多肽bCAT通過下調白念珠菌HWP1基因表達抑制生物被膜的形成機制

許 珊， 張 舒，張 丹， 劉思佚，劉梳柯

多肽bCAT通過下調白念珠菌HWP1基因表達抑制生物被膜的形成機制

許 珊， 張 舒*，張 丹， 劉思佚，劉梳柯

目的 明確多肽bCAT抑制白念珠菌生物被膜形成能力，并探索其與黏附基因HWP1表達的關系。方法 標準菌株白念珠菌ATCC10231和臨床菌株作為研究對象，XTT法檢測其生物被膜形成能力，bCAT抗浮游白念珠菌的MIC值以CLSI-M27-A3方法確定，XTT法及菌落計數檢測bCAT抑制生物被膜形成作用，并計算代謝活性確定抑制50%生物被膜形成的MIC（BIC50），bCAT減少白念珠菌的黏附作用經倒置顯微鏡下觀察及菌落計數法檢測，并采用RT-PCR 通過2-ΔΔCt法計算HWP1的表達量。統計方法為單因素方差分析，組內比較采用Dunnett T3檢驗。結果 標準菌株及臨床菌株均有較強生物被膜形成能力。bCAT抗浮游狀態的白念珠菌MIC值為40～80 μmol / L，BIC50為80～160 μmol / L；并且bCAT能減少白念珠菌的黏附作用，空白對照組菌落計數為 （27 822.22±2 472.74） cfu， bCAT濃度為160、80、40、20、10 μmol / L時的菌落個數分別為（5 355.55±1 264.03）cfu、（11 377.78±2 232.58 ）cfu、（17 488.89±1 136.27） cfu、（22 377.78±3 521.99）cfu、（26 044.44±1 329.57）cfu。組間差異具有統計學意義（F=147.018，P=0.001），組內比較發現160、80、40 μmol / L處理組與不含bCAT時差異具有統計學意義（P＜0.05）。RT-PCR發現160 μmol / L處理組HWP1相對表達量為空白對照組的12.24 %。結論 bCAT能有效抑制白念珠菌生物被膜形成，其機制可能與降低HWP1基因的表達從而減少白念珠菌的黏附有關。具有一定的臨床前景。

白念珠菌； 生物被膜形成； 嗜鉻粒蛋白A； 抗黏附

白念珠菌（C. albicans）是目前最常見的機會性真菌感染病原體，其高死亡率與高治療成本與生物被膜的形成有關[1]。白念珠菌生物被膜是由孢子、菌絲及假菌絲組成的三維立體結構[2]，是病原體為適應環境變化的另一種生存形式，其生物學行為與浮游狀態完全不同，對常用的抗菌藥物耐藥且能逃避免疫宿主反應[3-4]，給臨床治療帶來巨大困難，是目前抗感染治療中亟待解決的重要問題。

抑制白念珠菌生物被膜形成的研究具有重要的臨床意義。真菌細胞黏附于生物及非生物物質表面是白念珠菌生物被膜形成的一個關鍵步驟[5]，HWP1是介導此過程的關鍵基因之一，有研究證實，不表達HWP1的白念珠菌突變株不能在血管導管表面形成生物被膜[6]。

嗜鉻粒蛋白A（chromogranin A，CGA）是腎上腺髓質分泌的機體重要應激激素蛋白原，在牛、人等多種屬內高度保守，能在體內水解生成一系列抗菌多肽，研究證實牛catestatin（bovinCGA344–364，bCAT）具有抗真菌作用[7]，在1.2～8.0 μmol / L的濃度范圍內產生抑菌效應[8]。但bCAT在抑制白念珠菌生物被膜形成方面尚無研究。本研究旨在明確bCAT是否具有抑制白念珠菌生物被膜形成作用，并進一步探索其與HWP1基因表達的關系。

