黑龍江省蕓豆主栽品種蛋白質功能性質分析

鄭文彬 韓 晶 王 穎 張洪微 張麗萍 崔素萍

( 黑龍江八一農墾大學食品學院，大慶 163319)

黑龍江省蕓豆主栽品種蛋白質功能性質分析

鄭文彬 韓 晶 王 穎 張洪微 張麗萍 崔素萍

( 黑龍江八一農墾大學食品學院，大慶 163319)

為了解黑龍江省蕓豆蛋白質功能特性，利用熒光及紫外分光光度法，對En、紫荊花、白沙克、日本紅、西班牙白、英國紅6種蕓豆蛋白質功能性質進行了測定分析。研究表明，在pH 4.0左右時，6種蕓豆蛋白質溶解性最低；白沙克蕓豆蛋白質游離巰基及總巰基含量均最高，分別為41.3 μmol/g和75.2 μmol/g；En蕓豆蛋白質疏水性最強；6種蕓豆蛋白質質量濃度為5 g/100 mL時，起泡力均最大，起泡穩定性隨蛋白質濃度的增加而增加，隨時間的延長而降低；6種蕓豆蛋白質質量濃度在1～7 g/100 mL之間，隨著蛋白質濃度的增大，乳化性及乳化穩定性增大；隨著蛋白質濃度的增大，6種蕓豆蛋白質吸水能力增強，吸油能力隨著蛋白質所占比例的減小而增強；蕓豆蛋白質質量濃度為11 g/100 mL時，6種蕓豆蛋白質均產生凝膠現象；蕓豆蛋白質的各功能特性具有一定的相關性。

蕓豆蛋白質 功能性質 起泡力 乳化性 吸油性

蕓豆是豆科菜豆屬，是一種小宗雜糧作物，蕓豆具有很高的營養和藥用價值，其中蛋白質質量分數為20.29%～27.73%[1]。為了提高蕓豆蛋白質的加工品質，國內外很多學者對蕓豆蛋白質的功能特性進行了研究。尹壽偉等[2]在使用微射流技術對白蕓豆分離蛋白進行處理時，發現被處理后蕓豆分離蛋白的溶解性和乳化性均有所改善而不影響其蛋白質本身特性。熊家艷等[3]研究發現花蕓豆分離蛋白在pH 5時，持水量最低為87.7%，在pH 9時，持水量最高為95.4%。劉高梅等[4]研究了超聲波處理對涇川白蕓豆蛋白功能性的影響，當超聲波功率在0～400 W時，涇川白蕓豆蛋白的溶解度隨超聲波功率增加而逐漸提高。Wani等[5]通過對紫花蕓豆蛋白水解后功能性質的研究發現，紫花蕓豆胰蛋白酶水解物的溶解性、吸油性、吸水性和起泡力都顯著增強。Yin等[6]研究發現，圓蕓豆在受到外部高壓時，其蛋白高級結構逐漸展開，巰基含量和二硫鍵含量明顯增加，從而可使圓蕓豆的凝膠性增強。

如能充分了解蕓豆蛋白質的功能特性，可為蕓豆的加工提供技術支持。黑龍江省是我國綠色農產品生產基地，蕓豆種植面積位于全國之首，有關對黑龍江蕓豆主栽品種蛋白質功能性質的研究鮮見報道。本研究擬以黑龍江蕓豆主栽品種En、紫荊花、白沙克、日本紅、西班牙白、英國紅6種蕓豆為材料，研究6種蕓豆蛋白質的功能特性，以期為蕓豆等雜糧作物的開發和產業化提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

En、紫荊花、白沙克、日本紅、西班牙白、英國紅6種不同品種蕓豆：黑龍江省農墾科學院?；ㄉ停荷綎|魯花集團有限公司。

1.2 試劑與儀器

Ellman試劑：將DTNB( 5,5′-二硫代-2-硝基苯甲酸)溶入pH 7.0的磷酸緩沖溶液配制成1×10-3mol/L溶液；Tris-Gly緩沖液：將Tris與甘氨酸按1∶4.8的比例混合后溶于水配制成0.025 mol/L溶液。

