四川省3個不同栽培地油橄欖品種皮瓜爾的含油率與遺傳差異分析

趙 琦，郭曉強，莊國慶，顏 軍，何世勤，李 銳*

(1.成都大學藥學與生物工程學院，四川 成都 610106；2.四川省林業科學研究院，四川 成都 610081；3.四川省天源油橄欖有限公司，四川 達州 636251)

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四川省3個不同栽培地油橄欖品種皮瓜爾的含油率與遺傳差異分析

趙 琦1，郭曉強1，莊國慶2，顏 軍1，何世勤3，李 銳1*

(1.成都大學藥學與生物工程學院，四川 成都 610106；2.四川省林業科學研究院，四川 成都 610081；3.四川省天源油橄欖有限公司，四川 達州 636251)

【目的】油橄欖是重要的油果兼用經濟林木，含油率的高低直接影響到油橄欖品種經濟價值。影響含油率因素包括所處生態環境和遺傳潛力。【方法】本文以引種到四川省3個不同生態區(達州、金堂和西昌)的油橄欖品種皮瓜爾作為研究對象，首先分析了皮瓜爾原產地(西班牙地區)和引種栽培地(達州、金堂和西昌)的氣候特點，結合含油率的測定結果(西昌皮瓜爾含油率最高)，推測日照時數是影響含油率的關鍵生態因子。隨后對克隆到的功能基因編碼序列DNA片段進行SNP分析，發掘其中的單核苷酸變異位點和其編碼的氨基酸變異位點。【結果】在花青素合酶(Anthocyanidin synthase，ANT)、鈣調蛋白(Calcium binding protein，CBP)和查爾酮合酶(Chalcone synthase，CHS)3個基因片段中檢測到了SNP，共發現了3個CAPS位點，得到的2種SNP組合(SNP1-HphI/SNP2-EagI和SNP2-EagI/SNP3-BsgI)可以完成對皮瓜爾品種區域性的鑒別。【結論】本研究獲得的3個CAPS分子標記實現了對不同區域油橄欖品種皮瓜爾快速、準確的鑒定，今后將加大對該基因功能差異的研究，以期為油橄欖育種研究奠定基礎。

油橄欖；含油率；單核苷酸多肽(SNP)；遺傳差異

【研究意義】油橄欖(OleaeuropaeaL.)為木犀科(Oleaceae)木犀欖屬(Olea)的常綠喬木，是世界四大木本油果兼用(油橄欖、油棕、油茶、椰子)樹種之一，該植物原產地主要分布于地中海沿岸國家，中國是其在東亞的主要引種栽培區，四川省是引種油橄欖最早的省份之一[1]。油橄欖果實中所含的橄欖油是世界上唯一可通過鮮果冷榨即可食用的植物油，具有預防心腦血管、癌癥等惡性腫瘤的功效，享有“植物油皇后”、“液體黃金”等美稱[2]。油橄欖最大的用途是制油，因此如何提高其含油率就成了研究重點，韓華柏等[3]利用逐步回歸分析的方法研究了影響油橄欖含油率的關鍵因子，結果表明，光、溫、水等指標綜合影響油橄欖的產量和品質。郭翔等基于GIS的生態評價系統則進一步分析了四川油橄欖引種栽培的環境條件，指出油橄欖的含油量、產量和品質與其所處的生態環境密切相關，當前分布區的生境條件與引種區的生境條件越相似，越有利于油橄欖的生長發育[4]。另有研究則指出，對于生長在不同生境條件下的油橄欖，由于生境異質性往往會通過歧化選擇或本地適應來導致適應性遺傳多樣性的發生[5]。從以上油橄欖含油率、產量與環境因子之間的關系研究可以看出，油橄欖所處的生態環境是一個重要的影響因素。【前人研究進展】隨著分子生物學的發展，基于分子標記方法不受外界環境因素影響的優點，越來越多的分子標記(如RAPD[6]、SSR[7]、ISSR[8]、SRAP[9]等)被應用于油橄欖的遺傳多樣性分析，人們可以直接從基因水平研究油橄欖的遺傳差異，進而指導油橄欖的篩選與利用，獲得高含油率、高品質的油橄欖資源。近年來，基于SNP標記技術的PCR-RFLP方法(CAPS)被國外學者開發應用于油橄欖品種鑒定和適應性遺傳多樣性分析[10-11]。該方法通過簡單的實驗手段(克隆、測序和序列比對)檢測堿基的序列差異，只需酶切具有突變的限制性內切酶位點序列即可直接通過瓊脂糖凝膠電泳觀測SNP 基因分型結果，方法簡便易行。Ali[11]和Clarissa[10]等人分別利用CAPS技術對油橄欖品種做了遺傳多樣性分析和分類鑒別工作，而運用該技術對油橄欖進行適應性遺傳多樣性的研究國內尚未見報道。【本研究切入點】因此，本研究針對四川省3份具有不同氣候特征的引種栽培地油橄欖品種皮瓜爾進行含油率測試分析比較，參考Ali[11]和Clarissa[10]等人報導的存在酶切位點的候選SNP位點序列，對這些序列進行克隆測序和序列比對，檢測四川省不同引種栽培地皮瓜爾品種間的堿基序列差異，探討同一品種引種到不同生態環境栽培地的適應性遺傳多樣性，以及將這些基因作為分子標記應用于不同引種栽培地皮瓜爾品種遺傳差異檢測的可能性。【擬解決的關鍵問題】本研究為今后油橄欖品種的栽培與利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

