廣西野生稻耐冷性鑒定與遺傳純合研究

郭 輝，陳 燦，張曉麗，秦學毅，馮 銳

(廣西農業科學院水稻研究所/廣西水稻遺傳改良生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530007)

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廣西野生稻耐冷性鑒定與遺傳純合研究

郭 輝，陳 燦，張曉麗，秦學毅，馮 銳*

(廣西農業科學院水稻研究所/廣西水稻遺傳改良生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530007)

【目的】篩選耐冷性強的野生稻種質，研究野生稻耐冷性遺傳的穩定性，為水稻耐冷性育種和研究提供抗源。【方法】利用人工氣候箱對收集的廣西野生稻資源進行苗期耐冷性鑒定，在桂北高寒山區自然低溫條件下進行宿根期耐冷性評價；選擇耐冷性較強的材料通過連續套袋自交或花藥培養進行耐冷性遺傳純合研究。【結果】篩選出苗期1級耐冷材料廣西普通野生稻20份，廣西藥用野生稻1份，普通野生稻花培株系92份；宿根期3級耐冷材料廣西普通野生稻43份，藥用野生稻2份，普通野生稻花培株系5份；耐冷性較強的直立或半直立型種質8份；廣西普通野生稻苗期和宿根期耐冷性呈極顯著正相關(r=0.26)，廣西藥用野生稻苗期和宿根期耐冷性相關性不顯著(r=-0.11)；廣西普通野生稻在苗期耐冷性與宿根期耐冷性上，平均耐冷等級均表現為匍匐型耐冷性最強，傾斜型次之，半直立型與直立型間無差異且最弱；來自桂北的野生稻苗期耐冷性最強；來自桂南的野生稻宿根期耐冷性表現最強。【結論】鑒定篩選出的材料可用于耐冷育種及抗逆機理研究。篩選出的材料可用于水稻耐冷性研究和育種，同時可以通過套袋自交與花藥培養加快獲得耐冷性更強的純合株系。

普通野生稻；藥用野生稻；耐冷性；遺傳純合；

【研究意義】低溫是影響水稻生產發育、產量和限制種植面積的重要因素，對水稻生產威脅極大，我國每年因低溫冷害損失稻谷30～50億kg[1]。在高緯度高海拔地區冷害優為嚴重，而在低緯度低海拔的南方稻區，早造的倒春寒與晚造的寒露風均嚴重影響水稻產量，甚至失收[2-3]。減少低溫對水稻生產的不利影響，選育及推廣耐冷性強的品種是防御冷害經濟有效的途徑之一。廣西野生稻資源極為豐富，野生稻作為天然的基因庫，蘊藏著無數栽培稻沒有或已削弱的特異優良基因[4]，因此挖掘野生稻的耐冷性材料對水稻耐寒育種利用創新具有重要意義。【前人研究進展】耐冷性種質資源的鑒定、篩選與利用是抗寒育種的材料基礎[5]，許多研究學者在水稻耐冷鑒定篩選中做了大量工作，獲得了一批耐冷性強的優異種質。張建華等[6]在控溫條件下從690份中日雙方提供的稻種資源中，分別篩選出芽期和苗期極耐冷材料25和14份。戴陸園[7]從2763份云南稻種資源中篩選出芽期耐冷性(1～3級)資源79份，從475份稻種資源中發掘出苗期耐冷性資源5份。韓龍植等[8]從879份水稻種質資源中篩選出芽期耐冷性極強的種質資源39份。夏秀忠等[9]對419份廣西水稻地方初級核心種質進行芽期、苗期的耐冷鑒定，篩選出極強耐冷種質分別為24和27份。【本研究切入點】目前對野生稻部分材料耐冷性評價已有相關研究[10-11]，但對廣西野生稻苗期與宿根期耐冷的相關性及野生稻耐冷性的遺傳純合的研究較少。【擬解決的關鍵問題】對廣西野生稻及其花培株系進行苗期與宿根期耐冷性鑒定，了解不同野生稻種質的苗期與宿根期耐冷性差異，探討純合野生稻的方法，篩選極強耐冷的優異野生稻種質資源，為基礎研究及育種利用提供良好的供試材料。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本試驗材料是在廣西46個縣148個野生稻分布點收集，試驗中廣西普通野生稻共鑒定1657份，其中苗期鑒定983份，宿根越冬期鑒定1487份；廣西藥用野生稻共鑒定199份，其中苗期鑒定98份，宿根越冬期鑒定199份；普通野生稻花培材料共鑒定128份，其中苗期鑒定92份，宿根期鑒定128份；對照分別為耐冷粳稻品種滕坂5號和對冷敏感秈稻品種IR 8。

