小檗堿對大腸桿菌基因轉錄抑制作用的實驗研究＊

李慧玉，王玉剛，袁梽漪，雷帆，王欣佩，盧希，邢東明，李俊，杜力軍＊＊

（1.清華大學生命科學學院藥物藥理實驗室北京100084；2.重慶醫科大學藥學院重慶400016；3.清華大學藥學院北京100084；4.江西中醫藥大學創新藥物與高效節能降耗制藥設備國家重點實驗室南昌330006）

小檗堿對大腸桿菌基因轉錄抑制作用的實驗研究＊

李慧玉1，王玉剛1，袁梽漪2，雷帆3，王欣佩1，盧希1，邢東明1，李俊4，杜力軍1＊＊

（1.清華大學生命科學學院藥物藥理實驗室北京100084；2.重慶醫科大學藥學院重慶400016；3.清華大學藥學院北京100084；4.江西中醫藥大學創新藥物與高效節能降耗制藥設備國家重點實驗室南昌330006）

目的：對小劈堿（BBR）對大腸桿菌的抑制作用的分子靶點進行探討。方法：鑒于BBR對DNA結合的偏好性，本文從基因轉錄表達水平對BBR的大腸桿菌生長抑制作用靶點進行實驗研究。結果：BBR對于大腸桿菌基因上游調控元件UP element具有較強的親和力，而在此元件地轉錄起始區含有TATA堿基序列。進一步對啟動子上游含有UP element調控元件的基因sulA、recA、16S和啟動子上游不含UP element調控元件的基因lpxC、secG、mutT的mRNA表達比較表明，BBR抑制sulA、recA、16S的表達，對lpxC、secG、mutT無明顯作用，提示TATA序列是BBR的作用靶點。結論：本結果對從基因轉錄水平探討BBR抑菌作用提供了新思路。

小檗堿大腸桿菌基因轉錄TATA box

小檗堿（Bererine，BBR）具有廣譜抑制病原微生物作用，臨床上常用于治療細菌性腹瀉。許多研究對其抑菌作用的靶點主要集中在蛋白質或代謝水平上，例如：BBR抑制細胞分裂蛋白FtsZ的組裝而阻礙細胞分裂[1，2]；或是抑制細菌體內糖代謝過程中的丙酮酸氧化，使細菌對維生素B6和煙酰胺等的利用受到限制而產生抑菌作用[3]。由于BBR是一種DNA配體，在體外可與單鏈/雙鏈的DNA結合[4-7]，可以通過與細菌體內DNA結合從而影響其復制而發揮抑菌作用。BBR能夠利用其平面空間結構特征，“TA”堿基偏好性地插入到DNA雙螺旋的小溝中[8]，利用X衍射技術證實了BBR能與DNA結合[9]。因此，推測BBR的抑菌活性可能是由于它與富含A/T堿基的雙螺旋DNA小溝的特異性結合所致[10]。實驗室早期的研究證實BBR可以進入真核細胞的細胞核內，并同TATA box結合蛋白TBP競爭，與mRNA啟動子上游調控元件TATA box結合，干擾基因轉錄起始，從而抑制TATA box依賴的基因的轉錄[11]。綜上提示，在抑菌作用中BBR的這種與DNA結合的特性可能是其發揮抑菌作用的內在分子機制。為證實這一假設，我們進行了如下實驗研究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試藥

細菌培養搖床（太倉科技器材廠華利達試驗設備公司）；GeneQuant 100紫外分光光度計（美國GeneralElectric公司）；YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司）；MDF-382E低溫冰箱（日本SANYO公司）；超凈工作臺（北京昌平長城空氣凈化工程公司）。Tprofessional Gradient PCR儀（德國Biometra公司）；5417R型臺式低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；DYY-7C型電泳儀（北京六一儀器廠）；FR-200A型全自動紫外與可見分析裝置（上海復日科技有限公司）；垂直電泳儀（美國BIO-RAD公司）；半干轉轉膜儀（北京六一儀器廠）。680型酶標儀（美國BIORAD公司）；Light Cycle П Real-Time PCR儀（瑞士Roche公司）。

