MiR-137在缺血性卒中后抑郁患者外周血中的表達及其臨床意義

魯豫，田小軍，史莉瑾，蘇洲，郭雙喜，王玉梅

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MiR-137在缺血性卒中后抑郁患者外周血中的表達及其臨床意義

魯豫，田小軍，史莉瑾，蘇洲，郭雙喜，王玉梅

目的 探討缺血性卒中后抑郁患者miR-137的變化及臨床意義。方法 采用中國急性缺血性腦卒中診治指南 2014急性腦梗死診斷標準、漢密爾頓抑郁量表(HAMD-24項)、精神障礙診斷及統計手冊第五版(DSM-5)將研究對象分為正常對照組、抑郁癥組各20例，并發抑郁組、未并發抑郁組各37例。運用實時熒光定量PCR方法(qRT-PCR)檢測各組microRNA(miRNA)-137的表達水平，并對相關結果進行比較。結果四組樣本的性別、年齡、合并高血壓病、合并糖尿病、合并心臟病、NIHSS評分差異無統計學意義(均P>0.05)。與未并發抑郁組相比,并發抑郁組左側腦梗死例數明顯增高(P<0.05)。與正常對照組相比,未并發抑郁組、并發抑郁組miR-137水平明顯降低(均P<0.05)；與未并發抑郁組相比，并發抑郁組miR-137水平明顯降低(P<0.05)；并發抑郁組、抑郁癥組miR-137水平差異無統計學意義(P>0.05)。結論 缺血性腦卒中會引起miR-137表達水平的下降，并且miR-137表達水平的下降參與缺血性卒中后抑郁的形成。miR-137可以作為缺血性卒中后抑郁的預測、診斷及治療指標。

腦卒中；卒中后抑郁；miR-137

卒中后抑郁(PSD)是腦卒中后最常見的心理行為障礙并發癥，主要表現為認知功能障礙、情緒低落或興趣的缺失[1]，對腦卒中患者神經功能的康復具有明顯的負面影響。腦卒中后1個月內其發病率為17%～52%[2]，而作為占全部腦卒中約60%～80%的缺血性腦卒中，其PSD的發病率更高。原發性抑郁癥的治療主要包括單胺氧化酶抑制劑、三環類抗抑郁藥、選擇性5-羥色胺再攝入抑制劑、選擇性去甲腎上腺素再攝取抑制劑。而單胺氧化酶抑制劑、三環類抗抑郁藥由于其毒副作用大、不良反應多，治療劑量與中毒劑量相近，目前已較少使用。選擇性5-羥色胺再攝入抑制劑、選擇性去甲腎上腺素再攝取抑制劑的可選擇性也較少。因此針對PSD發病機制的新型抗抑郁藥的出現就顯得尤為迫切。microRNA(miR)是一類長約19～22個核苷酸的單鏈小分子非編碼RNA，通過在轉錄后水平調控基因的表達來參與細胞的生長、發育、分化。近年來大量研究[3-5]表明miRs在神經元的生成、突觸可塑性及腦源性神經營養因子生成等方面均扮演者重要角色，并參與抑郁癥的形成。PSD作為一種特殊類型的抑郁癥，其發病是否也與miRs相關呢?查閱相關文獻[6-12]，發現BLC2、SLC6、CREB1、Grin2A基因參與PSD形成，進一步通過miRBASE、miRDB、TARGETSCAN-VERT等軟件進行靶基因預測發現上述基因均是miR-137潛在靶基因，受miR-137的調控。因此本研究選擇miR-137作為缺血性PSD的臨床研究方向以探討缺血性PSD患者miR-137的變化，為進一步研究miR-137在缺血性PSD中的作用提供基礎理論，并發現新的缺血性PSD的預測、診斷及治療指標。