1 材料與方法

1.1 菌株

標準菌株為白念珠菌ATCC10231（重慶博培生物技術有限公司）和臨床菌株5株（編號分別為1、2、9、17、18，來源于重慶醫科大學附屬第一醫院感染科實驗室）。

1.2 實驗材料和方法

1.2.1 主要實驗材料 YPD（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）液體培養基組成：酵母膏10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，蒸餾水1 L；沙氏瓊脂培養基（SDA，Sabourand's agar medium）組成：葡萄糖40 g、酪蛋白胰酶消化物、動物組織的胃酶消化物等量混合10 g 、瓊脂15 g加入純化水1 000 mL，高溫滅菌后倒入平皿。bCAT氨基酸序列：RSMRLSFRARGYGFRGPGLQL，由上海科肽生物科技有限公司合成；HWP1、ACT1引物由上海生工生物工程有限公司合成。XTT{c；3，3’-[1-（苯氨酰基）-3，4-四氮唑]-二（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸鈉}（北京索來寶公司）。甲萘醌（Sigma公司，美國）。

1.2.2 菌種和培養條件 將凍存于-80?℃白念珠菌接種于SDA平皿，37.0?℃培養24～48 h，肉眼觀察白色菌落形成；挑選單個白色菌落接種于YPD培養基中37.0?℃、100 r/min培養24 h以保證菌株的純度與活力。離心（1 000 r/min，10 min）后PBS溶液充分清洗殘留的YPD培養基后加入RPMI-1640培養基（Sigma公司，美國），使用血細胞計數板計數后放置于4?℃備用。

1.2.3 XTT法[9]判斷白念珠菌生物被膜形成能力 RPMI-1640培養基將菌液濃度調至106cfu/ mL，96孔板每孔加入100 μL，密閉創造微氧環境后37?℃生長24 h。PBS沖洗未形成生物被膜的浮游白念珠菌后，每孔加入100 μLXTT（0.5 mg / mL） / 甲萘醌（1 μmoL / L），37?℃避光作用2 h 后于多功能酶標儀檢測490 nm處的D值，每次設置3個實驗孔，并在非同一天中重復3次實驗。僅含XTT / 甲萘醌的空白對照孔D值（Dc）作為陰性對照判斷生物被膜形成能力，判斷標準如下[10]：D≤Dc，無生物被膜形成能力；Dc＜D≤2Dc，生物被膜形成能力較弱；2Dc＜D≤4Dc，生物被膜形成能力中等；D＞4Dc，生物被膜形成能力強。1.2.4 bCAT抗浮游狀態白念珠菌MIC值 抗浮游狀態白念珠菌MIC值的測定依照CLSI M27-A3的方法[11]，YPD培養基稀釋最終的藥物作用濃度為：bCAT 160～2.5 μmol / L。過程概括如下：96孔板每孔加入100 μL由YPD 培養基調至（1～5）×103/ mL 菌液，2倍稀釋法依次加入100 μL藥物至各孔，100 μL YPD培養基加100 μL菌液作為陽性對照孔菌液終濃度為（0.5～2.5）×103cfu/ mL，YPD 培養基200 μL作為陰性對照孔。37?℃培養24 h，bCAT對浮游狀態白念珠菌MIC 值判讀的終點為肉眼與陽性對照孔比較為清澈培養基的最小藥物濃度，每次設置3個實驗孔，并在非同一天中重復3次實驗。

1.2.5 bCAT抑制生物被膜形成實驗方法 用XTT法和菌落計數法：RPMI-1640稀釋最終的藥物作用濃度為160～10 μmoL / L。96孔板各孔加入100 μL濃度為106cfu/ mL白念珠菌懸液，并采用2倍稀釋法依次加入100 μL藥物至各孔，陽性對照孔中加入100 μL RPMI-1640培養基，37?℃培養24 h 后PBS清洗2次以除去與孔底黏附不緊密的真菌后判斷結果。①XTT法計算代謝活性，方法同1.2.3。計算公式：代謝活性（metabolic activity）（%）=實驗孔D490/ 陽性對照孔D490×100 %，當代謝活性小于50 %時定義為抑制生物被膜形成有效，此時的MIC即為抑制50%生物被膜形成的MIC（BIC50）。每次設置3個實驗孔并在非同一天中重復3次統計結果。②菌落計數法：將96孔板底部形成的生物被膜充分洗滌后接種于SDA平皿上，放入37?℃恒溫箱中，24～48 h計數（cfu）。

1.2.6 bCAT抗白念珠菌黏附作用 設置藥物濃度分別為160～10 μmoL / L。96孔板中加入菌液濃度106cfu/ mL，100 μL和100 μL藥物，37?℃作用4 h后PBS清洗2次，倒置顯微鏡下觀察真菌黏附作用并采用菌落計數[12]。