鹽酸小檗堿（純度99%，中國食品藥品檢定研究院）；氨芐青霉素（Ampicillin，上海生工生物工程股份有限公司），配制為0.1 g·mL-1的母液保存；瓊脂培養板：用營養瓊脂粉（上海生工生物工程股份有限公司）配制成濃度為2%的溶液，高壓滅菌后倒入滅菌的培養皿中制成培養板備用；肉湯培養基（上海生工生物工程股份有限公司）：LB液體培養基，高壓滅菌備用。

大腸桿菌K-12野生菌菌株（由本研究室保存）；大腸桿菌DH5α感受態細胞、T4 DNA連接酶、細菌基因組DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶PCR擴增試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA和蛋白分子量標準DNA Marker I、DNA Marker IV、DNA Marker D2000（北京天根生物技術公司，批號分別是：CB101、RT406、DP302、KT109、DP209、MD101、MD104、MD114）；大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞（北京全式金生物公司，批號：CD601）；pUCm-T線性載體（上海生工生物工程股份有限公司，批號：B522211）；凝膠電泳遷移實驗DNA探針序列由上海生工合成；原核表達載體pET-21b（美國Novagen公司，批號：70763）；限制性內切酶NdeⅠ、HindШ、BamHⅠ（立陶宛Fermentas公司，批號分別是：ER0581、SM0192、ER0051）；小鼠抗His標簽單抗、羊抗小鼠IgG/HRP標記二抗（北京中杉金橋生物技術研究所有限公司，批號分別是：TA-02、ZDR-5307）；預染蛋白彩色Marker（7-175KD）（美國BioLabs公司，批號：P7702V）；Biotin 3’End Labeling Kit（美國Thermo公司，批號：89818）；Light Shift Chemilu?minescent EMSA Kit（美國Thermo公司，批號：20148）；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 BBR抑菌濃度

BBR對大腸桿菌的最小抑制濃度（Minimum In?hibition Concentration，MIC）的確定采用試管二倍稀釋法[12]。實驗用BBR以滅菌的LB液體培養基溶解配制成1 mg·mL-1的溶液，0.22 μm濾膜過濾除菌，再以LB液體培養基進行二倍稀釋為0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg·mL-1共5個藥物濃度梯度。將已培養過夜（約16-18 h）的大腸桿菌菌液，轉接100 μL于新鮮LB液體培養基中同條件繼續培養2 h，菌生長同步且處于對數生長期，OD600為0.1-0.2（約1×1011CFU·L-1）；然后將菌液用LB液體培養基稀釋100倍（約1×109CFU·L-1）作為接種濃度,每試管加入0.1 mL菌液。

實驗選用5個藥物濃度梯度，每濃度培養液的體積為3 mL，設3個平行組，設立不加實驗菌的本底對照；此外，還設立一組含有0.1 mg·mL-1氨芐青霉素的陽性對照組和未加入藥物的陰性對照組。加入藥物及大腸桿菌的試管于37℃，160 rpm搖床培養22 h后進行判定：輕搖試管見絮狀渾濁者為抑菌陰性，澄清者為陽性，陰性的最大藥物濃度和陽性的最小藥物濃度作為其抑菌范圍。同時，測定每管OD600nm，與未加藥物的試管進行比較，以觀察不同濃度的藥物抑制細菌生長的程度。

1.3 大腸桿菌基因組DNA的提取

將已培養過夜（約18 h）的大腸桿菌菌液,轉接100 μL于新鮮LB液體培養基中同條件繼續培養2 h，當菌體生長至對數生長期（OD600為0.6-0.8時），按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取細菌全基因組DNA。