1 對象與方法

1.1 對象 以2016年1月～2016年6月新鄉醫學院第一附屬醫院確診的首次急性缺血性腦卒中住院患者為研究對象，于確診14 d后根據漢密爾頓抑郁量表(HAMD-24項)評分標準將其分為并發抑郁組(≥ 20 分)和未并發抑郁組(<8分)。選取同期新鄉醫學院第二附屬醫院確診的抑郁癥住院患者(既往無腦梗死病史)20例為抑郁癥組及新鄉醫學院第一附屬醫院健康體檢者(既往無腦梗死、抑郁癥病史)為正常對照組。各組具體情況:(1)并發抑郁組：37例，男24例，女13例；年齡35～75歲，平均60.58歲。(2)未并發抑郁組：37例，男24例，女13例;年齡45～76歲，平均60.44歲。(3)抑郁癥組:20例，男13例，女7例;年齡41～75歲，平均60.50歲。(4)正常對照組：20名，男13名，女7名;年齡37～78歲，平均62.79歲。并發抑郁組及未并發抑郁組納入標準：(1)首次急性缺血性腦卒中的診斷均符合中國急性缺血性腦卒中診治指南 2014 診斷標準[13]，并經頭顱 MRI-DWI 檢查證實，且NIHSS評分<16分；(2)抑郁癥的診斷均符合精神障礙診斷及統計手冊第五版(DSM-5)的規定[14]，且HAMD 評分≥ 20 分。排除標準：(1)NIHSS評分>16分，即神經系統功能嚴重缺損導致意識障礙、聽力障礙、失語等無法配合檢查者；(2)合并對機體精神狀態可能產生消極影響的癲癇、Alzheimer’s病、自身免疫性疾病、腫瘤、甲狀腺功能減退等疾病者；(3)既往有腦卒中病史者；(4)伴有嚴重的心、肺、肝、腎功能不全者；(5)伴有原發性抑郁癥的缺血性腦卒中患者；(6)既往有腦梗死病史的抑郁癥患者；(7)不愿意配合調查者。本研究經醫院倫理委員會批準通過，并獲得研究對象及其家屬的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 篩選入組 (1)缺血性腦卒中患者影像學證據收集：所有首發急性缺血性腦卒中患者均行頭顱MRI-DWI檢查，并記錄病變部位。(2)神經系統功能缺損及抑郁狀態評估：采用NIHSS量表對所有缺血性腦卒中患者進行神經系統功能缺損評估，<16分者入組；采用中國精神疾病診斷標準第三版(CCMD-3)規定及HAMD-24項評分標準對抑郁狀態進行評估，HAMD 評分≥20 分入組。上述評估均由2名或2名以上醫師完成，結果取均數。(3)基本資料登記：入院 24 h 內記錄所有入組患者基本情況，包括性別、年齡、腦卒中嚴重程度及高血壓病、糖尿病等。

1.2.2 miR-137定量檢測 (1)樣本外周血采集：缺血性腦卒中患者于確診14 d后采取清晨空腹8 h以上外周血2 ml，健康對照組采取清晨空腹外周血2 ml，抑郁癥組于抗抑郁治療之前抽取清晨空腹外周血2 ml， EDTA-K2抗凝管4℃保存。(2)總RNA提取：4℃保存的外周血于抽取后6 h內應用RNAiso Blood提取總RNA，并依次應用超微量分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度與完整性，提取的RNA純度與完整性合格后，于離心管中-80℃保存以進行下一步實驗。(3)逆轉錄成cDNA：采用Prime Script TMRT reagent Kit with gDNA Eraser進行基因組DNA消化及逆轉錄反應。(4)實時熒光定量PCR (qRT-PCR)反應：應用SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)和qRT-PCR儀進行miR-137的定量檢測：以U6作為內參，最終配制成25 μg反應體系。反應條件：預變性：1個循環、95℃30 s；PCR反應：40個循環、95℃30 s、60℃34 s。反應結束后得到循環閾值Ct，計算表達量。每個樣本做3個復孔實驗，取平均值。ΔCt=CtmiR-137-CtU6，ΔΔCt=(實驗組ΔCt)-(對照組ΔCt)，2-ΔΔCt為miR-137的相對表達量。

2 結 果

2.1 四組樣本臨床基本資料比較 見表1。四組樣本的性別、年齡、合并高血壓病、合并糖尿病、合并心臟病、NIHSS評分差異無統計學意義(均P>0.05)；并發抑郁組與未并發抑郁組相比其左側腦梗死例數明顯增高(P<0.05)。

表1 四組臨床基本資料比較(x±s，例，%)臨床資料正常對照組(n=20)未并發抑郁組(n=37)并發抑郁組(n=37)抑郁癥組(n=20)P值男性13(65．00)24(64．86)24(64．86)13(65．00)1．000年齡(歲)62．79±7．4560．44±8．6360．58±8．0560．50±9．720．601合并高血壓病10(50．00)20(54．05)19(51．35)11(55．00)0．976合并糖尿病9(45．00)18(48．65)17(45．95)10(50．00)0．977合并心臟病10(50．00)19(51．35)17(45．95)9(45．00)0．933左側腦梗死-7(18．92)28(75．68)-0．000NIHSS評分(分)-5．84±3．116．16±2．22-0．602

2.2 總RNA檢測結果 見圖1。應用超微量分光光度計檢測各樣本的總RNA純度，OD 260/280在1.7～2.1之間，說明總RNA提取純度好，無蛋白等其他成分污染，無降解。提取的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描成像可見28S，18S及5.8S三條帶完整清晰，無擴散現象，28S條帶亮度約為18S條帶2倍，樣本總RNA提取合格，且5.8S條帶清晰可見(根據miR bp值，miR電泳位置位于5.8S)，故可繼續下一步實驗。

2.3 擴增曲線及熔解曲線的結果 擴增曲線Ct值均<35，說明實驗數據均可靠。熔解曲線結果均為單峰曲線，說明該反應特異性良好，無引物二聚體等其它非目的性產物。

2.4 qRT-PCR相對定量檢測miR-137結果 (1)miR-137的相對表達量即2-ΔΔCt值在并發抑郁組(0.003±0.000)、未并發抑郁組(0.025±0.015)較正常對照組明顯降低(均P<0.05)；(2)2-ΔΔCt值在并發抑郁組(0.016±0.014)較未并發抑郁組明顯降低(P<0.05)；(3)2-ΔΔCt值在并發抑郁組(1.272±0.517)較抑郁癥組差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 四組外周血樣本總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖結果 注： 1、2、3、4 分別為正常對照組、抑郁癥組、并發抑郁組、未并發抑郁組

