中醫藥治療糖尿病腎病臨床與基礎研究—中日友好醫院臨床醫學研究所李平教授團隊學術研究進展

中醫藥治療糖尿病腎病臨床與基礎研究—中日友好醫院臨床醫學研究所李平教授團隊學術研究進展

慢性腎臟病療效評價重點研究室隸屬于國家中醫藥管理局，依托于中日友好醫院臨床醫學研究所，整合了國家中醫藥管理局中藥藥理（腎臟）三級實驗室、國家中醫藥管理局重點學科“中西醫結合臨床學科”、免疫炎性疾病北京市重點實驗室。研究室主任為李平教授。

一、學術研究思路

李平教授師從于我國著名中醫腎臟病專家時振聲教授，早在20世紀80年代末與時振聲教授一起提出“氣陰兩虛”是慢性腎臟病的發病關鍵。圍繞引起慢性腎功能衰竭的最主要疾病——糖尿病腎病，李平教授帶領其團隊在臨床和基礎領域開展系列研究。

糖尿病腎病是糖尿病嚴重的微血管并發癥，也是患者死亡的重要原因。最新資料表明，我國糖尿病的患病率為11.6%，糖尿病腎病約占糖尿病患者的33.6%。顯性蛋白尿是糖尿病腎病疾病進展的重要危險因素，加速了糖尿病腎病進展至終末期腎病。目前，現代醫學針對顯性蛋白尿缺乏有效的治療方案。中醫藥在糖尿病腎病顯性蛋白尿的治療上積累了一定的臨床經驗，然而缺乏高質量循證醫學證據，缺少量化和客觀化的評價指標，藥物作用機制不清楚，限制了中醫藥在國內外的推廣與應用。

針對上述關鍵科學問題，李平教授課題組形成了三個主要研究方向：中醫藥防治糖尿病腎病臨床療效評價研究，中醫藥防治慢性腎臟病的系統生物學研究，中醫藥防治慢性腎臟病有效方藥及相關機理研究（圖1）。

二、團隊研究方向與進展

1.中醫藥治療糖尿病腎病臨床療效評價研究

1.1 提出治療糖尿病腎病以“益氣活血”為主，“疏肝柔肝”為輔的治療思路

該團隊對近30年來中醫藥治療糖尿病腎病的1 464篇臨床隨機對照研究文獻進行了回顧性研究。研究發現，頻次大于20%的證候依次為血瘀（89.9%）、氣虛（83.4%）、陰虛（66.2%）、腎虛（48.5%）、肝郁（41.8%）、脾虛（31.6%）和濕濁（21.8%）。在此基礎上，又通過350例臨床病例研究，發現糖尿病腎病患者主要表現為氣虛血瘀證，其病機為肝失疏泄，腎絡瘀阻，肝腎兩虛。該團隊創新性地提出治療糖尿病腎病以“益氣活血”為主，“疏肝柔肝”為輔的治療思路。針對糖尿病腎病微量白蛋白尿期及顯性蛋白尿期，分別采用“益氣疏肝、活血利濕”和“益氣柔肝、活血通絡”的方法進行治療，并研制了有效治療藥物——柴黃益腎顆粒和糖腎方。針對糖尿病腎病顯性蛋白尿治療這一國際難題，重點研究了“益氣柔肝、活血通絡”方（糖腎方）（圖2）。方中黃芪補脾肺之氣為君藥；生地、山萸肉柔肝滋腎，具有固精（精微）之效為臣藥；三七、大黃、鬼箭羽、枳殼，調暢氣血，活血通絡，推陳致新為佐藥，該方獲國家發明專利（專利號:ZL 2009 1 0241369.0）。