1.4 大腸桿菌RNA聚合酶α亞基(RNAP-α)高表達重組質粒的構建

以上面提取的基因組DNA為模板，參照NCBI genebank上給出的大腸桿菌K-12 RNA聚合酶α亞基的編碼序列，用Primer Premier 5.0軟件設計并合成引物，按照如下方法獲得目的DNA片段。RNA聚合酶α亞基RNAP-α引物序列：正向：5′-TATGCAGGGTTCT?GTG ACGAG-3′，反向：5′-GTACTCGTCAGCGAT?GCTTG-3′。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，并采用天根瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒分離純化目的DNA片段，將獲得的目的DNA片段用T4 DNA連接酶與pUCm-T線性載體連接。將所得到的連接產物取10 μL按照操作手冊轉化DH5α感受態細胞。用Gene?Quant 100紫外分光光度計檢測所提質粒DNA的OD260nm和OD280nm，進行濃度標定和純度檢測，-20℃凍存備用。將用上述方法提取的質粒DNA采用雙酶切鑒定正反向插入子。挑選正向連接的陽性克隆，擴大培養并用20%的甘油于-80℃保存菌種。取1 mL菌液進行測序，將測序結果與目標DNA序列在DNAman軟件中進行生物信息學序列比對。將測序正確的克隆命名為pUCmT-α。將上述測序正確的pUCmT-α菌種擴大培養，并用SDS堿裂解法提取大量pUCmT-α質粒，然后采用NdeⅠ，BamHⅠ雙酶切,電泳純化回收RNAP-αDNA片段，與原核表達載體pET-21b相同的雙酶切純化回收產物用T4 DNA連接酶連接。將連接產物按上面所述方法轉化入BL21（DE3）感受態細胞中，涂布含有氨芐青霉素的固體LB培養平板，挑取單克隆并采用雙酶切鑒定正確連接的質粒。將正確連接的克隆菌擴大培養，用20%的甘油于-80℃保存菌種，獲得的重組質粒命名為pET-21b-α。

1.5 RNA聚合酶α亞基（RNAP-α）的誘導表達及表達條件的優化

將測序正確含有RNA聚合酶α亞基高表達質粒（pET-21b-α）的單克隆搖菌，次日按1∶100轉接到LB液體培養基中擴大培養至對數生長期OD600nm=0.6-0.8，取出1mL菌液（誘導前），剩余菌液加入終濃度為0.25mM的IPTG誘導劑，繼續培養4-5 h。同樣取誘導后的菌液1 mL，將誘導前、誘導后的菌液分別12 000 rpm，1 min離心收集菌體，棄上清后加入2×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min使菌體裂解，用12%SDS-PAGE凝膠電泳檢測RNAP-α蛋白是否高表達。同時為了確證高表達的蛋白確實是我們所構建的RNA聚合酶α亞基，采用了Western blot技術對菌體誘導表達的上清液進行鑒定。

1.6 凝膠電泳遷移實驗檢測BBR對RNAP-α與UP element結合的影響

參照文獻[13,14]，根據所研究的目的蛋白及其所結合的保守DNA序列設計并合成DNA探針序列。用Bio?tin 3′End Labeling Kit參照說明書分別將UP element-1，UP element-2、-10 element-1、-10 element-2四條單鏈DNA的3′OH末端標記生物素。凝膠電泳遷移實驗DNA探針序列:UP element-1:5′-TCAGAAAAT?TATTTTAAATTTCCTCTTGTCAGGC-3′；UP element-2：5′-GCCTGACAAGAGGAAATTTAAAAT-AATTTTCTGA-3′；-10 element-1：5′-CAG GCTTTACACTTTATGCTTCC?GGCTCGTATAATGTGTGGA-3′；-10 element-2：5′-TCCACAC ATTATACGAGCCGGA-AGCATAAA GTG?TAAAGCCTG-3′。UP element DNA探針與RNA聚合酶α亞基的結合實驗參照LightShift Chemiluminescent EMSA Kit說明書進行。在實驗過程中，預先將UP ele? ment DNA探針與不同濃度的BBR（0.1、1、10、100 μg· mL-1）孵育后，進行蛋白質與DNA結合反應。通過凝膠電泳可將與RNA聚合酶α亞基結合的探針與游離的探針分離開，最后用化學發光法進行檢測。

1.7 凝膠電泳遷移（EMSA）實驗考察BBR與核心轉錄元件結合的偏好性

本實驗室之前通過等溫滴定（ITC）實驗觀察到：BBR與模式探針的結合系數隨著探針所含TA堿基數量的增加而增加[15]。考慮到細菌啟動子元件-10 ele?ment也是富含A/T堿基，但其長度比UP element短很多。為了考察BBR在結合力上對TA堿基的偏好性是否是其干擾RNAP-α與UP element結合的原因，我們利用EMSA體外實驗檢測了BBR對RNAP-б與-10 el?ement結合的影響。EMSA具體參照試劑盒操作程序進行。