1.2.7 QRT-PCR方法分析 HWP1的表達采用熒光定量核酸擴增檢測系統（Real-time Quantitative PCR Detecting System， QRT-PCR）分析黏附基因HWP1的表達。標準菌株為白念珠菌ATCC10231，bCAT處理組濃度設置為160 μmoL / L，不含bCAT為對照組，按前述抑制生物被膜形成實驗方法處理后收集各組菌液。離心收集白念珠菌細胞用于RNA提取[步驟按前述RNA提取試劑盒（美國OMEGA公司）說明進行]，反轉錄[步驟見QRTPCR試劑盒（上海創英生物科技有限公司）]后使用SmartSpec TM Plus（Bio-Rad Laboratories公司）檢測ssDNA濃度，加入引物及熒光劑后予以該公司生產的CFX96 Touch儀器檢測各組Ct值。每次設置3個重復孔，一共3次。ACT1作為內參。引物堿基序列如下：

1.3 統計方法

采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，所有計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，bCAT抑制白念珠菌生物被膜形成作用結果及菌落計數法檢測抗白念珠菌黏附作用結果多組間均數比較使用單因素方差分析，其兩兩比較使用T3檢驗，QRT-PCR檢測bCAT下調白念珠菌HWP1基因表達實驗中對照組和處理組結果采用2-ΔΔCt法。P＜0.05為差異有統計學意義。結果采用Graphpad prism 5作圖。

2 結果

2.1 XTT檢測白念珠菌形成生物被膜能力

通過多功能酶標儀檢測490 nm處的D值可用于檢測生物被膜形成能力。結果顯示：不含白念珠菌生物被膜空白對照孔Dc為0.122 6±0.012 8，ATCC10231的D為0.852 7±0.080 1，臨床菌株編號1、2、17、18的D為0.738 5±0.110 6、0.783 2± 0.095 1、0.562 7±0.081 9、0.734 4±0.082 2。均顯示較強生物被膜形成能力；9號臨床菌株的D為0.124 6±0.009 3，無形成生物被膜能力。見圖1。選擇臨床菌株1、2、17、18和標準菌株ATCC10231進行后續實驗。

2.2 bCAT抗浮游白念珠菌作用

bCAT是bCGA的水解產物中抗菌作用較強的抗菌多肽。本研究證實其具有抗浮游狀態白念珠菌作用，其MIC值為40～80 μmol / L（見表1）。臨床菌株與標準菌株結果類似。

2.3 bCAT抑制白念珠菌生物被膜形成

通過XTT法計算不同濃度bCAT下白念珠菌生物被膜的代謝活性判斷其抑制生物被膜形成能力。結果發現，bCAT能有效抑制白念珠菌生物被膜的形成，BIC50為40～80 μmol / L（見表1）。以不含bCAT作用時的生物被膜代謝活性為100 %，計算bCAT濃度為160、80、40、20、10 μmol / L時的96孔板中白念珠菌代謝活性分別為（35.66±7.01） %、（33.55±4.82） %、（49.55±15.32） %、（61.57±6.12） %、（76.92±8.05） %（見圖2A）。表明bCAT能有效抑制白念珠菌生物被膜的形成。

菌落計數結果發現：不含bCAT處理時的96孔板中菌落個數為（114 422.2±22 998.14）cfu，bCAT濃度為160、80、40、20、10 μmoL / L時的菌落個數為（57 688.89±7 268.97）、（69 813.33± 5 565.60）、（81 106.67±9 804.20）、（103 228.9± 5 084.78）、（109 728.9±8 687.77）cfu（見圖2B）。經單因素方差分析，組內差異具有統計學意義（F=35.840，P=0.001），組間比較采用T3檢驗，發現160、80、40 μmol / L處理組與不含bCAT時差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 XTT檢測白念珠菌標準菌株ATCC10231和5株臨床菌株生物被膜形成能力Figure 1 Bio fi lm formation ability of Candida albicans strains assessed by XTT assay， including standard strain ATCC 10231 and clinical strains

表1 bCAT抗白念珠菌參數Table 1 Minimum inhibitory concentration （MIC） and the lowest concentration showing 50 % inhibition on biof i lmformation （BIC50） of catestatin against C. albicans