圖1 中醫藥防治糖尿病腎病臨床與基礎研究整體思路

圖2 糖腎方處方來源與臨床研究思路圖

1.2 采用國際規范的循證醫學方法評價益氣活血方藥治療糖尿病腎病的臨床療效

在全國范圍內完成了2次糖腎方10家中心、隨機雙盲、安慰劑平行對照治療糖尿病腎病的臨床試驗。首次臨床試驗于2007年4月至2009年12月間，在北京、上海、河北唐山等地6家三甲醫院進行（注冊號：ChiCTR-TRC-10000843，中日友好醫院倫理號：2006-059）。共納入180例氣虛血瘀證2型糖尿病腎病（符合微量白蛋白尿期和顯性蛋白尿期）患者，隨機分為糖腎方組和安慰劑對照組。糖腎方組：ACEI/ARB加糖腎方（配方顆粒）；安慰劑組：ACEI/ARB加安慰劑（配方顆粒），共計給藥24周。研究結果顯示：糖腎方改善了顯性蛋白尿期患者倦怠乏力、肢體麻木等氣虛血瘀相關癥狀，與安慰劑比較差異顯著（P=0.0371）。在微量白蛋白尿期，糖腎方治療組在減少尿蛋白排泄和改善腎小球濾過率方面與國際公認的一線用藥ACEI/ARB療效一致，在延緩腎功能進展方面更具優勢；在顯性蛋白尿期，尿蛋白排泄增加，腎小球濾過率呈進行性下降，此時ACEI/ARB加安慰劑治療無法阻止疾病進展，在此階段糖腎方明顯起到了降低24 h尿蛋白定量，提高腎小球濾過率的治療作用（圖3）。第2次臨床試驗（注冊號：ChiCTR-TRC-13003566，中日友好醫院倫理號：2013-046）進一步證實了糖腎方改善糖尿病腎病顯性蛋白尿期患者腎功能作用。課題組驗證了“益氣柔肝、活血通絡”方藥為糖尿病腎病顯性蛋白尿的治療提供了新的有效措施，阻止了糖尿病腎病的進一步惡化。

圖3 糖腎方治療糖尿病腎病臨床療效分析

1.3 利用定量代謝組學方法評價“益氣柔肝、活血通絡”方治療糖尿病腎病的臨床療效

中醫藥臨床療效評價的客觀化一直備受關注。目前認為，西醫公認的實驗室指標、生存量表、中醫癥狀積分表等指標不能完全體現和評價中醫療效。新陳代謝是生命活動的基本形式。一切生命活動最終都會體現到一定的代謝狀態中。因此，本團隊采用代謝組學方法評價了中藥治療糖尿病腎病的臨床療效。進一步對上述臨床試驗研究過程中采集的中藥組（西醫常規治療+糖腎方）和對照組（西醫常規治療+安慰劑）治療前、治療12周和治療24周的血液樣本進行了代謝組學的檢測。首先采用定量代謝組學方法，篩選了藥物干預疾病過程中代謝變化的潛在生物標志物PC、LysoPC、PE、LysoPE、SM、TG等磷脂類和一些嘌呤/嘧啶類。其次，比較兩種治療方法的治療差異，兩組導致代謝物含量變化幅度有明顯差異，中藥組較對照組有明顯優勢，治療后更接近正常人，提示療效更明顯。最后，中藥組與治療前、正常對照組進行差異比較，隨著治療時間的延長，代謝物含量越接近正常人水平（圖4）。結果顯示，糖腎方可逆轉糖尿病腎病顯性蛋白尿期患者的代謝紊亂。該研究為解決中醫藥臨床療效的不穩定和難以重復提供了新的研究途徑。

肝型脂肪酸結合蛋白（L-FABP）是腎損傷的標志分子，可作為糖尿病腎病早期診斷、疾病進展的評估及監測的標志物。在正常人群、糖尿病、糖尿病腎病微量白蛋白尿和顯性蛋白尿患者中，尿LFABP水平呈逐漸升高趨勢。臨床研究發現，糖腎方可顯著降低糖尿病腎病微量白蛋白尿和顯性蛋白尿患者L-FABP水平（圖5）。

從臨床常規實驗室指標、系統生物學指標體系和機制相關分析多個層面證實了“益氣柔肝、活血通絡”方治療糖尿病腎病的臨床療效，為其推廣應用提供了可靠的臨床研究證據。

圖4 糖腎方治療后糖尿病腎病患者潛在標志物含量變化趨勢圖

2.中醫藥防治慢性腎臟病的系統生物學研究

2.1 創建糖尿病腎病臨床-基礎相結合的多系統整合生物標志物體系

為了提高糖尿病腎病的早期預警，項目組在臨床研究的基礎上，將1 400例橫斷面研究和350例系統生物學分析結果相結合，從代謝組學、蛋白質組學、基因組學等多個層面分析了益氣活血藥物治療糖尿病腎病的分子標志物。在此基礎上，將其與臨床理化指標、中醫證候、中醫癥狀等進行相關性分析，創建了糖尿病腎病臨床-基礎相結合的多系統整合生物標志物體系，為糖尿病腎病早期預警提供了多系統整合生物標志物體系，為益氣活血藥物治療糖尿病腎病提供了科學依據（圖6）。