1.8 Trizol法提取大腸桿菌總RNA

將大腸桿菌K-12野生菌搖菌活化，次日按1∶100轉接到LB液體培養基中擴大培養至早期對數生長期OD600nm=0.4-0.6，然后將菌液分配成對照組，實驗組（每組采集4個時間點：0.5 h、1 h、2 h、4 h），向實驗組中加入BBR溶液，使其終濃度為300 μg·mL-1，接近該藥物對大腸桿菌的半數抑制濃度IC50，繼續同條件培養至相應時間點，分別離心收集菌體，Trizol法提取RNA[16]。

1.9 Real-time PCR檢測特定的基因轉錄

分別以對照組和實驗組各時間點的總RNA為模板，用EasyScript Reverse Transcriptase逆轉錄試劑盒將樣品中的所有RNA反轉錄為cDNA[17]。以目的檢測基因的DNA序列作為模板，用Primer Premier 5.0軟件設計并合成用來特異性檢測目的基因表達的引物。Sul A(151bp)：正向：5′-CTTCGTCGTTCTCAT CCG-3′，反向：5′-TGCTGACCGAGTTGCTGT-3′；Rec A(138bp)：正向：5′-TGGCGGG TAACCTGAAGCA-3′，反向：5′-CGAGA CGAACAGAG GCGTAGAAT-3′；16S(129 bp)：正向：5′-CGTGCTACAATGGACAATACAAA-3′，反向：5′-A TCTACGATTACTAGCGATTCCA-3′；Lpx C (102 bp)：正向：5′-CGATGAACTTCTCCGCT GATG-3′,反向：5′-G GCCAAACCACGGGACTG-3′；Sec G (147 bp)：正向：5′-CGCTTCCGC TACGCTGTT-3′，反向：5′-TTTTCCCATTCGCTACCTCTATT-3′；Mut T (100 bp)：正向：5′-TT CAGGAAGAGGTCGGGATTAC-3′，反向：5′-ACCAGCCAGAACCACAGAGTTAT-3′。Rpo A(192):正向：5′-GGAAACCAACGGCACAAT-3′，反向：5′-CAGTTA GCA GAGCGGACA-3′。以RNA聚合酶α亞基編碼基因Rpo A作為內參基因[18]。Realtime PCR檢測按照RealMasterMix（SYBP Green）試劑盒進行[19]。

圖1 BBR體外對大腸桿菌生長的抑制作用（n=3）

圖2 大腸桿菌RNA聚合酶α亞基編碼序列的特異擴增（A）和pUCm-T-α正向連接重組質粒酶切鑒定（B）

1.10 數據處理

2 結果

2.1 BBR對大腸桿菌的抑制濃度

結果顯示BBR濃度低于1 mg·mL-1的實驗組，試管中均有不同程度的渾濁現象，而1 mg·mL-1實驗組培養液仍為澄清；取該實驗組培養液100 μL涂布無抗性的LB瓊脂平板，37℃、16 h培養后沒有明顯的菌落出現。綜合上述實驗觀察結果表明BBR對大腸桿菌生長的MIC=1 mg·mL-1。同時測定BBR不同濃度條件下每管菌液在600 nm波長下的吸光值OD600nm，對實驗數據進行數據處理結果如圖1。根據圖1A中各藥物濃度條件下大腸桿菌的生長率求得相應的抑制率，代入計算公式求得BBR對大腸桿菌生長的半數抑制濃度IC50=324.19 μg·mL-1。

2.2 大腸桿菌RNA聚合酶α（RNAP-α）亞基編碼基因克隆及表達載體的構建

以大腸桿菌基因組DNA序列為模板，進行PCR擴增反應，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約990 bp處出現特異性條帶，大小與預期結果相符（圖2A）。目的基因RNAP-α的PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，與pUCm-T線性載體連接，連接的重組子轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取單個菌落接種于LB液體培養基中，于37℃、200 rpm培養過夜，經SDS裂解提取質粒后采用NdeⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定正向連接的重組質粒pUCmT-α，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到與預期相符的約750 bp的酶切片段條帶（圖2B）。將經過雙酶切鑒定并測序正確的pUCmT-α菌種擴大培養，提取大量pUCmT-α質粒，然后采用NdeⅠ，BamHⅠ雙酶切，電泳純化回收RNAP-α DNA片段，與原核表達載體pET-21b相同的雙酶切純化回收產物用T4 DNA連接酶連接。將連接產物轉化入BL21（DE3）感受態細胞中，涂布含有氨芐青霉素的固體LB培養平板，挑取單克隆采用雙酶切鑒定正確連接的質粒pET-21bα，將測序結果經過比對，相似度100%且無翻譯移碼。