RF-5301PC型熒光分光光度計：日本島津公司；SPECORD? 200 PLUS紫外分光光度計：德國耶拿分析儀器股份公司；CHRISTALpha型冷凍干燥機：德國Marin Christ公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

將大豆和6種蕓豆用粉碎機粉碎制粉，過60目篩子后，立即使用。

1.3.2 蕓豆蛋白質的提取

將蕓豆粉按1∶10(m/V)的比例溶于蒸餾水中，用2 mol/L NaOH 溶液調蕓豆粉溶液至pH 9.0 ，在50 ℃下，攪拌1 h，然后離心(3 500 r/min，離心30 min)，取上清液備用。再按1∶8(m/V)比例，在沉淀中加蒸餾水進行二次提取[8]。合并2次離心后的上清液，室溫下用1.0 mol/L HCL調節到pH4.4，在4 ℃下攪勻2 h，在4 000 r/min下，離心20 min，棄其上清液，所得沉淀經2次蒸餾水洗后，冷凍干燥得到蕓豆蛋白質。

1.3.3 蕓豆蛋白質功能性質測定

1.3.3.1 蕓豆蛋白質溶解性測定

將蕓豆粉和對照大豆粉用25 mLPBS磷酸緩沖溶液制備成質量分數為5%，pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0梯度的蛋白分散系，室溫下攪拌1 h，3 000 r/min下離心20 min，取上清液，用凱氏定氮法(GB 75009.5—2010食品中蛋白質的測定)測定上清液及樣品中總蛋白質含量[9]。蛋白質的溶解度用氮溶解度指數NSI(%)表示。

1.3.3.2 蕓豆蛋白質表面游離巰基含量及總巰基含量的測定

將蛋白質質量分數為5%的大豆蛋白對照及蕓豆蛋白的豆漿，在10 ℃、3 000 r/min下離心20 min，取上清液1 mL，加入3 mL Tris緩沖液和0.1 mL Ellman溶液，混勻后于25 ℃恒溫水浴中保溫5 min，用紫外分光光度計在412 nm波長下測定吸光值。以不加樣品而加Ellman溶液作為試劑空白，以不加Ellman溶液而加樣品作為樣品空白[10]。表面巰基含量公式：

式中：A412為除去樣品空白和試劑空白后的吸光值；D為稀釋倍數；13 600為摩爾吸光系數/L/(mol·cm)；C為樣品中蛋白質含量/g/L。

取2 mL 5%的蛋白質溶液，向其加入0.2%的β-巰基乙醇后振蕩搖勻2 h，加入4 mL 12%三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白質1 h，3 000 r/min離心10 min，用12%TCA洗滌沉淀4次，將洗滌后的沉淀溶于3 mL Tris-Gly緩沖液中，取其2 mL液體，測總疏基含量[11]。

1.3.3.3 蕓豆蛋白質表面疏水性測定

測試探針為8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)，將蛋白質含量為5 mg/100 mL的大豆蛋白對照及蕓豆蛋白的豆漿，在10 ℃，3 000 r/min下離心20 min，將其上清液蛋白質濃度稀釋至0.04～0.2 mg/mL 之間。取不同濃度稀釋樣品2 mL，在390 nm的激發波長和470 nm的發射波長下分別測定樣品的熒光強度(FI0)和大豆蛋白對照及蕓豆蛋白加入10 μL ANS溶液(8 mmol/L)后的熒光強度(FI1)，FI1和FI0的差值即為FI[12]，以蛋白質濃度為橫坐標，FI為縱坐標做圖，曲線初始階段的斜率即為蛋白質分子的表面疏水性指數，記為S0。

