黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞水平在膿毒癥患者中的臨床意義

毛玉林， 陸珠鳳， 黃俊峰， 冒海蕾， 張 穎， 張曉明， 諸杜明

黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞水平在膿毒癥患者中的臨床意義

毛玉林1， 陸珠鳳1， 黃俊峰1， 冒海蕾1， 張 穎2， 張曉明2， 諸杜明1

目的 研究膿毒癥患者外周血循環(huán)黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞（MAIT細(xì)胞）的數(shù)量及活化狀態(tài)。方法 使用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定外周血MAIT細(xì)胞的數(shù)量、比例和CD69活化分子的表達(dá)。結(jié)果 膿毒癥患者在疾病早期外周血MAIT細(xì)胞數(shù)量顯著下降；在入住ICU的第1天與第3天，膿毒癥組患者M(jìn)AIT細(xì)胞的CD69表達(dá)量維持在較高水平。結(jié)論 嚴(yán)重感染為特征的患者外周血MAIT細(xì)胞數(shù)量顯著減少提示可能會(huì)發(fā)生膿毒癥。

黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞； 膿毒癥； 抗感染免疫； 預(yù)后

在2016年的《膿毒癥和膿毒癥休克第三次國(guó)際共識(shí)定義（sepsis-3）》中，膿毒癥被定義為感染引起宿主調(diào)節(jié)紊亂而導(dǎo)致的威脅生命的臟器功能障礙[1]。在膿毒癥的發(fā)病過(guò)程中，機(jī)體免疫系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)不同程度的缺陷，促炎因子與抗炎因子比例失調(diào)，固有免疫細(xì)胞持續(xù)激活，效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量缺少或功能障礙，抑制性免疫細(xì)胞的功能活動(dòng)相對(duì)增強(qiáng)，導(dǎo)致機(jī)體不能產(chǎn)生有效的清除病原體的免疫活動(dòng)，但造成這種免疫紊亂的根源目前仍不清楚[2]。

有學(xué)者認(rèn)為，固有免疫反應(yīng)紊亂可能是膿毒癥的主要決定因素[3]。黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞（mucosal-associated invariant T cells，MAIT細(xì)胞）是一群進(jìn)化保守的固有樣T淋巴細(xì)胞，此類(lèi)細(xì)胞因其嗜組織性，傾向于分布在腸道黏膜固有層而得名[4]。其實(shí)，除了黏膜組織，MAIT細(xì)胞在肝臟、外周血中的含量也相當(dāng)豐富[5]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，MAIT細(xì)胞與B族維生素代謝產(chǎn)物有關(guān)[6]，在炎癥早期可識(shí)別多種細(xì)菌、真菌并啟動(dòng)自身活化，分泌炎性反應(yīng)細(xì)胞因子，殺傷病原微生物，并構(gòu)建起銜接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁[7-8]。目前，對(duì)MAIT細(xì)胞與感染性疾病的研究，主要集中在結(jié)核病、肺炎、AIDS、肝炎等疾病[9]，Grimaldi等[3]發(fā)現(xiàn)重癥膿毒癥患者外周血MAIT細(xì)胞頻數(shù)明顯減少，但國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)關(guān)于MAIT細(xì)胞在膿毒癥中作用的報(bào)道較少。本研究旨在通過(guò)研究膿毒癥患者外周血循環(huán)MAIT細(xì)胞的改變來(lái)探索早期預(yù)測(cè)膿毒癥發(fā)生發(fā)展的方法，從免疫微環(huán)境的角度為臨床疾病的診斷提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例選擇 選擇2015年8月－2016年8月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院就診的外科患者36例，平均年齡（68.5±9.4）歲，其中男28例，女8例。患者中因感染性疾病手術(shù)術(shù)后合并發(fā)生膿毒癥22例，設(shè)為術(shù)后膿毒癥組（S組）；非感染性疾病手術(shù)正常康復(fù)患者14例，設(shè)為術(shù)后正常恢復(fù)組（F組）。另選取13例正常健康人，設(shè)為健康對(duì)照組（N組）。S組患者均符合2016年美國(guó)胸科醫(yī)師學(xué)院（ACCP） / 美國(guó)危重病醫(yī)學(xué)會(huì)（SCCM）共識(shí)會(huì)議制定的Sepsis 3.0所列診斷標(biāo)準(zhǔn)：感染所致的序貫性臟器功能衰竭（sequential organ failure assessment，SOFA）評(píng)分≥2可診斷膿毒癥；膿毒癥休克是膿毒癥中較嚴(yán)重的一種類(lèi)型，即經(jīng)過(guò)充分的液體復(fù)蘇，患者仍需要升壓藥來(lái)維持，平均動(dòng)脈壓（MAP）＞65 mmHg，同時(shí)血清乳酸水平＞2 mmol / L。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 先天性或獲得性免疫功能缺陷；存在心、肝、腎等慢性器質(zhì)性病變；自身免疫性疾病（病毒性肝炎、HIV感染等）；精神疾病；入院前3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)皮質(zhì)類(lèi)固醇或其他免疫抑制劑。