圖2 XTT（A）及菌落計數（B）判斷bCAT抑制白念珠菌生物被膜形成Figure 2 Effect of catestatin （bCAT） on C. albicans biof i lm formation estimated by XTT assay-based metabolic activity （A） and colony count （B）

2.4 bCAT抑制白念珠菌生物被膜形成的機制

倒置顯微鏡下初步判斷bCAT能有效減少白念珠菌黏附于96孔板，不含bCAT的陽性對照孔可見微小菌落集落形成（見圖3Aa），隨著bCAT濃度升高，白念菌黏附數量明顯減少，bCAT濃度10、20、40、80、160 μmol / L（見圖3A b，c，d，e，f）的菌落依次減少，160 μmol / L僅見單個白念珠菌，未見集落形成。菌落計數發現，對照組的菌落數為（27 822.22±2 472.74）cfu，濃度為160、80、40、20、10 μmol / L時的菌落個數為（5 355.55±1 264.03） 、（11 377.78±2 232.58） 、（17 488.89±1 136.27） 、（22 377.78±3 521.99） 、（26 044.44±1 329.57） cfu。經單因素方差分析（AVONA），組內差異具有統計學意義（F=147.018，P＜0.001），組間比較采用T3檢驗，發現160、80、40 μmol / L處理組與不含bCAT時差異具有統計學意義（P＜0.05）（見圖3B）。

為進一步探索bCAT抑制生物被膜形成的具體分子機制，我們采用RT-PCR檢測對HWP1表達的影響，結果采用2-ΔΔCt法分析發現：濃度為160 μmol / L處理后的HWP1的相對表達量為12.24 %，有效減少了HWP1的表達（見圖3C）。

圖3 bCAT對白念珠菌黏附過程的影響Figure 3 Effect of catestatin （bCAT） on adhesion of C. albicans

3 討論

生物被膜形成是中心靜脈導管及其他植入生物材料應用后發生感染的主要危險因素之一[13]。被膜形成后白念珠菌的致病力增強，對棘白菌素類、三唑類等藥物表現出耐藥性，造成慢性感染，治療困難，帶來不良臨床后果[14-15]。

XTT法是目前公認的研究生物被膜的標準方法[16]。XTT作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞還原成水溶性的橙黃色甲臜產物。當XTT與電子偶合劑（甲萘醌）聯合應用時，其產生水溶性甲臜產物的吸光度與活細胞的數量成正比，本實驗中XTT法證實了白念珠菌臨床菌株具有不同的生物被膜形成能力。Rajendran等[17]研究發現，生物被膜形成能力是影響白念珠菌血流感染病死的主要危險因素。本研究還明確了bCAT具有抑制白念珠菌生物被膜形成的作用，其BIC50為80～160 μmoL / L，而游離狀態白念珠菌的MIC值為40～80 μmoL / L。進一步驗證了白念珠菌生物被膜狀態生物學行為與浮游狀態的不一致。

生物被膜形成過程包括黏附、小菌落形成、成熟及擴散，因此黏附是生物被膜形成的第一步，由一系列黏附素介導[5]。本研究在倒置顯微鏡下觀察到不含bCAT的空白對照組中4 h時白念珠菌微小菌落聚集形成，而在bCAT處理時明顯減少，高濃度（160 μmol / L）時未見微小菌落的聚集。因此初步證實bCAT抑制白念珠菌生物被膜形成與減少黏附相關。統計結果顯示bCAT能有效減少白念珠菌黏附于96孔板，濃度大于40 μmol / L時與空白對照組比較差異具有統計學意義。白念珠菌作為一種機會性感染病原體，機體處于正常免疫狀體時共生于胃腸道、陰道等部位，免疫狀態低下時真菌細胞與宿主細胞相互作用并黏附于宿主細胞，是真菌細胞定植及致病的中心環節[18]，也是形成生物被膜的關鍵步驟。