2.3 RNAP-α亞基的誘導表達及鑒定

pET-21b載體為含有氨芐青霉素抗性基因的原核高效表達載體，且為融合表達載體，其本身表達His-Tag標簽蛋白。所表達的目的蛋白RNAP-α分子量約為37 KD。在37℃經IPTG誘導表達的菌體，煮沸裂菌后經12%SDS-PAGE凝膠電泳分析結果顯示、在37KD左右有一條明顯的高表達蛋白條帶（如圖3A），與預期的蛋白分子量大小一致，說明重組表達菌pET-21b-α在大腸桿菌中獲得了表達。為了進一步確定該高表達條帶確實是我們所構建的RNAP-α亞基，通過采用Western blot技術對菌體誘導表達的上清液進行了鑒定，結果顯示：利用His-Tag標簽抗體進行免疫印跡，在分子量大小約37 KD處檢測到單一的蛋白表達條帶（如圖3B）。

2.4 BBR對大腸桿菌RNAP-α亞基與啟動子調控元件結合的影響

EMSA檢測實驗中，我們以UP element保守序列作為探針，研究了BBR對RNAP-α識別并結合UP ele?ment的影響。結果顯示：BBR在終濃度為1 μg·mL-1的劑量下，能在體外有效抑制RNAP-α與UP element的結合。利用GraphPad 5.0軟件分析計算可知：BBR在該體外結合反應系統中對RNAP-α結合UP element抑制作用的半數抑制濃度IC50為1.311 4 μg·mL-1（圖4A-C）。

圖3 RNA聚合酶α（RNAP-α）亞基的誘導表達（A）及鑒定（B）

以原核啟動子中同樣富含A/T堿基的-10 element保守序列作為探針，對BBR對RNAP-б識別并結合-10 element的影響進行研究。結果顯示：BBR雖然也能抑制RNAP-б與-10 element的結合，但其抑制效率明顯低于其對RNAP-α與UP element結合的影響，提示UP element作用的特異性。BBR在該體外結合反應系統中對RNAP-б結合-10 element抑制作用的半數抑制濃度IC50為15.465 μg·mL-1（圖4D-F）。

2.5 Trizol法提取大腸桿菌RNA質量的評價

圖4 體外BBR對相關元件結合的影響（n=3）

圖5 大腸桿菌RNA提取質量檢測及基因組DNA的消化

利用非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的RNA的降解情況（圖5A），結果顯示Trizol法提取的RNA存在基因組DNA污染，且有一定程度的降解，但23S（2.9 kb），16S（1.5 kb）條帶并沒有出現明顯拖尾現象，可能是非變性電泳時間過長、RNA在電泳過程中有所降解所致。為了檢測DNA酶消化處理后RNA樣品中基因組DNA殘留情況，分別以DNase處理前和處理后的RNA樣品為模板，利用PCR擴增特定基因RpoA檢測PCR產物。結果顯示（圖5B）與處理前相對比，用DNase處理后的RNA樣品PCR產物沒有非特異性條帶產生，說明得到了沒有DNA污染的RNA樣品，為后續的Real-time PCR檢測實驗結果提供了技術保證。

2.6 BBR對啟動子上游含有或不含有UP element調控序列基因轉錄水平的影響

研究表明大腸桿菌中約有26%的基因啟動子上游含有此段保守性較差的UP element序列[20,21]。為了探討BBR是否通過干擾RNAP-α與啟動子上游調控元件UP element的結合而影響含有此段特征序列的基因的轉錄，我們選擇重組蛋白酶A（RecombinaseA，recA），SOS細胞分裂抑制蛋白（sulA），16S核糖體RNA（rrn?Bp1）這三個代表基因，采用Real-time PCR的方法檢測了BBR處理前后其轉錄水平的變化情況。