1.1.3 病情危重程度及預(yù)后評(píng)估方法 ① SOFA評(píng)分；②急性生理和慢性健康評(píng)分（APACHE II評(píng)分）。

1.1.4 倫理審批及知情同意 本研究已提呈復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)并通過(guò)審批，課題開(kāi)展前向家屬及意識(shí)清醒患者告知研究目的和方法并取得知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集外周血，每次5 mL。所得血樣2 h內(nèi)即行血細(xì)胞計(jì)數(shù)并提取外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。

1.2.2 采血時(shí)間 S組患者于術(shù)后確定膿毒癥診斷的24 h內(nèi)和第3天動(dòng)態(tài)采集血樣，F(xiàn)組患者術(shù)后第1個(gè)24 h內(nèi)抽取血樣，N組為健康體檢時(shí)采集血樣。

1.2.3 PBMC 染色所用抗體及熒光通道，見(jiàn)表1。

表1 流式細(xì)胞染色所用抗體Table 1 Antibodies used in f l ow cytometry

1.2.4 實(shí)驗(yàn)方法 將上述抗體進(jìn)行滴定后按適當(dāng)比例混合成抗體混合物（mixture），每（1～2）×106PBMC中加入50 μL混合抗體，避光，常溫染色15 min，洗滌后2 %甲醛固定，LSR Fortessa流式細(xì)胞儀檢測(cè)，S組最后入組的6例患者和N組、F組患者同時(shí)測(cè)定T細(xì)胞CD69表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)步驟參照廠家實(shí)驗(yàn)操作指南進(jìn)行。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 流式細(xì)胞儀所獲得數(shù)據(jù)用FlowJo V9.3.2進(jìn)行調(diào)節(jié)補(bǔ)償并數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)資料用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用各組第1次取樣數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）或中位數(shù)（四分位數(shù)間距P25，P75）表示，符合正態(tài)分布、方差齊性的兩組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，三組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的三組數(shù)據(jù)比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Mann-Whutney U秩和檢驗(yàn)；S組第1天與第3天的配對(duì)數(shù)據(jù)采用Wilcoxon檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組病例基本情況

三組病例入組年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。S組并發(fā)膿毒癥的病因?yàn)橄来┛?6例、化膿性膽管炎6例。患者病情危重程度和預(yù)后采用SOFA評(píng)分和APACHE II評(píng)分。S組APACHE II評(píng)分明顯高于F組患者評(píng)分，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

2.2各組病例血常規(guī)絕對(duì)值和相對(duì)值比較

S組和F組患者外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量均高于N組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而S組患者外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯少于F組和N組。S組和N組患者單核細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表2 各組病例一般資料Table 2 General data of patients compared between groups

表3 各組血樣血細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 3 Blood cell counts compared between groups[mean ± SD or median （P25， P75）]

2.3 MAIT細(xì)胞絕對(duì)值和相對(duì)值的分析

圖1 MAIT 細(xì)胞的流式分析途徑Figure 1 Strategy for f l ow cytometric analysis of mucosal associated invariant T （MAIT） cells

MAIT 細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)S組對(duì)F組、F組對(duì)N組，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；S組對(duì)N組，P＜0.001，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