2.2 利用系統生物學方法揭示了益氣活血方藥治療糖尿病腎病顯性蛋白尿的療效機制

為了揭示益氣活血方藥治療糖尿病腎病顯性蛋白尿的作用機制（圖7），本團隊通過網絡藥理學方法發現了益氣活血方藥中22種入血成分所對應的73個潛在作用靶蛋白，構建了調控作用網絡；采用項目組創立的化學物質組學方法，通過“自上而下，逐層遞進”的組效相關研究，發現了黃芪總黃酮、三七總皂苷及柴胡總皂苷為益氣活血方藥中主要有效組分，其中毛蕊異黃酮苷和柴胡皂苷-d為君藥的最主要單體有效成分；整合基因組學、定量代謝組學及藥理研究發現：益氣活血方藥通過調控ABCA1/ RXR通路改善脂代謝紊亂及磷脂代謝異常，減輕了脂毒性對濾過膜的損傷；進而，項目組發現抑制NF-κB通路誘導的炎癥因子異常升高，阻斷miRNA21介導的TGF-β/Smad通路減少了纖維化I、IV型膠原積聚，通過調控JAK/STAT/SOCS通路同時改善了炎癥與纖維化，減少其對腎小球濾過屏障及腎小管重吸收功能的損害，降低了尿蛋白排泄。

2.3 代謝組學研究發現益氣活血方藥通過抑制肝臟有機毒素分子代謝改善腎臟損害的新機制

圖5 糖腎方改善糖尿病腎病患者尿L-FABP水平趨勢圖

圖6 創建了臨床-基礎相結合的多系統整合生物標志物體系

本團隊率先采用代謝組學方法在國際上報道有機毒素（尿毒素和葡萄糖甘酸物質）在糖尿病腎病大鼠腎皮質中含量明顯升高，且與蛋白尿及腎小管間質損傷程度有顯著正相關。尿毒素分子主要在肝臟合成，并從血漿經腎小管主動排泌。血中尿毒素濃度升高，可損傷腎小管，促進腎小球硬化和小管間質纖維化，加劇糖尿病腎病進展。實驗結果證明，益氣活血方藥顯著抑制肝臟尿毒素分子生物合成及其在腎臟的蓄積，降低對腎臟的損傷，其綜合作用優于蒙諾，為該研究從肝論治糖尿病腎病提供了有力的實驗證據（圖8）。

2.4 蛋白質組學研究發現糖尿病腎病發病機制中起重要作用的潛在靶蛋白和益氣活血方藥的作用靶標

本團隊利用2型自發性糖尿病腎病模型OLETF大鼠和遺傳背景相似但不發病的LETO大鼠，運用2DE-MALDI-TOF技術對大鼠腎皮質進行了亞差異蛋白質組學研究。與LETO大鼠相比，OLETF大鼠腎皮質中編碼ETFb、EPHX2等9個蛋白的基因發生了多個位點的錯義突變。通過信息生物學分析這些突變可能在糖尿病腎病發生發展過程中起著重要作用。而糖腎方干預OLETF大鼠的腎皮質中3種可溶蛋白（BOP1NT、rCG56248、Cryab）和4種難容蛋白（Vcl_predicted，MYL6，Uqcrfs1，Gpx3）表達降低；6種可容蛋白（Tsta3、Lactb2、Ech1、Psma1、Gsto1、Hmgb1）及5種可容蛋白（Timm，Atp6v1e1、Ppia、LOC683519、Dmgdh）表達增高（圖9）。提示糖腎方對腎病糖尿病的治療作用可能是通過調控上述蛋白來實現的。

圖7 益氣活血方治療糖尿病腎病蛋白尿分子機制研究模式

2.5 利用基因組學研究揭示益氣活血方藥改善糖尿病腎損傷的分子靶標及其作用機制

為了進一步探索益氣活血方藥治療糖尿病腎病的分子靶標，項目組選用db/db小鼠作為2型糖尿病模型鼠，糖腎方干預可以明顯減輕db/db小鼠腎損傷。基于基因表達譜芯片數據以及體內、體外實驗分析，表明了PLZF可能是糖腎方治療糖尿病腎病的分子靶點。在糖尿病狀態下，高糖可顯著上調腎小管上皮細胞中PLZF的表達水平，抑制細胞自噬水平，進一步抑制膠原Ⅲ的自噬性降解，導致腎小管上皮細胞的膠原沉積。而糖腎方可通過下調PLZF的表達，減輕腎小管上皮細胞的膠原沉積，改善糖尿病腎損傷（圖10）。