1.2 耐冷鑒定

1.2.1 苗期耐冷鑒定及分級標準 參照韓龍植和張三元的方法[12]，將浸種催芽的種子播于托盤，待3葉期或3葉1心期時去除小弱苗，置于人工氣候箱冷處理，處理條件為溫度6 ℃，相對濕度80 %，光照5000 lx，光/暗各12 h循環，連續處理6 d后，置于室內有散光處自然恢復7 d后調查死苗率，死苗率( %)=死苗株數/總株數×100，重復3次。

耐冷評級標準：1級死苗小于10 %(極強)；3級死苗在11 %～30 %(強)；5級死苗在31 %～50 %(中等)；7級死苗在51 %以上(弱)；9級全部死亡(極弱)。

1.2.2 宿根越冬耐寒鑒定及分級標準 宿根越冬采用高寒山區自然低溫鑒定，試驗點設在廣西桂林市龍勝縣和全州縣，在2000-2006年，于每年7月份移栽種植，越冬前調查野生稻分蘗及生長情況，次年3月份開始調查越冬后野生稻存活及生長狀況，按耐冷鑒定分級標準進行評估和統計。

宿根越冬分級標準：整個越冬期共調查3次。第1次在初霜前調查越冬前成活材料數，分3級記載其生長情況，第2次在次年3月上旬，按越冬期耐冷鑒定的5級標準進行，第3次在4月下旬，仍按5級標準調查。耐冷分級采用目測法，其標準為1級：老莖基部及再生苗能越冬，再生苗多，長勢好，死苗在20 %以內；3級：大部分(>70 %)老莖基部及再生苗能越冬，再生苗數量及長勢中等；5級：大約半數(50 %～70 %)老莖基部能越冬，再生苗較少，長勢較弱；7級：少數(50 %以下)老莖基部能越冬，再生苗少，長勢弱；9級：老莖基部及再生苗全部枯死。

1.3 野生稻遺傳純合

野生稻多為雜合體，為了便于利用研究，對其進行遺傳純合。選取初篩后耐冷性較好的材料，進行套袋自交，收種后繼續進行耐冷性鑒定，再選取耐冷性較強的單株套袋自交收種，如此自交選擇3～5代，以期獲得耐冷性純合的株系。

花藥培養 參照馮銳等[18]的方法，在野生稻花粉母細胞減數分裂的單核靠邊期剪取稻穗，于6～8 ℃條件下預處理6～8 d，小穗在0.1 %升汞溶液中消毒6 min，取花藥接種到愈傷組織誘導培養基中進行暗培養，待獲得的2 mm大小愈傷組織時，接種于分化培養基上進行分化培養，愈傷組織分化出的綠苗經煉苗、移栽和套袋收種。

誘導培養基配方：N6大量和微量元素+MS有機物+甘氨酸4 mg/L+丙氨酸2 mg/L+水解乳蛋白(LH)400 mg/L+2,4-D 2 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L+蔗糖5 %。

綠苗分化培養基為MS基本培養基+水解酪蛋白(CH)500 mg/L +IAA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+ Kinetin 1.5 mg/L+蔗糖5 %。

圖1 廣西普通野生稻材料苗期、宿根期耐冷級別分布 Fig.1 Distribution of cold tolerance of the Oryza rufipogon in Guangxi at germinating and seeding stage

1.4 統計分析

試驗數據采用Excel、DPS 7.05等軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 廣西普通野生稻耐冷性鑒定結果

廣西普通野生稻苗期耐冷性鑒定984份，平均耐冷等級5.97級，變異系數30.52 %。多數種質材料集中在5和7級，這2個等級材料占總參試材料的75.10 %，而1、3、9級分別占參試材料的2.03 %、15.14 %、7.72 %(圖1)。宿根期耐冷性鑒定1488份，平均耐冷等級6.62級，變異系數21.91 %。其耐冷性分布與苗期耐冷分布相似，以耐冷5級與7級材料較多，但未發現1級耐冷材料，3、5、7、9級材料分別占參試材料的2.89 %、29.03 %、52.49 %、15.59 %(圖1)。

對943份廣西普通野生稻苗期和宿根期耐冷級別相關性分析表明，兩者呈極顯著正相關(r=0.26)。從中篩選到耐冷性較強的直立或半直立型種質8份(表1)，其中直立型材料1008苗期耐冷級別為3級，半直立型材料1507苗期耐冷級別達1級，半直立型材料753苗期與宿根期耐冷均為3級。

