四物合劑通過TGF-β3蛋白通路干預順鉑作用顆粒細胞E2分泌機制的研究＊

蔡欣悅，趙丕文，唐炳華，楊曉敏，武洪波，崔麗霞，孫麗萍

（北京中醫藥大學生命科學學院北京100029）

四物合劑通過TGF-β3蛋白通路干預順鉑作用顆粒細胞E2分泌機制的研究＊

蔡欣悅，趙丕文，唐炳華，楊曉敏，武洪波，崔麗霞，孫麗萍＊＊

（北京中醫藥大學生命科學學院北京100029）

目的：通過細胞實驗，以順鉑（Cisplatin，CDDP）作為顆粒細胞損傷因素，觀察四物合劑對損傷后顆粒細胞分泌E2分泌水平及其合成關鍵酶CYP19a1基因表達水平的干預情況。方法：取SD大鼠卵巢顆粒細胞，經順鉑作用后給予四物合劑藥理血清干預，對不同條件下上清液E2及E2合成關鍵酶CYP19a1表達水平進行測定。結果：放免法檢測四物合劑藥理血清干預細胞組E2水平與順鉑組相比明顯提升，且加入TGF-β3蛋白通路阻斷劑后E2下降；免疫組化和蛋白印跡結果顯示四物合劑藥理血清組CYP19a1蛋白表達水平高于順鉑作用組，在蛋白印跡檢測中，阻斷劑組較未加阻斷劑組明顯降低。結論：四物合劑藥理血清能調節順鉑作用后的顆粒細胞E2分泌水平，其作用機制可能與通過TGF-β3蛋白通路增強CYP19a1表達有關。

四物合劑芳香化酶TGF-β3蛋白通路顆粒細胞雌激素

四物湯由熟地、當歸、川白芍、川芎組成，原方用于治療外傷，腸內有瘀血的病癥。后世醫家多用來治療血虛、血瘀及出血所致的各種婦科雜病，效果顯著[1]。現代關于四物湯的藥理學研究顯示，其組方成分在治療貧血、提高免疫力、子宮雙向調節上都有一定的作用[2]。孫海蕓等[3]的實驗結果表明，四物湯及其中成藥四物合劑對顆粒細胞的凋亡有調整作用，但不能證明有完全修復作用[4-7]。顆粒細胞是參與卵巢功能維持的重要生殖細胞，其數量及分泌雌激素和孕激素的作用與卵泡發育密切有關系，四物湯調控婦科疾病的機制可能與此有關。同時也有研究發現，四物湯能夠促進卵巢顆粒細胞增殖[8]。E2合成原料為膽固醇，經轉運至線粒體后再由一系列酶催化轉化為E2，在這一過程中P450芳香化酶（Aromatase，CYP19a1）是雌激素生成的限速酶。在卵巢顆粒細胞中，經CYP19a1催化，雄激素轉化為雌激素。TGF-β3受體主要依靠Smad蛋白進行信號轉導，已有文獻提出TGF-β3-Smad3信號轉導通路干預顆粒細胞分泌E2的水平[9]。本文通過細胞實驗探討四物合劑藥理血清通過TGF-β3信號蛋白轉導通路干預順鉑作用顆粒細胞分泌E2分泌水平的效果，以及其可能的機制。

1 材料

1.1 實驗動物

選取健康22-24天雌性SD大鼠，體重50±10 g，動物分籠飼養在23-25℃室內,自然光照，正常喂養。動物飼料均購于斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司。

1.2 實驗用藥

四物合劑，100 mL/瓶（吉泰安藥業有限公司，批號：0703014）；順鉑注射液，10 mg/支（濟南齊魯制藥，批號：611048CF）；戊酸雌二醇片，1 mg/片（拜耳醫藥有限公司，批號：195A5）。