圖8 益氣活血方藥抑制肝臟尿毒素合成，保護腎臟

圖9 蛋白質組學研究發現益氣活血方治療糖尿病腎病的靶蛋白

3.藥物有效成分與作用機制研究

3.1 利用4種實驗動物模型證實益氣活血方藥治療糖尿病腎病顯性蛋白尿優于ACEI/ARB類藥物

為了更好地評價益氣活血方藥改善糖尿病腎病顯性蛋白尿的藥效學作用，項目組以ACEI/ARB（蒙諾/安博維）為陽性對照藥，分別利用自發性2型糖尿病腎病db/db小鼠或OLETF大鼠模型；單側腎切除合并鏈脲佐菌素誘導糖尿病腎病或高脂飲食合并鏈脲佐菌素誘導的糖尿病腎病大鼠模型針對益氣活血方藥（柴黃益腎顆粒和糖腎方）開展了系列實驗研究（圖11）。研究證實了益氣活血方藥在降低24h尿蛋白排泄、改善腎臟組織病理損傷方面均顯著優于陽性對照藥蒙諾/安博維，為臨床試驗結論提供了強有力的實驗支撐依據。

3.2 揭示益氣活血方藥抑制糖尿病腎病炎癥和纖維化分子機制

糖尿病腎病是一種炎癥性疾病，隨著病程進展最終出現腎臟纖維化。在益氣活血法的指導下，項目組針對糖尿病腎病早期微量白蛋白尿采用“益氣疏肝、活血利濕”的柴黃益腎顆粒治療，發現該藥物主要通過改善糖尿病腎病的微炎癥狀態，從而起到腎臟的保護作用。針對糖尿病腎病的顯性蛋白尿，項目組采用“益氣柔肝、活血通絡”的糖腎方治療，發現該藥物主要通過抗炎和抗纖維化作用，有效治療糖尿病腎病中晚期病變，減輕了腎小球硬化和腎小管間質纖維化，減少了尿蛋白的排泄。NF-κB信號通路和TGF-β/Smad3通路是介導糖尿病腎病炎癥和纖維化的關鍵通路。益氣活血方藥通過抑制Smurf2表達，減少smad7水解，從而一方面促進IκBα表達，抑制NF-κB驅動的炎癥反應；一方面降低Smad2/3磷酸化水平，減輕TGF-β/Smad3介導的腎臟纖維化（圖12）。

3.3 基于Luficerase Reporter技術評價了糖腎方及其組分調控糖尿病腎病相關信號通路

圖10 基因組學研究發現了益氣活血方通過調控PLZF表達改善糖尿病腎病的分子機制

圖11 益氣活血方減少糖尿病腎病蛋白尿，改善腎組織病理損傷優于ACEI/ARB類藥物

圖12 揭示益氣活血方藥抑制糖尿病腎病炎癥和纖維化機制

為了進一步優化糖腎方組方配伍，闡釋物質基礎，我們與耶魯大學醫學院藥理系鄭永齊教授合作，利用其實驗室建立的Luciferase reporter信號通路藥物篩選技術平臺，選擇與糖尿病腎病發生發展密切相關的TGFβ/Smad、AP-1、STAT3、NF-κB及NRF2 5個信號通路，對糖腎方2種不同提取方法，4種配伍組合、7個單味中藥及其中10個單體化合物進行了篩選評價。研究發現糖腎方中的枳殼、衛矛和大黃對TGFβ1/smad通路和AP-1通路具有抑制的作用，而方中的黃芪對NRF2通路明顯的上調作用，其中的有效成分為毛蕊異黃酮-7-β-O-D-葡萄糖苷（圖13、圖14）。