MAIT細(xì)胞在T細(xì)胞中所占百分比S組對(duì)N組，P＜0.01， S組明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；F組對(duì)N組、S組對(duì)F組，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。

2.3.2 S組組內(nèi)數(shù)據(jù)分析 與第1天基線值相比，S組患者第3天的MAIT絕對(duì)數(shù)和MAIT細(xì)胞占T細(xì)胞百分比有輕度升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

2.4 MAIT 細(xì)胞活化狀態(tài)分析

2.4.1 活化MAIT細(xì)胞比例分析 CD69是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，又稱(chēng)活化誘導(dǎo)分子，體內(nèi)外T淋巴細(xì)胞活化均可激活CD69，它是T淋巴細(xì)胞活化最早表達(dá)的膜表面分子。

CD69+MAIT細(xì)胞在總MAIT細(xì)胞相對(duì)占比分析：S組對(duì)N組，P＜0.001，S組表達(dá)量明顯增高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；S組對(duì)F組、F組對(duì)N組，P＜0.01，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

CD69+CD3+CD4-非MAIT（Non-MAIT）細(xì)胞占總CD3+CD4-non-MAIT細(xì)胞相對(duì)值分析：S組對(duì)N組，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4。

在CD3+CD4+T細(xì)胞群中，CD69表達(dá)量在各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4.2 S組組內(nèi)活化MAIT細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化 選取6例S組患者在確診后1 d和3 d對(duì)MAIT細(xì)胞活化指標(biāo)進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)S組患者在確診的第1天與第3天MAIT細(xì)胞持續(xù)高表達(dá)CD69，見(jiàn)圖5。

圖2 三組患者外周血 MAIT 細(xì)胞百分比與絕對(duì)數(shù)比較Figure 2 The number and percentage of circulating mucosal associated invariant T （MAIT） cells compared between three groups

圖3 S 組患者第1天與第3天外周血 MAIT 細(xì)胞百分比與絕對(duì)數(shù)比較Figure 3 The number and percentage of circulating mucosal associated invariant T （MAIT） cells on day 1 and day 3 in patients with sepsis

2.5 MAIT細(xì)胞數(shù)量與預(yù)后的關(guān)系

在三組病例中，最后S組出現(xiàn)了4例死亡，病死率18.18 %。死亡組患者M(jìn)AIT細(xì)胞數(shù)量及百分比與存活組的數(shù)據(jù)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。F組和N組未出現(xiàn)隨訪期間（28 d內(nèi)）死亡。

3 討論

MAIT細(xì)胞是一群在進(jìn)化上高度保守的T淋巴細(xì)胞，它有一條相對(duì)固定的T細(xì)胞抗原受體（T cell antigen receptor，TCR）α鏈并被Ⅰb型主要組織相容性復(fù)合體相關(guān)分子（major histocompatibility complex class Ib molecule，MHC class I-related protein 1，MR1）限制[5]。在血循環(huán)中，MAIT細(xì)胞占總T細(xì)胞的1 %～10 %，但由于其具有能識(shí)別細(xì)菌來(lái)源的B族維生素代謝產(chǎn)物而觸發(fā)激活，表達(dá)IFN-γ、TNF-α、顆粒酶（granzyme）、穿孔素（perforin）等殺傷性細(xì)胞因子，構(gòu)建固有免疫屏障的防線而引起關(guān)注[10]。隨著進(jìn)一步研究，科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)MAIT細(xì)胞還能分泌IL-2、IL-17等細(xì)胞因子，和B細(xì)胞有互相作用，是溝通固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答之間的橋梁[11]。MAIT細(xì)胞富集于肝臟、腸道、呼吸道黏膜等器官組織，與其高表達(dá)及遷移相關(guān)的趨化因子受體有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥患者中，循環(huán)MAIT細(xì)胞數(shù)量明顯減少，其絕對(duì)值和占總T細(xì)胞相對(duì)值都出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的下降，兩者之中下降比例以相對(duì)值下降為更甚，表明發(fā)生嚴(yán)重感染時(shí)，MAIT細(xì)胞亞群在T細(xì)胞參與抗炎免疫時(shí)，群體數(shù)量不足。本研究的發(fā)現(xiàn)與國(guó)外對(duì)干燥綜合征、急性膽囊炎、斑疹傷寒、肝炎、結(jié)核、銅綠假單胞菌感染、炎性腸病、紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的研究發(fā)現(xiàn)類(lèi)似，MAIT細(xì)胞表達(dá)量下降常預(yù)示疾病的嚴(yán)重狀態(tài)[12-13]。