1.3 主要試劑

澳洲胎牛血清（美國Hyclone公司，批號：1300510）；DMEM/F12培養基（英國GE醫療生命科學公司，批號：AB216498）；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20160627、20160307、S1051、S1052）；蛋白相對分子質量Marker（美國Thermo公司，批號：00332484）；ECL超敏發光液（北京普利萊基因技術有限公司，批號：P1010）；芳香化酶兔源一抗（美國Santa Cruz公司，批號：sc30086）；二抗Anti-Rabbit（普利萊基因技術有限公司，批號：C1309）；DAB顯色劑（北京中山金橋生物技術有限公司，批號：20151016）。

1.4 實驗儀器

MC0-18AIC型CO2培養箱（日本SANYO公司）；LG16-WA型離心機（北京京立離心機有限公司），TS100型倒置顯微鏡（日本NIKON公司）；LX-800型酶聯免疫檢測儀（日本Epson公司）；5500型凝膠成像分析儀（美國FLUORCHEM公司）。

2 方法

2.1 卵巢顆粒細胞原代培養[10]

22-24天雌性SD大鼠6只，適應性喂養1天后每只給予注射孕馬血清促性腺激素（Pregnant Mare Se?rum Gonadotropin，PMSG），48 h后斷頸處死，浸入75%酒精消毒3 min，超凈臺內取雙側卵巢用預冷的hank?s液中清洗3次。放入2.7 mL不含血清的培養基中，生物放大鏡下用一次性1 mL注射器針頭刺破卵巢，每個卵巢穿刺5 min，釋放顆粒細胞。加入胰酶0.3 mL，吸管吹打懸液數次，培養箱中消化10 min，每隔3 min震蕩一次。用含血清培養液終止胰酶消化并靜置10 min，取懸液1 000 rpm，離心10 min，去掉上清液，hank? s液吹勻細胞，1 000 rpm，10 min再離心一次。棄上清，加入0.1 mL10%胎牛血清培養液，取10 uL置血球計數板在倒置顯微鏡下觀察顆粒細胞并計數。稀釋至5× 105，置培養瓶中培養或接種于96孔板。

2.2 藥理血清制備[11]

選用22-24天雌性SD大鼠，體重約50 g，隨機分為正常生理組，雌激素組，四物合劑組，適應性喂養1天后分別給予生理鹽水、雌二醇（6μg/天）、四物合劑（0.63 mL/天）連續灌胃3天，于第4天灌胃后2 h取血清。

2.3 順鉑處理及藥物干預[12]

細胞常規培養11天后，將培養基吸出，加入順鉑培養基（使其終濃度為2.5 μg·mL-1）刺激細胞；順鉑刺激12 h后，吸去培養基，每孔加入相應的藥理血清（正常、雌激素、四物合劑），干預24 h，進行指標測定。

2.4 蛋白印跡實驗步驟

用預冷的緩沖液清洗細胞后，加入RIPA裂解液（每106個細胞加200 μL）待細胞完全裂解后，刮下細胞碎片收集至離心管，12 000 rpm 5 min離心，取上清。BCA試劑盒測定樣本的蛋白濃度后將蛋白質樣品與4倍樣品緩沖液（15 μL＋5 μL），EP管中混合后100℃加熱5 min，蛋白變性后穩壓200 V電泳45 min-1 h。PVDF轉膜后置于5%的脫脂奶粉制備的封閉液中，室溫下搖床1.5 h封閉。5%脫脂奶粉稀釋一抗，一抗稀釋液封閉4℃孵育過夜。待第二天一抗孵育結束，PBST沖洗膜3次，按照說明書濃度稀釋二抗，二抗稀釋液中室溫搖床1 h。PBST清洗三次之后進行顯影、定影、曝光和掃描，Image J分析條帶灰度值。

2.5 免疫組化

4%多聚甲醛固定，PBS清洗3次后80 μL0.5%tri?tox-100室溫孵育20 min，PBS清洗、3%H2O2去離子水孵育10 min，PBS清洗、滴加試劑A（封閉工作液）室溫孵育10-15 min，傾去，滴加CYP19a1一抗（1：100），37℃孵育3 h，PBS清洗、滴加試劑B（二抗工作液IgG/ Bio），室溫10-15 min，PBS清洗、滴加試劑C（辣根酶標記鏈霉卵白素工作液S-A/HRP）室溫孵育，PBS清洗后使用DAB顯色法顯色。每孔隨機選取6個視野，200倍和100倍放大拍照，利用Image J檢測細胞中陽性反應顆粒的平均光密度（AverageOptical Density，AOD）。