3.4 闡釋益氣活血方藥改善糖尿病脂代謝紊亂的分子機制

臨床與基礎研究發現，益氣活血方藥（糖腎方）具有調節血脂水平的作用。肝臟是胰島素抵抗的靶器官及脂代謝的重要場所，糖尿病患者體內游離脂肪酸水平升高激活炎癥通路，肝臟和腎臟一方面成為炎癥因子作用的靶器官，也是炎癥因子產生器官，釋放加重系統性炎癥反應，加快脂肪肝和DN的病理進程。課題組采用自發性糖尿病小鼠模型db/db小鼠，發現糖腎方可降低db/db小鼠體重及肝臟系數，降低血脂水平，顯著改善db/db小鼠的脂質代謝紊亂和肝臟脂肪變；該保護作用與糖腎方通過AMPK/SREBPs及其下游靶基因顯著抑制db/db小鼠肝組織脂質生成、通過Sirt/PGC1α增加肝組織與骨骼肌脂肪酸氧化利用，同時調節PI3K/Akt/mTOR信號通路及巨噬細胞活化等代謝途徑相關（圖15）。

三、研究團隊及主要科研成果

李平，女，漢族，醫學博士，主任醫師，研究員，中國醫學科學院協和醫科大學及北京中醫藥大學博士生導師。師從于我國著名中醫腎臟病專家時振聲教授，于1997年7月獲得中國中醫研究院中醫內科博士學位；1999年5月于日本新瀉大學腎臟病研究所獲得基礎醫學博士學位。主要研究方向為中醫藥治療慢性腎臟病的臨床與新藥開發研究。2003年被評為國家留學回國先進個人；2007年被評為國家中央機關優秀女科技工作者、國家首屆杰出女中醫師。2007-2008年度衛生部有突出貢獻的中青年專家，獲國務院政府特殊津貼；2011年獲“十一五”國家科技計劃執行突出貢獻獎。社會兼職10余項，包括世界中醫藥學會聯合會臨床用藥安全研究專業委員會會長，中國中醫藥研究促進會糖尿病專業委員會副主任委員，世界中醫藥學會聯合會第二屆內科腎臟病專業委員會副會長等。

圖13 基于熒光素酶報告基因系統的中藥復方有效成分篩選思路

圖14 利用熒光素酶報告基因系統篩選了糖腎方治療糖尿病腎病藥味及成分

李平教授團隊現有16位在職人員，其中研究員1人，副研究員4名、助理研究員6人、主治醫師2人，副主任技師2名，10人擁有博士學位，6人曾在日本、美國和香港等地訪問學習。該團隊承擔國家973項目、科技部國際科技合作項目、科技部“十二五”重大專項、國家自然基金委重點國際合作研究項目、國家自然科學基金面上/青年項目等國家級課題15項，省部級科研課題10項。獲得科技獎勵10項，包括國家科技進步二等獎1項、中華中醫藥學會科學技術一等獎1項、北京市科技進步二等獎1項、中華中醫藥學會科技著作一等獎1項等；獲得國家發明專利5項；發表學術論文二百余篇，其中SCI論文64篇。出版學術著作9部。先后出站博士后2名，培養博士研究生21人，碩士研究生17人。

該團隊是國內較早開展國際合作科研項目的單位。2006年與加拿大馬尼托巴大學、日本新瀉大學合作承擔科技部國際科技合作專項，2012年與美國耶魯大學、香港中文大學合作承擔科技部國際合作項目，2012年與加拿大英屬哥倫比亞大學合作承擔科技部國際合作項目。自2012年，團隊邀請海內外知名專家，先后承辦“中西醫結合防治糖尿病并發癥高峰論壇”、“腎科醫生中西醫結合基礎與臨床學術論壇”、“學科建設、科學研究高峰論壇”和“中西醫結合治療糖尿病腎病臨床論壇”。2016年李平教授以北京市重點實驗室為依托，成立了世界中醫藥學會聯合會臨床用藥安全研究專業委員會，并舉辦“肝腎疾病臨床合理用藥與安全評價研究進展”國際論壇。團隊秉承開放原則，積極開展國際合作與交流，推動中醫藥國際化進程。

圖15 糖腎方通過調控PI3K/AKT/mTOR信號通路有效改善2型糖尿病腎病糖脂代謝紊亂

李平教授帶領其團隊（圖16）在繼承和發揚中醫藥治療糖尿病腎病優勢及特色的同時，銳意創新，充分吸收國際先進技術與理念，提高中醫藥研究水平，促進中醫藥現代化與國際化進程，為中醫藥的發展貢獻力量！

圖16 李平教授研究團隊成員

地址：北京市朝陽區和平里櫻花東路2號

郵編：100029

電話：010-64227163

郵箱：lp8675@163.com

聯系人：李平

（□中日友好醫院臨床醫學研究所供稿）