3 討 論

腦卒中是一種嚴重威脅人類健康的難以治愈疾病，它具有很高的發病率、致殘率及死亡率。近幾年的研究[15]表明腦卒中的發病率以每年9%的速率進行增長，并且已經成為中國人的主要死亡原因之一。PSD是腦卒中后最常見的一種精神行為并發癥，與腦卒中患者的神經功能、社會功能的恢復密切相關。急性腦卒中患者至少有1/3最終會發展為抑郁，而抑郁會增加腦卒中的發病率、致殘率、死亡率[16]。

有研究[17]表明抑郁的病理機制可能為神經再生減少及大腦突觸可塑性失調，而腦卒中等急性應激可導致部分神經營養信號通路減弱，海馬及前額葉皮質神經元再生、突觸可塑性受損等，從而通過邊緣系統導致抑郁的產生，說明腦卒與抑郁具有相關性。另外miRs在神經元的生成、突觸可塑性及腦源性神經營養因子生成等方面均扮演者重要角色[5]，由此推測腦卒中可能會通過影響miRs來調節抑郁的產生。檢索大量文獻后發現，關于miRs與PSD的研究較少，且研究內容僅局限在某一miR的一個方面。本實驗通過靶基因預測發現，miR-137調控BLC2、SLC6、CREB1、Grin2A等多種PSD相關基因，能從上述多種機制參與PSD形成，且目前尚無相關臨床研究。因此認為，miR-137可能在PSD形成中發揮重要作用，有望成為新的藥物治療靶點，具有重要研究價值。

本實驗通過對各組臨床基本資料如：年齡、性別、合并常見慢性疾病、神經功能缺損情況等進行統計學分析，發現上述各指標在各組間不具有統計學差異，即確保了混雜因素在各組間無差異性，保證了缺血性腦卒中為唯一變量，進而使miR-137的表達不受缺血性腦卒中以外的其他因素影響，使研究結果更加可信。另外，通過對比并發抑郁組及未并發抑郁組，本研究發現左側大腦半球梗死(特別是基底節區及額葉梗死)更容易引起抑郁狀態的產生，這可能與大腦半球不同部位的不同功能有關。對比各組間miR-137表達量發現，缺血性腦卒中會引起外周血miR-137水平下調，并發抑郁組miR-137水平下調更明顯，甚至已經超過單純抑郁癥組。綜上所述，缺血性腦卒中會引起miR-137表達水平的下降，并且miR-137表達水平的下降參與缺血性PSD的形成。miR-137可以作為缺血性PSD的預測、診斷及治療指標。但本實驗尚存在一定的不足之處：(1)由于腦卒中患者住院療程的限制，本實驗納入樣本量不夠大；(2)miR-137調控基因的最終作用機制，即分子、蛋白水平的調控，尚需進一步的臨床實驗進行研究。

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Expression and its clinical significance of miR-137 in peripheral blood of patients with depression after ischemic stroke

LUYu,TIANXiao-jun,SHILi-jin,etal.

DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453100,China

Objective To explore the changes of miR-137 of patients with depression after ischemic stroke and its clinical significance. Methods All the patients were separately divided into four groups according to the following rating scales: 2014 diagnostic criteria for acute cerebral infarction, Hamilton depression scale(HAMD-24), Diagnostic and statistical manual of mental disorders, the fifth edition (DSM-5)were applied to categorizing. According to the above grouping standards,all the patients were grouped as normal control group (n=20),the depression group (n=20), post-stroke depression group (n=37),no depression after stroke group (n=37). The expression level of microRNA(miR)-137 in each group was detected by quantitative real-time PCR(qRT-PCR),and the results were compared. Results The difference of gender,age,chronic dieases,the site of infarction,NIHSS score had no statistical significance in the four group (allP>0.05). Compared with no depression after stroke group, the number of patients with left cerebral infarction was significantly increased in post-stroke depression group(P<0.05). Compared with the normal control group,miR-137 in no depression after stroke group and in post-stroke depression group significantly decreased(allP<0.05); compared with no depression after stroke group, miR-137 in post-stroke depression group significantly decreased(P<0.05); the level of miR-137 between post-stroke depression group and depression group showed no statistical significance (P>0.05).Conclusions Ischemic stroke can induce the low expression of miR-137 which participates in the formation of post-stroke depression.miR-137 may act as a predictive,diagnostic，therapeutic index of poststroke depression.

stroke;post-stroke depression;miR-137

453100新鄉醫學院第一附屬醫院神經內科

王玉梅

R746.13

A

1004-1648(2017)03-0217-04

2016-07-26

2016-08-29)