2.2 廣西藥用野生稻耐冷性鑒定結果

廣西藥用野生稻苗期耐冷性鑒定98份，平均耐冷級別4.78級，變異系數30 %，其中5級材料占多數，未發現9級材料，1、3、5、7級材料分別占參試材料的1.02 %、28.57 %、51.02 %、19.39 %。宿根期耐冷性共鑒定198份，平均耐冷級別6.15級，變異系數16.76 %，以5和7級材料占多數，分別占參試材料的40.40 %和58.49 %，3級材料僅2份，占參試材料的3.90 %，未發現1和9級材料(圖2)。對97份廣西藥用野生稻苗期和宿根期耐冷級別相關性分析表明，兩者相關性不顯著(r=-0.11)。

圖2 廣西藥用野生稻材料苗期、宿根期耐冷級別分布 Fig.2 Distribution of cold tolerance of the Oryza officinalis in Guangxi at germinating and seeding stage

2.3 廣西普通野生稻株型之間苗期、宿根期耐冷性的差異分析

廣西普通野生稻按生長習性(株型)分為匍匐、傾斜、半直立和直立4個類型，對類型間進行耐冷差異的比較分析。由表2可知，在苗期耐冷性與宿根期耐冷性上，匍匐型材料在平均耐冷級別、變異系數、表現為3級以上耐冷資源比例均最高，苗期的平均耐冷等級為5.65級，變異系數為33.98 %，表現為3級以上耐冷資源占該類型比例為23.83 %；宿根期的平均耐冷等級為6.28級，變異系數為21.02 %，表現為3級以上耐冷資源占該類型比例為3.98 %。在苗期耐冷性與宿根期耐冷性上，平均耐冷等級均表現為匍匐型耐冷性最強，傾斜型次之，半直立型與直立型間無差異且最弱。

表1 耐冷性較強的直立或半直立型種質

表2 廣西普通野生稻株型之間苗期、宿根期耐冷性差異比較

2.4 廣西野生稻采集地區之間苗期、宿根期耐冷性的差異分析

把廣西野生稻的采集地按稻作區分為桂南、桂中、桂北3個區域，由表3可知，廣西普通野生稻在苗期耐冷性上，來源于桂北的材料在平均耐冷級別、變異系數、表現為3級以上耐冷資源比例均最高，其中平均耐冷等級為5.17級，變異系數為37.99 %，表現為3級以上耐冷資源占該區域比例為30.99 %。來源于桂中的材料在耐冷性表現最弱，平均耐冷等級為6.40級。廣西普通野生稻在宿根期耐冷性上，來源于桂南的材料在平均耐冷級別、變異系數、表現為3級以上耐冷資源比例均最高，其中平均耐冷等級為6.54級，變異系數為22.32 %，表現為3級以上耐冷資源占該區域比例為3.35 %。同樣是來源于桂中的材料在耐冷性表現最弱，平均耐冷等級為6.76級。藥用野生稻在宿根期耐冷性上，來源于桂南的材料耐冷性表現較強，其中平均耐冷等級為6.01級，變異系數為17.53 %，表現為3級以上耐冷資源占該區域比例為1.30 %。來源于桂中的材料在耐冷性表現較弱，平均耐冷等級為6.64級。

2.5 普通野生稻花藥純合株系耐冷性鑒定結果

普通野生稻多為雜合體，同一編號單株間其農藝性狀和抗性存在一定的分離，導致難以育種利用，為得到耐冷性純合植株，在耐冷鑒定基礎上對一些耐冷性較好的材料進行花藥培養，對花培植株H2株系進行耐冷鑒定。從表4可知，來源于2個材料的花培后代株系耐冷性與形態特性均已穩定，同一材料后代的花培株系間耐冷性出現分離，但未發現比原耐冷性更強的株系。

對所有的花培株系進行耐冷性鑒定統計，從表5可知，苗期耐冷鑒定92份，平均耐冷級別3.52級，變異系數40.26 %，其中以3級材料占多數，為參試材料的59.78 %，1、5、7級材料分別占參試材料的9.78 %、25 %、5.43 %，未發現9級材料。宿根期耐冷鑒定128份，平均耐冷級別5.02級，變異系數11.73 %,以5級材料最多，其中3、5、7級材料分別占參試材料的3.91 %、91.41 %、4.69 %，未發現1級和9級材料。對92份普通野生稻花培株系苗期耐冷與宿根期耐冷分析表明，兩者呈極顯著正相關(r=0.41)。