圖6 BBR對相關啟動子上游調控元件基因轉錄的影響（n=3）

又文獻報道此段富含A/T堿基的UP element特征序列作為一個單獨的調控元件，具有明確的激活基因轉錄啟動活性，在被替換到其他基因的核心啟動子上游后仍能夠激活下游基因的轉錄[22]。為了探討BBR是否會通過干擾RNAP-α與啟動子上游調控元件UP ele?ment的結合而影響含有此段特征序列的基因的轉錄，我們對比分析了未加藥組和BBR藥物處理組對特定基因的轉錄水平影響。同時選擇Lpx C、Sec G、Mut T等3個基因作為對比基因，以其啟動子上游不含有UP element調控元件。由圖6A-C可知：與對照組相比，細菌SOS反應相關的2個重要蛋白—recA、sulA，以及16S核糖體RNA（rrnBp1）這三個啟動子上游存在UP element調控元件的基因轉錄水平被顯著下調。圖6D-F則表明：Lpx C、Sec G、Mut T等三個啟動子上游不存在UP element特征序列的基因轉錄水平與對照組相比，并沒有明顯變化。以上結果表明BBR可與啟動子上游富含A/T堿基的UP element結合，從而干擾那些受UP element調控的基因的轉錄起始，影響這些基因的轉錄以及后續蛋白質的表達。

3 討論

本研究以大腸桿菌為抑制對象，以TATA為基本觀察靶點，對BBR的抑菌作用分子機制進行了初步探討。BBR對大腸桿菌的MIC=1.0 mg·mL-1，BBR其濃度在達到0.5 mg·mL-1以上時才出現明顯的抑菌效果也證明了這一點。這很可能與革蘭陰性菌比較特殊的細胞壁組成有關，從而導致BBR不易進入細菌細胞內，此有待于進一步研究。為了在體外探究BBR對RNAP-α與細菌啟動子上游調控元件UP element結合的影響，首先，我們需要獲得富含RNAP-α的細胞提取物，因此我們構建了RNAP-α重組表達菌；同時，為了盡量使RNAP-α在細胞提取物的上清液中高表達，為了進一步確定細胞裂解液中的高表達蛋白確實是我們所構建的RNA聚合酶α亞基，采用Western blot技術對菌體誘導表達的上清液進行了鑒定，結果顯示利用His-Tag標簽抗體進行免疫印跡，在分子量大小約37 KD處檢測到單一的蛋白表達條帶，說明構建的RNA聚合酶α亞基融合蛋白已成功表達，這為我們的后續研究奠定了基礎。

有研究指出大腸桿菌RNA聚合酶α亞基由2個獨立的結構域組成，分別是N末端結構域（αNTD）和C末端結構域（αCTD），二者之間由一個柔性的linker肽所連接，αCTD的主要功能是負責識別并結合UP element調控序列。在轉錄起始過程中，αCTD主要通過與富含A/T堿基的UP element的DNA小溝緊密結合參與轉錄起始復合物的形成。又，BBR能夠利用其對“TA”堿基偏好性地插入到DNA雙螺旋的小溝中[8]；BBR可以進入真核細胞的細胞核內，并同TATA-box結合蛋白TBP競爭，與mRNA啟動子上游調控元件TATA-box結合，干擾基因的轉錄起始，從而抑制TATA-box依賴的基因的轉錄[11]。因此，我們希望知道BBR在進入細菌細胞后，是否會與αCTD競爭，結合到富含A/T堿基的UP element DNA序列的小溝中，從而干擾RNA聚合酶α亞基與UP element的結合，影響基因的轉錄起始。首先，通過體外EMSA試驗考察了BBR對RNAP-α與富含A/T堿基的UP element結合的影響；其次，考慮到細菌啟動子調控元件-10 element同樣富含AT堿基，但其長度比UP element短很多，為了探討BBR在結合力上對TA堿基的偏好性是否是其干擾RNAP-α與UP ele?ment結合的原因，我們考察了BBR對RNA聚合酶б亞基（RNAP-б）與-10 element結合的影響。結果顯示：BBR雖然也能抑制RNAP-б與-10 element的結合，但其抑制效率明顯低于其對RNAP-α與UP element結合的影響，這與我們實驗室之前通過等溫滴定實驗檢測BBR與模式DNA探針結合系數時的實驗結果：BBR與模式探針的結合系數隨著探針所含TA堿基數量的增加而增加的特點相一致[11]。