圖4 三組患者 T 細(xì)胞各亞型表達(dá) CD69 百分比Figure 4 The expression of CD69 on different T cell subsets compared between three groups

圖5 膿毒癥患者 CD69+MAIT細(xì)胞百分比及其絕對(duì)數(shù)Figure 5 The percentage and number of CD69+mucosal associated invariant T （MAIT） cells in septic patients

CD69是淋巴細(xì)胞的一個(gè)極早期活化分子，正常人外周血T淋巴細(xì)胞很少表達(dá)，但遭受抗原刺激1～2 h之內(nèi)，就可迅速表達(dá)CD69。有研究發(fā)現(xiàn)，CD69可以通過(guò)誘導(dǎo)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor β，TGF-β）的產(chǎn)生發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用[14]，并且，CD69是Treg細(xì)胞（regulatory T cells）發(fā)揮調(diào)節(jié)性抑制功能的一個(gè)重要受體[15]。我們發(fā)現(xiàn)，相比N組，F(xiàn)組和S組患者外周血循環(huán)MAIT細(xì)胞的CD69表達(dá)量依次逐漸升高，從另一個(gè)方面反映了三組人群的免疫狀態(tài)。在嚴(yán)重感染早期CD69+MAIT細(xì)胞的比例顯著升高，S組與同期F組和N組均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明這可能是一個(gè)反映疾病嚴(yán)重狀態(tài)的重要信號(hào)。

本研究發(fā)現(xiàn)，患者的外周血循環(huán)MAIT細(xì)胞數(shù)量顯著減少，提示患者可能易發(fā)生膿毒癥。由于MAIT細(xì)胞具有調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境、分泌細(xì)胞因子直接殺傷感染細(xì)胞、加強(qiáng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的作用，MAIT細(xì)胞可能是有效控制炎性感染的診斷和治療靶點(diǎn)之一。MAIT細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的時(shí)間并不長(zhǎng)，該群細(xì)胞的功能、調(diào)控機(jī)制、上下游信號(hào)通路還有很多未知。本研究是我們對(duì)膿毒癥患者的一個(gè)探索性研究，由于樣本量較少，MAIT細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢(shì)與患者預(yù)后的關(guān)系并不明朗，有待通過(guò)大樣本驗(yàn)證，進(jìn)一步評(píng)價(jià)MAIT細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的臨床意義。

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Clinical implications of circulating mucosal associated invariant T (MAIT) cells in septic patients

MAO Yulin, LU Zhufeng, HUANG Junfeng, MAO Hailei, ZHANG Ying, ZHANG Xiaoming, ZHU Duming. （Department of Critical Care Medicine, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China）

Objective To investigate the number and activation status of circulating mucosal associated invariant T (MAIT) cells in patients with sepsis. Methods Flow cytometric method was used to determine the number and percentage of MAIT cells and their expression of activation molecule CD69. Results The circulating MAIT cells dropped signif i cantly at early stage of sepsis in septic patients. The MAIT cells in the sepsis group continued to express high levels of CD69 on day 1 and day 3 after admission to ICU. Conclusions Remarkable decrease of circulating MAIT cells may portend the possibility of sepsis in patients with severe infection.

mucosal associated invariant T cells; sepsis; anti-inf l ammatory immune response; prognosis

R631.2

A

1009-7708 ( 2017 ) 04-0376-06

10.16718/j.1009-7708.2017.04.006

2017-02-28

2017-04-20

國(guó)家自然科學(xué)基金（31470879）；復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青年基金（2016ZSQN20）。

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，上海 200032；2. 中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所。

毛玉林（1988—），男，碩士研究生，住院醫(yī)師，主要從事膿毒癥細(xì)胞免疫學(xué)方面的研究。

諸杜明，E-mail：duming_zhu@163.com。