在四川省收集3個具有典型氣候特征的引種栽培地油橄欖品種皮瓜爾(原產于西班牙)作為供試材料。材料收集地、氣候特征見表1。具體材料采集信息：西昌樣品收集于涼山州西昌市西溪鄉北河水庫油橄欖生態示范園，達州樣品收集于開江縣紅花山川東北油橄欖品種園，金堂樣品收集于成都市金堂縣淮口鎮油橄欖產業示范園。供試地區氣候特征通過搜集文獻總結得出[12-15]。以嫩葉為提取基因組DNA的材料。采集嫩葉后放入裝有硅膠的自封袋中，帶回實驗室置冰箱中-20 ℃保存備用。

1.2 菌株與試劑

大腸桿菌菌株Top10由本實驗室保存，primerstar高保真酶，pMD19-T 載體購自TaKaRa 公司，植物基因組DNA 提取試劑盒(DP305-02)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(DP214-03)購自天根生化(北京)科技有限公司，PCR 引物合成和基因測序由北京擎科梓熙基因有限公司完成。其它化學藥品為進口或國產分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 干果含油率的測定 采用索氏提取法測定干果含油率。方法：將鮮果烘干至恒重，打成細粉，用濾紙包裹好，每份5 g，記為M，一式三份；準備干凈的圓底燒瓶(150 mL)，稱重，記錄圓底燒瓶的重量，記為M1(g)；將樣品置于索氏抽提儀中，用正己烷回流提取 8 h，利用旋轉蒸發儀將正己烷蒸干，記錄含油圓底燒瓶的重量，記為M2(g)；按如下公式計算出干果含油率：含油率=(M2-M1)/M×100 %。

1.3.2 DNA的提取 每個栽培地油橄欖品種皮瓜爾取5個單株新鮮葉片組成混合樣品池，采用天根公司植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，并用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。

1.3.3 所選基因片段的克隆 采用Ali[11]和Clarissa[10]所提出的基因序列及引物，在此基礎上篩選與油橄欖產量或含油率相關的6個基因作為研究對象(表2)。PCR反應體系和條件見文獻[10-11]。所得產物經回收后克隆到pMD19-T載體上，轉化E.coliTop10感受態細胞。菌落經PCR驗證后，挑取陽性菌落送往北京擎科梓熙基因有限公司測序。利用NCBI Blast軟件包對所得序列進行比對分析，確認序列的可靠性。

1.3.4 SNP位點檢測分析 利用DNAMAN軟件對已確認可靠的基因序列進行多重比對分析，從PCR擴增的DNA片斷中找到單堿基突變位點，確定SNP。通過NEBCutter V2.0 軟件(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)預測SNP位點所在的區域是否存在限制性酶切位點。隨后對存在酶切位點的候選SNP位點進行PCR-RFLP 檢測。應用相應的限制性內切酶對目標引物的PCR產物進行酶切反應。反應體系及條件見參考文獻[10-11]。