BBR作為一種DNA配體，在體外可與雙鏈DNA結合，并且這種結合具有一定的T/A堿基偏好性。BBR的這種對TA堿基的偏好性導致了其在體外有效地抑制RNAP-α與富含A/T堿基的UP element的結合；能極大地影響這些基因的轉錄效率，因為此段富含A/T堿基的UP element在細菌體內許多含有強啟動子的基因上游普遍存在[23]。因此，我們對BBR的這種在體外可干擾RNAP-α與基因轉錄調控元件UP element結合的現象進行了細菌水平的考察。通過采用實時熒光定量PCR的方法，我們對比分析了未加藥組和BBR藥物處理組，各時間點特定基因在大腸桿菌內的轉錄水平變化。

結果表明，BBR能夠下調上游富含A/T堿基的UP element的recA、sulA、16S等三個基因的表達，而對于Lpx C、Sec G、Mut T等三個啟動子上游不存在UP element特征序列的基因轉錄水平無明顯變化。RecA，sulA蛋白是細菌DNA復制-SOS修復系統中的重要成員，BBR對這兩個蛋白轉錄水平的明顯下調提示：BBR不太可能通過引發SOS反應的方式產生抑菌作用。這與之前有文獻報道：BBR在SOS反應陰性突變株和野生型菌株中均能引起細胞伸長，抑制細胞分裂的結果相一致[2]；16S rRNA是細菌核糖體的重要組成成分，BBR對其轉錄水平的明顯下調，可能意味著蛋白質合成裝置—核糖體的組裝將受到影響，細胞存活所必需的結構蛋白和酶類不能被合成，進而抑制細菌的生長。

由于細胞生長的復雜性，BBR在調控這些基因時具體通過影響到哪一種生理功能而發揮其抑菌作用，有待進一步研究。但是UP element及其所含的TATA作為BBR的分子靶點為我們提供了深入探討BBR對微生物調控的新的視點，有助于探討由于影響腸道菌所影響的機體多種生理病理功能的紊亂。

1Domadia PN,Bhunia A,Sivaraman J,et al.Berberine targets assembly of Escherichia coli cell division protein FtsZ.Biochemistry,2008,47 (10):3225-3234.

2Boberek JM,Stach J,Good L.Genetic evidence for inhibition of bacteri?al division protein FtsZ by berberine.PLoS One,2010,5(10):e13745.

3張茜,樸香淑.小檗堿抑菌作用研究進展.中國畜牧雜志,2010,46 (3):58-61.

4Das S,Kumar GS,Ray A,et al.Spectroscopic and thermodynamic stud?ies on the binding of sanguinarine and berberine to triple and double he?lical DNA and RNA structures.J Biomol Struct Dynam,2003,20(5): 703-713.

5Li WY,Lu H,Xu CX,et al.Spectroscopic and binding properties of ber?berine to DNA and its application to DNA detection.Spectroscopy Lett, 1998,31(6):1287-1298.

6Bhadra K,Maiti M,Kumar GS.Berberine-DNA complexation:New in?sights into the cooperative binding and energetic aspects.Biochim Bio?phys Acta,2008,1780(9):1054-1061.

7Yadav R C,Kumar G S,Bhadra K,et al.Berberine,a strong polyriboade?nylic acid binding plant alkaloid:spectroscopic,viscometric,and ther?modynamic study.Bioorganic Med Chem,2005,13(1):165-174.

8Mazzini S,Bellucci M C,Mondelli R.Mode of binding of the cytotoxic alkaloidberberinewiththedoublehelixoligonucleotided (AAGAATTCTT)(2).Bioorg Med Chem,2003,11(4):505-514.

9Ferraroni M,Bazzicalupi C,Bilia AR,et al.X-Ray diffraction analyses of the natural isoquinoline alkaloids Berberine and Sanguinarine com?plexed with double helix DNA d(CGTACG).Chem Commun,2011,47 (17):4917.

10 Ozbalci ?,Unsal ?,Kazan D,et al.Proteomic response of Escherichia coli to the alkaloid extract of Papaver polychaetum.Annals Microbiol, 2010,60(4):709-717.

11 Wang Y,Kheir M M,Chai Y,et al.Comprehensive Study in the Inhibito?ry Effect of Berberine on Gene Transcription,Including TATA Box. PLoS One,2011,6(8):e23495.

12張濤,張爽,胡格,等.鹽酸小檗堿綠原酸和黃芩苷對大腸桿菌的體外抑菌作用.中國獸醫雜志,2009,45(01):42-43.