1.3.3.4 蕓豆蛋白質起泡力和起泡穩定性測定

取5 mL不同質量濃度的蕓豆蛋白粉懸浮液(1、3、5、7、9 g/100 mL)及大豆蛋白質對照懸浮液，用高速分散器10 000 r/min攪打2 min，記錄攪打前、后的體積。起泡力用體積增加的百分比表示。隨后，將攪打起泡的樣品靜置20、40、60和120 min，記錄不同時間段內的體積[7]。

式中:FC為起泡力/%；FS為起泡穩定性/%；V1為攪打前的體積/mL；V2為攪打后的體積/mL；V3為攪打后的泡沫體積/mL；V4為放置一段時間后的泡沫體積/mL。

1.3.3.5 蕓豆蛋白質乳化性及乳化穩定性測定

稱取一定量蕓豆蛋白質和大豆蛋白質樣品加入蒸餾水，分別配制成1、3、5、7 g/100 mL溶液30 mL，用分散器以10 000 r/min速度勻漿30 s，隨后加入5 mL花生油，勻漿30 s，再加入5 mL花生油，再勻漿90 s，測定乳濁液體積V1。在2 500 r/min下離心5 min，測量乳化層體積V2。隨后85 ℃下加熱15 min、冷卻，再在2 500 r/min下離心5 min，記錄加熱后剩余乳化層體積V3[13]。

式中：EA為乳化性/%；ES為乳化穩定性/%；V1為乳濁液體積/mL；V2為離心后乳化層體積/mL；V3為加熱再離心后乳化層體積/mL。

1.3.3.6 蕓豆蛋白質吸油性和吸水性測定

稱取0.5 g蕓豆蛋白質加入已稱重m1的離心管中，用蒸餾水配制成質量濃度為2、4、6、8、10 g/100 mL的溶液，分散、搖勻，室溫靜置30 min，期間每隔5 min振蕩1次，3 800 r/min離心30 min，棄去上清液，將離心管于50 ℃下干燥25 min，脫去附著在管壁的殘余水分，稱質量為m2[14]。

式中：WAC為吸水能力；m為樣品質量/g；m1為離心管質量/g；m2為離心管和沉淀物質量/g。

稱取1 g蕓豆蛋白質與花生油按照1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14質量與體積比例混勻，加入已稱重的離心管m3中，攪拌1 min，室溫靜置30 min，3 800 r/min下離心30 min，用吸管吸去上層液層，再將離心管倒置25 min，吸除流出的油脂，稱質量m4[15]。

式中：OAC為吸油能力；m為樣品質量/g；m3為離心管質量/g；m4為離心管和沉淀物質量/g。

1.3.3.7 蕓豆蛋白質最低凝膠點測定

取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 g蕓豆蛋白質溶于10 mL pH 7.0的0.1 mol/L NaCl溶液中，用磁力攪拌器攪拌20 min，制成2、4、6、8、10、12、14、16、18 g/100 mL的溶液，再用0.1 mol/L NaOH或HCl將溶液調至pH為7.0。經過90 ℃水浴中加熱30 min，冷卻至室溫，于4 ℃條件下靜置12 h，觀察凝膠情況：把試管倒置，凝膠不流出來的樣品定義為“+”，可形成自持凝膠；反之為“-”，不能形成凝膠[16]。

1.3.4 蕓豆蛋白質功能性之間的相關性分析

利用SPSS12.0分析系統對蕓豆蛋白質功能性之間的相關性進行統計分析。

1.4 統計分析方法

所有試驗均設3次重復，取平均值，利用SPSS12.0分析系統對數據進行統計分析。

2 結果分析

2.1 蕓豆蛋白質溶解性分析

圖1 6種蕓豆蛋白質溶解性

6種蕓豆蛋白質溶解性見圖1。在pH 4.0時，溶解性均最小，說明6種蕓豆蛋白質的等電點均在pH 4.0左右。6種蕓豆蛋白質的溶解性相似，該測量結果與毛豆、蠶豆、扁豆等其他豆類測量結果相似[17-18]。在pH 10.0時，蛋白質的溶解性均最大，其中，紫荊花蕓豆蛋白質的溶解性為59.2%，略大于其他品種，而西班牙白蕓豆蛋白質溶解性最小為52.3%。