2.6 統計學方法

采用SAS 9.4對各組間細胞上清液的E2水平、CYP19a1的表達含量作統計分析，結果均為平均值±標準差（）表示，采用one-way ANOVA和Dunnett?s t檢驗兩兩比較進行統計處理，以P<0.05作為檢測標準。

3 結果

3.1 四物合劑藥理血清對順鉑作用顆粒細胞E2水平分泌的干預效果

放免法測定細胞培養過程中上清液E2水平，結果顯示雌激素藥理血清組水平最高，順鉑作用組最低，且低于四物合劑組和正常生理組（圖1），提示四物合劑藥理血清可以改善顆粒細胞E2分泌能力。

圖1 四物合劑藥理血清對CDDP損傷大鼠卵巢顆粒細胞E2分泌水平的影響

3.2 四物合劑藥理血清通過調節CYP19a1表達干預順鉑作用顆粒細胞E2水平分泌

免疫組化檢測結果顯示，各組顆粒細胞中CYP19a1蛋白在胞質中均有表達。由圖2（A）可見生理對照組中棕黃色陽性染色最多，且顏色較深；其次為雌激素組，四物合劑組表達程度略低于陽性組，順鉑作用組蛋白表達最低，陽性細胞數量最少。利用Image J對各組圖片進行分析，圖2（B）結果顯示順鉑作用組較生理組相比，陽性反應顆粒的AOD明顯降低，經四物合劑藥理血清干預后有所上升。Western Blot進行驗證，結果顯示順鉑作用顆粒細胞與生理對照組相比CYP19a1蛋白表達水平顯下降，四物合劑藥理血清干預后上升圖2（C），與之前實驗結果趨勢相同。

圖2 四物合劑藥理血清對CDDP損傷大鼠卵巢顆粒細胞CYP19a1蛋白表達水平的影響

3.3 四物合劑藥理血清通過TGF-β3調節CYP19a1表達

放免檢測（圖3）、Western Blot檢測（圖4）結果分別顯示，加Smad蛋白通路阻斷劑SB431542后，四物合劑藥理血清干預順鉑作用的顆粒細胞E2分泌水平下降、CYP19a1蛋白表達降低，提示四物合劑藥理血清可能通過TGF-β3蛋白通路調節CYP19a1表達而影響E2分泌。

圖3 TGF-β3蛋白通路對四物合劑藥理血清干預順鉑作用顆粒細胞E2分泌的影響

圖4 TGF-β3蛋白通路對四物合劑藥理血清干預順鉑作用顆粒細胞顆粒細胞CYP19a1表達的影響

4 討論

E2合成原料為膽固醇，在類固醇激素快速合成調節蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，StAR）作用下轉運至線粒體，經一系列酶催化轉化為E2，此過程中CYP19a1是E2生成的限速酶。TGF-β3超因子家族[13]包括多種結構保守但是功能多樣的因子，信號轉導過程主要依靠Smad蛋白進行[14]。迄今為止，總共發現的TGF-β3異構體在哺乳動物卵巢中存在，但其功能不完全相同。已有研究表示，TGF-β3主要定位于顆粒細胞上，其mRNA含量隨著卵泡直徑的增大而升高[15]，表明其在腔前卵泡和早期有腔卵泡中起重要作用，其中之一就是各種類固醇激素的產生和分泌，如E2。順鉑對卵巢性激素的分泌和顆粒細胞、卵泡膜內層細胞的功能均有損傷，通過改變卵巢組織的穩態內環境，使其產生嚴重的氧化損傷。已有動物實驗證明，順鉑作用于大鼠建立的卵巢早衰模型，其大鼠血清E2降低,卵泡數減少，閉鎖卵泡增加[16]。本實驗通過觀察四物合劑藥理血清干預順鉑作用的卵巢顆粒細胞E2水平與順鉑模型組相比明顯上升。值得注意的是，TGF-β3能夠在小鼠顆粒細胞中以劑量依賴的方式顯著的促進E2的分泌，此效應通過增強E2合成中的關鍵限速酶CYP19a1的表達而實現[17-19]。在實驗過程中加入外源性TGF-β3細胞因子和（或）Smad蛋白的阻斷劑SB431542，觀察四物合劑藥理血清干預順鉑作用顆粒細胞E2分泌水平的變化，結果顯示加入阻斷劑組明顯低于未加入阻斷劑組。這一結果說明，在四物合劑藥理血清干預順鉑作用顆粒細胞E2分泌過程中，很有可能通過TGF-β3-Smad3信號轉導通路起作用。