本研究中RT-PCR證實bCAT處理后HWP1基因mRNA的相對表達量為12.24 %。HWP1是白念珠菌重要的毒力因子之一，在菌絲相中高表達，還能介導生物被膜形成時真菌與細胞外基質以及真菌細胞與細胞間的相互作用[5，19]，翻譯后的HWP1蛋白是第1個經體外研究發現的介導生物被膜形成的細胞壁蛋白，不僅能介導白念珠菌與細胞外基質的黏附，同時能促進白念珠菌間的聚集，形成微菌落，進一步形成生物被膜。體外研究發現缺乏HWP1的白念珠菌突變株不能在中心靜脈導管表現形成生物被膜[6]。Khodavandi等[20]研究證實，抑制白念珠菌生物被膜形成作用與下調HWP1基因的表達相關，且HWP1能介導白念珠菌黏附并入侵胃腸道上皮細胞并形成菌落而致病。HWP1作為介導白念珠菌黏附的關鍵基因之一，推測bCAT減少白念珠菌的黏附作用與下調該基因有關。本研究也證實了bCAT下調了黏附基因HWP1的表達。

由于生物被膜細胞外基質的屏障作用、持留細胞等機制，有生物被膜時白念珠菌細胞能逃避機體免疫反應，且目前多數抗真菌藥物對生物被膜治療作用不大[21]。因此，許多研究者將目光投向具有較強抗真菌作用的抗菌多肽[22]。bCAT作為抗菌多肽有可能成為新型抗真菌藥物應用于臨床，例如涂層于植入材料表面以抑制白念珠菌生物被膜的形成。

本研究證實了白念珠菌臨床菌株生物被膜形成的不同能力，明確了bCAT能抑制白念珠菌形成生物被膜，其機制可能為下調HWP1的表達從而減少白念珠菌的黏附。這一結果具有一定的臨床應用前景，需要在非白念珠菌及體內證實bCAT抑制真菌生物被膜形成的作用。

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Effect of catestatin on inhibiting C. albicans biofilm formation by downregulating the expression of HWP1

XU Shan, ZHANG Shu, ZHANG Dan, LIU Siyi, LIU Shuke. （Department of Intensive Care Medicine, the First Aff i liated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400013, China）

Objective To investigate whether catestatin (bovine chromogranin A 344-364) can inhibit the biof i lm formation of Candida albicans and examine its relationship with the expression of adhesion gene HWP1. Methods Clinical strains and standard strain ATCC 10231 of C. albicans were studied. XTT [2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] method was used to assess the ability of C. albicans biof i lm formation. Antifungal activity against planktonic Candida cells was evaluated in terms of minimum inhibitory concentrations (MICs) according to the description in CLSI-M27-A3. XTT assay and colony count were used to assess the effect of catestatin on inhibiting C. albicans biofilm formation. The lowest concentration showing 50 % inhibition on biof i lm formation (BIC50) was decided by calculating the metabolic activity. The adhesion of C. albicans reduced by catestatin was visualized under an inverted microscope and quantified by colony count. The expression of HWP1 was analyzed by RT-PCR. One-way analysis of variance (ANOVA) and Dunnett’s T3 test were used to compare the results. Results Clinical strains and standard strain ATCC 10231 of C. albicans showed strong ability in forming biofilm. Catestatin exhibited MICs ranging from 40 μmol/L to 80 μmol/L against planktonic C. albicans cells, andBIC50of 80-160 μmol/L in inhibiting C. albicans bio fi lm formation. Catestatin reduced the adhesion of C. albicans. The colonyforming unit (CFU) was 27 822.22±2 472.74 in blank control group, while the CFU was 5 355.55±1 264.03, 11 377.78±2 232.58, 17 488.89±1 136.27, 22 377.78±3 521.99, and 26 044.44±1 329.57 in the presence of 160, 80, 40, 20, and 10 μmol/L catestatin, respectively (F=147.018, P=0.001). The difference between control group and 160, 80, and 40 μmol/L catestatin was statistically signi fi cant (P＜0.05). RT-PCR found the expression of HWP1 in the presence of 160 μmol/L catestatin was about 12.24 % of that in blank control group. Conclusions Catestatin can effectively prevent C. albicans bio fi lm formation. This effect may be related to the down-regulated expression of adhesion gene HWP1 by catestatin, which results in reduced adhesion of C. albicans. Promising clinical prospect is expected for this fi nding.

C. albicans; bio fi lm formation; chromogranin A; anti-adherent

R978.5

A

1009-7708 ( 2017 ) 04-0387-06

10.16718/j.1009-7708.2017.04.008

2016-09-18

2017-02-02