2.2 蕓豆蛋白質表面游離巰基含量及總巰基含量分析

6種蕓豆蛋白質游離巰基含量及總含量見表1。

表1 6種蕓豆蛋白巰基含量

由表1可知，6種蕓豆蛋白質的游離巰基含量在28.4～41.3 μmol/g之間，而總巰基含量在50.3～75.2 μmol/g之間。6種蕓豆品種間蛋白質游離巰基含量和總巰基含量差別較大，其中西班牙白游離巰基含量和總巰基含量均最小，而白沙克含量均最大；且西班牙白和日本紅與其他品種的蛋白游離巰基含量有較顯著性差異(P<0.05)，而英國紅、紫荊花、En蕓豆之間差異不顯著。其中，白沙克、英國紅的游離巰基含量及總巰基含量比較高，且各品種間總巰基含量差異顯著。

2.3 蕓豆蛋白質表面疏水性分析

6種蕓豆蛋白質的疏水性指數結果見表2，各品種間蛋白質疏水性指數差異顯著(P<0.05)。一般來說，蛋白質的表面疏水性越強，它的親水性就越弱，表現為溶解度越小。由疏水性指數可知，En與西班牙白蕓豆蛋白質疏水性指數較大，所以其溶解性較小，而紫荊花指數較小，所以其溶解性較大。這與2.1中溶解性的測定結果相符合。

表2 6種蕓豆蛋白質疏水性指數

2.4 蕓豆蛋白質起泡力和起泡穩定性分析

6種蕓豆蛋白質的起泡力如圖2所示。

圖2 6種蕓豆蛋白質的起泡力

由圖2可知，當蕓豆蛋白質質量濃度為5 g/100 mL左右時，6種蕓豆蛋白質的起泡力均達到最大值，分別為En13.62%、紫荊花14.31%、白沙克15.37%、日本紅16.59%、西班牙白16.38%、英國紅15.26%，日本紅的起泡力最強，En的起泡力最弱；蕓豆蛋白質溶液質量濃度在1～5 g/100 mL之間時，起泡力隨著蛋白濃度的增大而增大，這是因為高濃度的蛋白質，其黏度也高，有助于在界面形成多層的黏合蛋白質膜[7]。當蛋白質濃度繼續增加時，起泡力就隨著濃度的增加而減小。同時如表3所示，不同品種在同一時間內，隨著蛋白質濃度的增加，起泡穩定性逐漸增大，這是由于，當蛋白質濃度較大時，蛋白質之間的相互作用形成了較厚的吸附膜，這有助于泡沫的穩定。相同濃度下的蕓豆蛋白質溶液的起泡穩定性隨著時間的延長而降低，其中當溶液質量濃度為9 g/100 mL，時間為20 min時，英國紅起泡穩定性最高為83.6%，En起泡穩定性最低為79.9%。

2.5 蕓豆蛋白質乳化性及乳化穩定性分析

6種蕓豆蛋白的乳化性如圖3所示，蛋白質質量濃度在1～7 g/100 mL范圍內，蕓豆蛋白的乳化性隨著蛋白濃度的增大而增強。蕓豆蛋白的乳化穩定性如圖4所示，蛋白的乳化穩定性也是隨著蛋白濃度的增大而緩慢增強。其中，En的乳化性及乳化穩定性高于其他品種，因為蛋白質的疏水性和乳化性具有顯著相關性，疏水作用對于形成穩定的乳化物很重要。因此，乳化性強的蕓豆蛋白其疏水性也強。表3、圖3的結果與原理基本相符。蛋白質的吸附特點是分級吸附，當濃度增大時，單分子吸附層變多分子吸附層，從而形成更加緊密且有強度的界面膜，使得其乳化能力和乳化穩定性增大[7]。