表1 油橄欖干果含油率與栽培地氣候特征

2 結果與分析

2.1 各引種栽培地皮瓜爾含油率評價

從表1可以看出，不同栽培區生態環境對油橄欖含油率影響不同，涼山州西昌地區擁有最充足的光熱資源，氣溫、降水、空氣濕度和日照等指標與其原產地西班牙地區接近，含油率最高，達州和金堂含油率低于西昌，屬于四川省山地低海拔地區，多數因子符合油橄欖的生長條件，僅有少數因子欠佳，比如日照時數只有原產地的一半左右。有研究表明，油料植物對光與輻射能的需要量較其它植物更大，日照強度與時長會通過影響植物光合作用和果實發育的同化代謝過程，進而影響植物的產量、含油率和油脂成份[17]。因此日照時數的差異也許正是3個地區皮瓜爾含油率存在差異的原因之一。此外，周立江的分析指出，含油率和產量并不單受某一因子的影響，除了日照時數外，可能還受林地坡向、土壤、花與果實發育的氣候條件影響[5]。由此可見，引種栽培區與原產區的環境異質性會導致植物的產量和品質存在差異。

2.2 相關基因片段SNP分析

通過對皮瓜爾3個栽培地所選基因的PCR擴增、克隆、測序，分別得到ANT基因279 bp、CBP基因333 bp、CHS基因300 bp、FAD2.1基因151 bp、LUP基因113 bp、ACP基因191 bp的編碼區域DNA序列。運用NCBI、DNAMAN和NEBCutter V2.0軟件對所克隆的序列進行SNP分析(表2～4)，結果顯示：在相應長度核酸序列內ACP、FAD2.1和LUP基因在本研究3個栽培地不存在多態性；克隆長度為279 bp的ANT基因序列中有7個單核苷酸位點發生變異，導致了4個氨基酸位點產生突變，3個為同義突變，4個為有意義突變，多態性頻率為1SNP/39.9 bp，其中達州ANT基因第181個位點的單核苷酸變異引起了1個限制性內切酶位點HphI的改變；達州、西昌的CBP基因序列顯示出該基因片段含有一個EagI限制性內切酶位點，而金堂的該序列卻因G-C的轉換而失去這一酶切位點；類似的特點也存在于達州的CHS序列中，達州的CHS基因序列顯示出該基因片段含有一個BsgI限制性內切酶位點，而金堂、西昌的該序列卻因T-C的轉換而失去這一酶切位點。

表2 SNP-CAPS標記引物信息

表3 基因片段單核苷酸變異位點

注：*代表CAPS位點。下同。

Note：*represents CAPS sites.The same as below.

表4 基因片段氨基酸變異位點

選擇其中存在有合適內切酶的突變點，分別采用內切酶HphI、EagI 、BsgI及引物進行PCR產物的酶切檢測。電泳檢測及測序結果如圖1。對3個區域3個基因CAPS 標記分析可以看出，依次采用ANT基因的SNP1-HphI標記可以將達州與金堂、西昌的皮瓜爾明顯分開，CBP基因的SNP2-EagI標記將金堂與西昌的皮瓜爾區分開來；類似的首先采用CBP基因的SNP2-EagI標記可以將金堂與達州、西昌的皮瓜爾明顯分開，隨后采用CHS基因的SNP3-BsgI標記可將達州與西昌的皮瓜爾區分開來。因此，本研究得到2種SNP組合(SNP1-HphI/SNP2-EagI和SNP2-EagI/SNP3-BsgI)，可以完成對皮瓜爾品種區域多態性的鑒別，表明本研究中所用 SNP 位點具有良好的區域區分能力。

M:DNA Marker DL5000；1:達州；2：金堂；3：西昌圖1 CAPS電泳(A)及測序結果(B)Fig.1 CAPS electrophoresis(A) and sequencing results of ANT, CBP and CHS(B)