表3 廣西野生稻不同采集區域耐冷性差異比較

表4 普通野生稻花培植株耐冷性表現

表5 普通野生稻花培株系耐冷鑒定結果

2.6 普通野生稻自交純合苗期耐冷性分析

從984份苗期耐冷鑒定的普通野生稻中選出6份有代表性材料進行自交遺傳純合，結果見表6，原平均苗期耐冷1級的材料315、1502，其自交1～2代都有1～3級耐冷分離，經4代套袋自交及選擇后苗期耐冷性趨于1級穩定。原平均苗期耐冷3級的材料1008、1085，其自交1～2代都有1～5級耐冷分離，經4代套袋自交及選擇后苗期耐冷性基本在1～3級分離。原平均苗期耐冷5級的材料644、1372，其自交1～2代都有3～7級耐冷分離，經4代套袋自交及選擇后，材料1372苗期耐冷性趨于穩定，為3級；材料644苗期耐冷性基本為3～5級分離。

3 討 論

3.1 野生稻苗期和宿根期耐冷性與地理環境關系

曾亞文研究團隊[13-14]分析了云南地方稻核心種質孕穗期耐冷性、苗期耐冷性及地理生態差異；張建華等[5]分析了690份中日稻種資源芽期和苗期耐冷性及云南稻種地理分布區域；夏秀忠等[15]對廣西水稻核心種質進行稻作區之間芽期、苗期耐冷性差異分析。前人結果[5-8,16-17]表明水稻耐冷性與其來源地海拔和緯度有一定的相關性。本研究結果也表明，來源于廣西南部的普通野生稻與藥用野生稻資源，宿根期耐冷性均顯著高于其它區域的資源，而來源于是廣西北部的普通野生稻苗期耐冷性極顯著高于其它區域的資源，說明廣西野生稻苗期與宿根期耐冷性與地理環境有關。多位學者研究認為，栽培稻種高緯度地區水稻耐冷性優于低緯度地區[5,7,16-17]。本研究結果表明，宿根期耐冷性表現為普通野生稻桂南>桂北>桂中，藥用野生稻桂南>桂中，普通野生稻苗期耐冷性表現為桂北>桂南>桂中，這與栽培稻種資源的耐冷性規律有所不同。

表6 普通野生稻自交后代苗期耐冷性表現

3.2 普通野生稻遺傳純合與耐冷性

普通野生稻具有異花授粉特性，從原生地收集的材料資源絕大數是以雜合體形式保存下來，這些材料多數耐冷性水平較低，不能代表其真正的耐冷水平，若直接利用，很難獲得具有更強耐冷性的后代，另外對于一些優異的隱性性狀也很難發現。因此，對普通野生稻材料先進行遺傳純合后，再對其開發利用具有重要意義。本研究結果表明，經過4代的套袋自交及目標選擇后，可能獲得耐冷性更強，遺傳趨于穩定的野生稻材料；利用花藥培養技術，可更快的獲得遺傳純合的野生稻材料；這更有利于客觀評價野生稻資源，并加快優異資源在基礎研究和育種上的利用。而利用同樣的方法，在普通野生稻抗褐飛虱方面進行了研究，并獲得了一批純合種質資源[18]。另外，若先對野生稻進行2～3代套袋自交及目標選擇，再對優良單株進行花藥培養，則可能更快獲得耐冷性強的純合材料。

4 結 論

本研究鑒定篩選出廣西野生稻苗期1級耐冷材料共113份，宿根期3級耐冷材料共50份；耐冷性較強的近栽材料8份，這些材料可用于耐冷育種及抗逆機理研究。普通野生稻自身的雜合性，可通過多代套袋自交結合耐冷性選擇，獲得耐冷性更強性狀穩定的株系材料；通過花藥培養技術，可快速獲得純合普通野生稻材料。

[1]劉建豐，陳立云.水稻耐冷性研究現狀與展望[J].作物研究,1996,10(2):41-43.

[2]詹慶才，曾曙珍，熊伏星，等. 水稻苗期耐冷性QTLs的分子定位[J]. 湖南農業大學學報(自然科學版),2003,29(1):7-11.

[3]王慶國，黃增俊，黃歸蘭，等.南寧市近40年寒露風演變趨勢及對晚稻的影響[J]. 南方農業學報,2013,44(3):431-436.

[4]鐘代彬，羅利軍，應存山.野生稻有利基因轉移研究進展[J].中國水稻科學,2000,14(2):103-106.

[5]游俊梅，阮仁超，陳惠查，等.稻種資源耐冷性鑒定與評價指標分析[J]. 貴州農業科學,2000,28(3):34-36.

[6]張建華，廖新華，戴陸園，等.稻種資源芽期和苗期的耐冷性評價[J].中國農學通報,1996,12(5):10-13.

[7]戴陸園.云南稻種資源耐冷性研究[D].華中農業大學博士學位論文,2002:22-23.