CYP19a1是E2生成的限速酶，已有研究證實，TGF-β3能夠通過Smad途徑促進CYP19a1的表達來促進E2分泌，而這一過程是通過增強CYP19a1的轉錄而實現的[20]。而本實驗結果顯示，四物合劑藥理血清通過TGF-β3干預順鉑作用顆粒細胞E2分泌。免疫組化和Western Blot檢測結果顯示順鉑作用顆粒細胞與生理對照組相比CYP19a1蛋白表達水平顯下降，四物合劑藥理血清干預后上升，同時在Western Blot檢測結果中加入阻斷劑SB431542后，四物合劑藥理血清干預CYP19a1的蛋白表達水平與未加入阻斷劑組有明顯差異。

綜上所訴，四物合劑藥理血清能調節順鉑作用顆粒細胞E2分泌水平，其作用機制可能與通過TGF-β3蛋白通路增強CYP19a1表達有關。該結果為四物合劑應用治療卵巢功能相關疾病提供了實驗依據，接下來的實驗中，我們將進一步探索四物合劑通過TGF-β3-Smad蛋白通路調節卵巢顆粒細胞功能的機制，為中醫藥改善卵巢功能，特別是治療卵巢早衰提供實驗依據。

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Effects of Si-Wu Mixture on Ovarian Granulose Cell Treated with Cisplatin through TGF-β3 Protein Pathway

Cai Xinyue,Zhao Piwen,Tang Binghua,Yang Xiaomin,Wu Hongbo,Cui Lixia,Sun Liping
(School of Life Sciences,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

This study was aimed to investigate the effects of Si-Wu mixture on the secretion of E2and the expression of CYP19a1 gene in granulosa cells after cell injury.Ovarian granulosa cells of SD rats were treated with cisplatin(CDDP). And the expression levels of E2and CYP19a1 were determined by different testing methods.The results showed that the level of E2induced by radioimmunoassay of the Si-Wu group was significantly higher than that of the CDDP group. Meanwhile,the group which added TGF-β3 protein pathway blocker was lower than others.The results of immunohistochemistry and western blotting showed that the expression level of CYP19a1 of the Si-Wu group was higher than that of the CDDP group.In the western blotting,the group which added blocker was significantly lower than the non-blocking group.It was concluded that the pharmacological serum of Si-Wu mixture can enhance the level of E2in CDDP cells through TGF-β3 protein pathway.And the effect is accomplished by the intervention of CYP19a1.

Si-Wu mixture,CYP19a1,TGF-β3 protein pathway,granulosa cells,estrogen

10.11842/wst.2017.04.017

R285.5

A

（責任編輯：陳寧，責任譯審：王晶）

2017-02-20

修回日期：2017-03-19

＊國家自然科學基金委面上項目（81673764）基于ERαERβGPER介導分子通路探究四物湯補血調經的最佳配比規律及分子機制負責人：趙丕

文；北京中醫藥大學基本科研業務費（2015 JYB JSMS016）SF-1介導的四物合劑干預順鉑作用顆粒細胞E2分泌水平的研究，負責人：孫麗萍。

＊＊通訊作者：孫麗萍，副教授，碩士生導師，主要研究方向：分子生物學與中醫藥防治女性生殖疾病研究。