3 討 論

含油率是油橄欖育種考慮的首要性狀，分析影響含油率高低的因素意義重大。本研究表明，西班牙油橄欖品種皮瓜爾引種到四川省達州、金堂、西昌3個地區栽培后，表現出不同的含油率，尤以西昌地區含油率最高，該地區生態環境因子與原產地極為相似，從日照時數指標看遠遠高于達州和金堂，說明日照時數是影響油橄欖含油率的一個關鍵生態因子，這與姚麗華[17]的報道是一致的。

影響油橄欖產量與含油率的因素較為復雜，尤其在長期的引種馴化過程中，一些性狀難免會因環境或栽培條件的影響發生變異，導致其在遺傳多樣性上產生差異，而這些差異往往很難從形態學上進行鑒別，因此本研究基于特定的基因序列，利用CAPS技術對引種到四川省達州、金堂、西昌3個地區栽培地的皮瓜爾進行適應性遺傳多樣性研究，分析各栽培地皮瓜爾資源的多態性。與先前Ali對土耳其油橄欖的分析結果相比，本次供試材料的遺傳多樣性差異要相對低一些，說明3地的油橄欖品種皮瓜爾資源存在遺傳相似性較高、遺傳基礎較窄的情況，盡管如此本研究運用SNP與限制性內切酶相結合的策略，仍選擇出了3個SNP標記(2種SNP組合)得以對皮瓜爾品種的區域多態性加以鑒別。此外，本研究所選擇的基因主要參與了油橄欖的逆境脅迫、果實發育等過程[18-19]，篩選獲得的SNP處于基因的編碼區，可能會在分子功能和生物過程方面發揮重要的作用，后期將對這些基因更多的SNP進一步檢測，并且和含油量、產量等性狀聯系起來分析，找到影響這些指標的SNP，為油橄欖的分子育種提供SNP分子標記，以期在種質資源保護、品種鑒別、適應性遺傳多樣性研究以及生態演化等領域得到廣泛的應用。

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(責任編輯 陳 虹)

Analysis of Oil Content and Genetic Diversity for Introduced Picual Cultivars in Sichuan Province

ZHAO Qi1, GUO Xiao-qiang1, ZHUANG Guo-qing1, YAN Jun1, HE Shi-qin3, LI Rui1*

(1.College of Pharmaceutical and Biological Engineering,Chengdu University,Sichuan Chengdu 610106,China;2.Sichuan Academy of Forestry,Sichuan Chengdu 610081,China;3.Sichuan Tianyuan Olive Co.,Ltd.,Sichuan Dazhou 636251,China)

【Objective】Olive(OleaeuropaeaL.) which can be used for oil and food is a kind of important economic forest tree. Oil content is an important factor affecting the economic value of olive. Factors that affected oil content include ecological environment and genetic potential.【Method】 In this paper, theOleaeuropaeaL.varieties ( Picual) from Dazhou,Jintang and Xichang in Sichuan province were used as tested materials, firstly, the climatic characteristics of Picual between the origin (Spain) and cultivation areas (Dazhou, Jintang and Xichang) were evaluated, combining with the oil content data detected, sunshine duration was the key factor which affected the oil content, the related gene segments in three introduced areas (Dazhou, Jintang and Xichang) by using PCR technology were cloned, and their sequences were made for SNP analysis. 【Result】SNPs in three gene fragments of anthocyanidin synthase, calcium binding protein and chalcone synthase were detected, a total of three CAPS sites were found, and 2 pairs of three CAPS sites (SNP1-HphI/SNP2-EagI and SNP2-EagI/SNP3-BsgI) could differentiate between the Dazhou, Jintang and Xichang of Picual with rapid and accurate identification.【Conclusion】In the next future, the further research on the functional difference of these genes would be carried out to lay the foundation for olive breeding.

OleaeuropaeaL.; Oil content; SNP; Genetic diversity

1001-4829(2017)6-1279-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.007

2016-07-10

四川省科技廳應用基礎項目“四川油橄欖主產區產油地域性差異的分子基礎研究”(2013JY0057)

趙 琦(1981-)，男，河北滿城人，副教授，從事植物生物工程技術研究；*為通訊作者，E-mail：lirui1986523@163.com。

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