13 Gaal T,Ross W,Blatter E E,et al.DNA-binding determinants of the al?pha subunit of RNA polymerase:novel DNA-binding domain architec?ture.Genes Develop,1996.10(1):16-26.

14 Fenton M S,Lee S J,Gralla J D.Escherichia coli promoter opening and-10 recognition:mutational analysis of σ70.EMBO J,2000,19(5): 1130-1137.

15王玉剛.小檗堿對基因轉錄過程中TATA box作用的研究.北京：清華大學博士學位論文,2012.

16 Yuan Z Y,Lu X,Lei F,et al.TATA boxes in gene transcription and poly (A)tails in mRNA stability:New perspective on the effects of berberine. Sci Rep,2015,5:18326.

17 Yuan Z,Lu X,Lei F,et al.Berberine inhibits mRNA degradation by pro?moting the interaction between the poly A tail and its binding protein PABP.J Chin Pharm Sci,2017,26(1):53-62.

18 Rénia L,Goh S,Boberek J M,et al.Concurrent Growth Rate and Tran?script Analyses Reveal Essential Gene Stringency in Escherichia coli. PLoS One,2009,4(6):e6061.

19 Lu X,Yuan Z Y,Yan X J,et al.Comprehensive study of Angelica Dah?urica on obesity and fatty liver.Chin J Nat Med,2016,14(9):641-652.

20 Lisser S,Margalit H.Compilation of E.coli mRNA promoter sequences. Nucleic Acids Res,1993,21(7):1507-1516.

21 Rao L,Ross W,Appleman J A,et al.Factor independent activation of rrnB P1:An“extended”promoter with an upstream element that dramat?ically increases promoter strength.J Mol Biol,1994:235(5):1421-1435.

22 Gourse R L,Ross W,Gaal T.UPs and downs in bacterial transcription initiation:the role of the alpha subunit of RNA polymerase in promoter recognition.Mol Microbiol,2002,37(4):687-695.

23 Ross W,Aiyar S E,Salomon J,et al.Escherichia coli promoters with UP elements of different strengths:modular structure of bacterial promoters. J Bacteriol,1998,180(20):5375-5383.

Experimental Study on Inhibition Effect of Berberine in Escherichia coli Gene Transcription

Li Huiyu1,Wang Yugang1,Yuan Zhiyi2,Lei Fan3,Wang Xinpei1,Lu Xi1,Xing Dongming1,Li Jun1,Du Lijun1
(1.Laboratory of Molecular Pharmacology and Pharmaceutical Sciences,School of Life Sciences,Tsinghua University, Beijing 100084,China;2.College of Pharmacy,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;

3.School of Pharmaceutical Sciences,Tsinghua University,Beijing 100084,China; 4.State Key Laboratory of Innovative Drugs and Efficient Energy-saving Pharmaceutical Equipment, Jiangxi University of Chinese Medicine,Nanchang 330006,China)

There have been many reports on berberine(BBR)effect of the inhibition on gut bacteria,but more from the protein level.In view of the preference of BBR for DNA binding,we here investigated the expression of BBR from the transcriptional expression level of the gene.The results showed that BBR had a higher affinity for UP element of Escherichia coli(E.coli)gene,and the transcription initiation region of this element contained TATA base sequence.The expression of genes sulA,recA and 16S which contain the genes of the UP element regulatory elements in the upstream of the promoter could be suppressed by BBR,and the expression of lpxC,secG and mutT which did not contain the genes of the UP element regulatory elements in the upstream of the promoter could not be inhibited by BBR.It is shown that the TATA sequence is the target of BBR.This result provides a new perspective for exploring the effect of BBR?s inhibition of microbiota from gene transcription.

Berberine,Escherichia coli,gene transcription,TATA box

10.11842/wst.2017.04.005

R285

A

（責任編輯：郭嫦娥，責任譯審：王晶）

2017-02-27

修回日期：2017-04-02

＊國家自然科學基金委重大研究計劃培育項目（90713043）：基于BBR神經元保護作用探討其PI3-K/AKT作用的始動位點及其信號轉導，負責人：杜力軍；國家自然科學基金委面上項目（81374006）：基于BBR作為DNA插入子探討其對正常與缺血再灌神經元基因轉錄作用差異的機制，負責人：邢東明。

＊＊通訊作者：杜力軍，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：藥理學。