[8]韓龍植，曹桂蘭，安永平，等.水稻種質資源芽期耐冷性的鑒定與評價[J].植物遺傳資源學報,2004,5(4):346-350.

[9]夏秀忠，張宗瓊，楊行海，等.廣西水稻地方品種耐冷性鑒定及相關分析[J]. 植物遺傳資源學報,2016,17(6):969-975.

[10]林登豪. 廣西野生稻資源耐冷性鑒定[J].廣西農業科學,1992,(2):53-56.

[11]陳成斌，李道遠，黃 勇，等.普通野生稻資源耐冷性研究[J]. 廣西農學報,1994(4):1-5.

[12]韓龍植，張三元. 水稻耐冷性鑒定評價方法[J]. 植物遺傳資源學報,2004,5(1):75-80.

[13]李紳崇，曾亞文，申時全，等.云南地方稻核心種質孕穗期耐冷性及其地理分布[J].中國水稻科學,2004,18(5):27-32.

[14]曾亞文，李紳崇，普曉英，等.云南稻核心種質苗期耐冷性及其地理生態差異[J].生態環境,2006,15(2):345-349.

[15]夏秀忠，曾 宇，農保選，等.廣西地方稻種資源核心種質的耐冷性鑒定評價[J]. 西南農業學報,2014,27(5):1801-1805.

[16]阮仁超，陳惠查，游俊梅，等.貴州稻種遺傳資源耐冷性鑒定與利用評價[J].貴州農業科學,2004,32(1):10-13.

[17]曾亞文，李紳崇，普曉英，等.云南稻核心種質孕穗期耐冷性狀間的相關性與生態差異[J]. 中國水稻科學,2006,20(3):265-271.

[18]馮 銳，郭 輝，劉百龍，等.普通野生稻褐飛虱抗性遺傳純合研究[J]. 南方農業學報,2012,43(2):146-150.

(責任編輯 王冠玉)

Study on Cold Tolerance Identification and Genetic Homozygosity of Wild Rice in Guangxi

GUO Hui, CHEN Can, ZHANG Xiao-li, QIN Xue-yi, FENG Rui*

(Rice Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Rice Genetics and Breeding, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007，China)

【Objective】Screening wild rice germplasm resources with strong cold tolerance, and studying their genetic stability would provide resistant sources for rice cold tolerance breeding and research.【Method】Identification of cold tolerance germplasm at seedling stage was carried out to wild rice resources collected from Guangxi in the artificial climate box, and cold tolerance at perennial root stage was evaluated under the circumstances of natural cold at highland cold area lying in the north of Guangxi. We will study genetic purity of cold tolerance germplasms through continuously bagging selfing and anther culture. 【Result】20 common wild rice,1 medicinal wild rice and 92 common wild rice by flower breeding were found, their cold tolerance reach 1 class at seedling stage;some germplasm resources showed cold tolerance to 3 class at perennial root stage, which included 43 common wild rice,2 medicinal wild rice 5 common wild rice by flower breeding; 8 erect type and slighting type germplasm resources showed stronger cold tolerance were found. The study announced at seedling stage and perennial period,the average cold tolerance levels of Guangxi common showed creeping type wild rice had the strongest cold tolerant, next was tilt type rice, and the weakest was Semi-erect type and erect type which had no difference between them. 【Conclusion】These resources of identified and screened would be used for cold resistant breeding and resistant mechanism research. These materials would be used to carry out in breeding utilization and cold tolerance to research. Moreover,this research found that through bagging selfing and anther culture can obtain stronger cold tolerance homozygous lines accelerately.

Oryzarufipogon; Oryzaofficinalis; Cold tolerance; Genetic homozygosis

1001-4829(2017)6-1245-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.001

2017-03-21

國家自然科學基金“藥用野生稻對褐飛虱免疫抗性的功能研究與抗性利用”(31560385)；廣西自然科學基金項目“普通野生稻抗褐飛虱新基因精細定位及比較轉錄組學分析”(2015GXNSFAA139060)；廣西科技計劃項目“野生稻抗褐飛虱基因的挖掘和利用”(桂科AB16380138)；廣西科技計劃項目“越、老、柬秈型特種水稻種質資源引進與應用”(桂科合15104001-27)；廣西農業科學院科技發展基金項目“廣西野生稻優異資源的繁殖更新及高抗體材料的遺傳純合”(桂農科2017JM70)

郭 輝(1982-)，男，山西臨汾人，碩士，助理研究員，主要從事水稻抗逆資源評價與遺傳育種研究工作，E-mail：gh8207@163.com，*為通訊作者，E-mail：fengrui@gxaas.net。

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