘤的治療提供了理論依據。

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[專業責任編輯:孫 新]

Effects of isoliquiritigenin on proliferation and apoptosis in children glioma cells and its possible mechanisms

SUN Rui-li, ZHU Shu-xia, ZHANG Yan-yan, WANG Xing-jian

(Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Shandong Binzhou 256600, China)

Objective To study the influence of isoliquiritigenin (ISL) on U251 cell proliferation and apoptosis and its relevant molecular mechanisms. Methods U251 cells in logarithmic phase were extracted and cultured with different concentration of ISL (0, 10, 20, 40, 60, 80μmol/L), and every concentration was provided with 5 holes. Cell proliferation was detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and cell apoptosis was measured by flow cytometry after treatment for 24h, 48h and 72h. Expression level of FoxM1 mRNA was determinated by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results Proliferation of U251 cell was inhibited at different degree at 24h, 48h or 72h after being disposed in ISL with concentration of 0, 10, 20, 40, 60, 80μmol/L. Difference in cell proliferation in different concentration of ISL for same action time had statistical significance (Fvalue was 38.5, 98.9 and 108.1, respectively, allP<0.05). Difference in cell proliferation in same concentration of ISL for different action time (24h, 48h, 72h) was statistically significant (Fvalue was 11.4, 20.8, 43.1, 53.9 and 30.4, respectively, allP<0.05). After U251 cells were disposed in different concentration of ISL for 24 hours, cell apoptosis rate increased with increase of ISL concentration (F=120.3,P<0.05). FoxM1 mRNA expression level was 71.2±5.1%, 54.6±3.3%, 35.4±4.1% and 20.8±4.0%, respectively when U251 cell disposed in different concentration of ISL for 48h, and difference was statistically significant (F=83.5,P<0.05). Conclusion ISL could inhibit proliferation and induce apoptosis of U251 cells in vitro. Its molecular mechanism is related with down-regulation of FoxM1 expression.

isoliquiritigenin (ISL); brain glioma; proliferation; apoptosis; FoxM1

2017-02-19

濱州市軟科學資助項目(2016BRK18)

孫瑞麗(1990-)，女，在讀碩士研究生，主要從事兒童神經系統疾病的研究。

朱淑霞，副主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.06.002

R739.4

A

1673-5293(2017)06-0624-03