圖3 6種蕓豆蛋白的乳化性

圖4 6種蕓豆蛋白的乳化穩定性

2.6 蕓豆蛋白質吸油性和吸水性的測定結果

蕓豆蛋白質的吸水能力如圖5所示。6種蕓豆蛋白質在試驗濃度范圍內的吸水能力隨著溶液濃度的增大而增強，其溶液質量濃度在2～6 g/100 mL之間時，吸水能力增幅較大，之后趨于平緩。蛋白質的吸水能力源于其分子表面的極性基團和極性水分子的親和性，極性基團越多，吸水性越強，溶解度也就越強。其中英國紅和紫荊花的吸水能力較強，最大值分別為1.46%和1.44%，而其溶解度也是最大的。6種蕓豆蛋白的吸油性如圖6所示。在試驗范圍內隨著油所占比例的增大，其吸油能力逐漸增強，但增幅較平緩。通常來說，蛋白質的疏水基團越多，疏水性越強，其吸油能力越強，同理它的溶解性就越弱。由2.3中疏水性測得的結果看，其中西班牙白、En的疏水性較強，吸油能力較強，它的溶解性最弱。相反英國紅、紫荊花的疏水性較弱，吸油能力較弱，溶解性較強，基本符合測定結果。

表3 6種蕓豆蛋白的起泡穩定性測定結果/%

圖5 6種蕓豆蛋白的吸水能力

圖6 6種蕓豆蛋白的吸油能力

2.7 蕓豆蛋白最低凝膠點的測定結果

蕓豆蛋白質的凝膠情況如表4所示。蛋白質分散于水中形成膠體，且分子間相互聚集，形成相互作用力，即排斥力和吸引力。當排斥力小于吸引力時，分子間疏水相互作用加強，最終形成有空隙的立體網狀結構，繼而形成凝膠[19]。由表4可知，蕓豆蛋白的最低凝膠質量濃度在10 g/100 mL左右。其中白沙克、En和西班牙白蕓豆在蛋白質溶液質量濃度為11 g/100 mL時產生凝膠；英國紅、紫荊花和日本紅在蛋白質溶液質量濃度為10%時產生凝膠。

表4 6種蕓豆蛋白的凝膠情況

2.8 蕓豆蛋白質功能性之間的相關性分析

如表5所示，其中溶解性與吸水性呈正相關，二者相關性系數為0.304，如英國紅與紫荊花蕓豆蛋白質溶解度較強，最大值分別為58.1%和59.2%，而其吸水性也都較強，其最大值分別為1.46%和1.44%。蕓豆蛋白質溶解性與疏水性呈反相關，其相關系數為-0.646，如紫荊花蕓豆蛋白質溶解性較大，而其疏水性反而較小，疏水指數為163.2為最小。蕓豆蛋白質的乳化性、吸油性和疏水性呈正相關，蕓豆蛋白質中疏性越強，其吸油性、乳化性越大，如En蕓豆，其疏水指數較大為457.1，而其吸油性和乳化性均較強，分別為5.41%和52.3%。蛋白質凝膠作用強弱通常受蛋白質濃度大小的影響，也就是受蛋白質溶解性的影響，如紫荊花、英國紅蕓豆蛋白質溶解性較大，所以較容易凝膠，西班牙白蛋白質溶解性較小而不易凝膠。蕓豆蛋白質凝膠點與溶解性成反相關，其相關系數為-0.553。蕓豆蛋白中游離巰基含量和乳化穩定性呈反相關，相關系數為-0.599，這是由于自由巰基不能在乳化過程中形成二硫鍵，降低了蛋白質與蛋白質之間的相互作用，削弱了蛋白質膜穩定脂肪的能力；而游離巰基含量與蛋白質凝膠點呈正相關，其系數為0.370，游離巰基越多，凝膠速率越差，凝膠彈性越差。由此可見，蕓豆蛋白質的功能特性并非完全獨立，而是相互影響、相互作用的。

表5 6種蕓豆蛋白質功能性之間的相關性分析

3 討論

黑龍江省6種蕓豆主栽品種蛋白質各功能性質之間并非是相互獨立、完全不同的，而是存在著相互關聯作用。如蕓豆蛋白質的溶解性與吸水性成正相關，而與疏水性成反相關，這主要涉及蕓豆蛋白質與水分子之間的相互作用；蕓豆蛋白質的乳化性、吸油性和疏水性呈正相關，并且這3項指標的高低與蛋白質表面疏水性指數的大小有一定的關系；蛋白質表面疏水性指數越高，其吸油性、乳化性越大，親水性就越弱，表現為溶解度越??；蕓豆蛋白質凝膠點與溶解性成反相關。

蛋白質功能性質大多數影響著食品感官質量，也對食品成分制備、食品加工或儲存過程中的物理特性起重要作用。影響蛋白質功能性質的因素有很多，除蛋白質本身固有的物理化學性質如蛋白質分子的大小、形狀、化學組成、結構等性質，食品在加工過程中的環境因素，加工方法也都影響蛋白質的功能性質[20]。因此，了解蕓豆蛋白質的功能性質對蕓豆的深加工具有一定的指導意義。

4 結論

4.1 黑龍江省蕓豆主栽品種En、紫荊花、白沙克、日本紅、西班牙白、英國紅6種蕓豆蛋白質的等電點接近pH 4.0。

4.2 6種蕓豆蛋白質的起泡能力及起泡穩定性、乳化性及乳化穩定性、吸水能力及吸油能力等各項指標在品種間存在著差異，蛋白質疏水性指數品種間存在著顯著差異(P<0.05)。

4.3 6種蕓豆蛋白質的最低凝膠點的蛋白質質量濃度在11 g/100 mL左右。

4.4 6種蕓豆蛋白質的溶解性與吸水性呈正相關，溶解性與疏水性呈反相關，乳化性與吸油性、疏水性呈正相關，蛋白質凝膠點與溶解性成反相關。游離巰基與乳化穩定性呈反相關，與蛋白質凝膠點呈正相關。

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Analysis of Functional Properties of Protein of Main Cultivar Kidney Beans in Heilongjiang Province

Zheng Wenbin Han Jing Wang Ying Zhang Hongwei Zhang Liping Cui Suping

(College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319)

In order to understand the functional properties of kidney bean protein in Heilongjiang Province, the functional properties of En, Zijinghua, Baishake, Japanese red, Spain white and British red protein were analyzed by fluorescence and ultraviolet spectrophotometry. Results showed that the solubility of six kinds of kidney bean protein was the lowest with pH around 4.0; the free thiol and total sulfhydryl content of Baishake were the highest, 41.3 μmol/g and 75.2 μmol/g, respectively; En had the strongest hydrophobic property; the foaming ability of six kinds was the largest when the six kinds of kidney bean protein concentration was approximately 5%, the foaming stability was increased with the increase of protein concentration, and decreased with the extension of time ; emulsifying ability and stability were increased with the increasing of protein concentration when the six kinds of kidney bean protein concentrations were among 1%～7%; with the increase of protein concentration, water absorbing capacity of six kinds of kidney bean protein was increased, while oil-absorbing ability was also increased with the decrease of the proportion of protein; six kinds of kidney bean protein produced gel phenomenon when the concentration was 11%.The different functional properties of kidney bean protein had certain relevance.This research provided the foundation for the deep processing of kidney bean varieties in Heilongjiang Province.

kidney protein, functional property, foaming ability, emulsifying ability, oil absorbing ability

黑龍江省農墾總局科技局項目(HNK125B-13-03)，“國家雜糧工程技術研究中心”組建項目(2011 FU125)，黑龍江省教育廳項目(JG2012010 458)

2015-07-06

鄭文彬， 男，1990年出生，碩士，糧食、油脂及植物蛋白工程

崔素萍，女，1968年出生，教授，食品生物化學和分子生物學

TS201.2

A

1003-0174(2017)02-0006-07