布倫口湖群濕地產蛋白酶耐低溫菌株的篩選及初步鑒定

王繼蓮，李明源，任 羽

(喀什大學生命與地理科學學院，葉爾羌綠洲生態與生物資源研究高校重點實驗室，新疆 喀什 844006)

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布倫口湖群濕地產蛋白酶耐低溫菌株的篩選及初步鑒定

王繼蓮，李明源，任 羽

(喀什大學生命與地理科學學院，葉爾羌綠洲生態與生物資源研究高校重點實驗室，新疆 喀什 844006)

【目的】從新疆東帕米爾高原布倫口湖群濕地分離產蛋白酶耐低溫細菌，對其進行初步分類鑒定，為后續低溫酶制劑的研究應用奠定理論基礎?！痉椒ā坷妹撝檫x擇培養基篩選產低溫蛋白酶菌株，并對其表型特征、生長特性及產酶性狀等進行研究，結合16S rRNA 基因序列確定布倫口湖群濕地產低溫蛋白酶功能菌株的遺傳多樣性及分類地位?！窘Y果】共篩選出6株產蛋白酶菌株，其在15 ℃條件下均能生長繁殖，屬耐冷菌，但耐鹽性一般，能在低溫條件下發酵產酶，生長穩定期達到產酶高峰。16S rRNA 基因序列初步確定4株為假單胞菌(Pseudomonassp.)，另外2株分別為芽孢桿菌(Bacillussp. ) 和節桿菌(Arthrobactersp.)。【結論】本研究篩選到的同屬近緣種群較多，但生理特征各異，這進一步拓展了低溫酶菌種資源庫，為深入探究低溫蛋白酶結構特性及在生物工程領域的應用潛力奠定堅實基礎。

布倫口湖群濕地；低溫蛋白酶；耐冷菌；16S rRNA

【研究意義】低溫蛋白酶主要由生活在低溫生境中的微生物產生[1-2]，其在低溫(0～20 ℃)下仍能有效催化蛋白質肽鍵水解，最適催化溫度一般不超過40 ℃，遠低于同功能常溫酶(50 ℃)，但高溫下(>60 ℃)易失活[3-4]。這一特性使其在食品醫藥、日用化工、環境污染物治理等對冷要求較高的行業有重要應用潛力和開發價值[5-6]，有著中高溫酶無可比擬的優越性。如在糕點烘烤過程中，低溫蛋白酶能有效降低生面團發酵時間，提升面包心質量，改善面包香味及濕度，且經高溫短時處理即失活，阻止酶作用過度，不至使面包變得太軟或太粘。隨著世界各國逐步加強對低溫酶制劑產業的科研開發支持力度，從極端低溫環境中開發產酶功能微生物資源成為研究熱點。【前人研究進展】自20世紀70 年代以來，人們相繼自深海、極地、冰川雪冰、常年凍土等常年酷寒生境中篩選低溫蛋白酶高產菌株[7-9]，并從中挖掘到一些優質高效、具有新特性的產酶新菌種，但對濕地這一富有生物多樣性的自然生態系統的研究卻鮮有報道。濕地是水域和陸地生態系統之間的過渡綜合體，具有獨特的生態系統服務價值和資源潛力，與森林、海洋一起并稱為全球三大生態系統[10-11]。濕地同時還是天然的微生物基因庫，為研究不同歷史時期自然環境演變對微生物時空格局影響以及豐富物種多樣性提供了極好框架。【本研究切入點】布倫口湖群濕地位于新疆喀什西南部，屬塔里木河水系(平均海拔3300 m，38°25′～39°00′N，74°40′～75°00′E)，由發源于西昆侖山及帕米爾高原的許多河流及山泉供水形成的微咸水湖泊和沼澤、灘地組成，面積20 km2[12]。作為我國最西部的高原湖泊群濕地，布倫口湖群濕地冬季受西伯利亞高壓影響強烈，寒冷漫長，平均氣溫-4.8 ℃，是低溫微生物的生存棲息地，也是分泌新型活性先導化合物，如酶、色素、多糖、抗凍蛋白等菌株的潛在種源地?！緮M解決的關鍵問題】本文自布倫口湖群濕地分離高產低溫蛋白酶細菌菌株，了解其生理特征并揭示菌株的系統發育關系，為深入探究極端酶的結構特性及在生物工程領域的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

1.1.1 主要試劑設備 細菌基因組DNA提取及膠回收試劑盒：北京康為世紀生物公司；PCR 擴增全套試劑及擴增引物：TaKaRa(大連)公司；相關生理生化試劑：天津市致遠化學試劑廠和天津登科化學試劑廠。

高速冷凍離心機5430R、PCR儀 Mastercycler pro S：德國 Eppendorf公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠；JY04S-3C凝膠成像系統：北京君意東方電泳設備有限公司。

1.1.2 培養基 蛋白酶篩選培養基：脫脂乳粉20 g/L、酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、瓊脂20 g/L，pH值7.2。種子培養基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、葡萄糖10 g/L、氯化鈉10 g/L，pH值7.2。發酵培養基：胰蛋白胨20 g /L、酵母提取物10 g/L、葡萄糖5 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 1g/L，KCl 0.5 g/L，pH值7.2。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集 采集布倫口湖群濕地不同積水狀態樣品，采集時環境溫度4 ℃。所得樣品混合置于含冰袋的保鮮盒內，12 h內運回實驗室處理備用。在超凈工作臺將樣品與蒸餾水按照1∶5比例混勻，置于搖床震蕩15 min，靜置20 min備用。

1.3.2 產酶菌株篩選 將樣品懸液適度稀釋，用移液槍吸取100 μl均勻涂布到蛋白酶篩選培養基上，15 ℃低溫倒置培養1～2 d，觀察平板上蛋白水解圈形成情況，并測量水解圈直徑D(mm)和菌落直徑d(mm)。選取D/d值較大菌株在選擇平板上不斷劃線純化，直至獲得純培養物，即為初篩到的產蛋白酶低溫菌株。將其保存到一定濃度的滅菌甘油保藏管中，-80 ℃凍存。

用接種針挑取一環純培養菌株至5 mL種子培養基試管中，經15 ℃，180 r /min搖床振蕩培養18 h即得種子液。按照3 %接種量將種子液接入150 mL發酵培養基，相同條件培養48 h。發酵液經12 000 r/min高速離心5 min，棄下層菌體沉淀，所得上清即為蛋白酶粗酶液。

1.3.3 低溫蛋白酶活力測定 采用Folin-酚顯色法測定粗酶活力[13]。酶活力單位定義: 在15 ℃和pH 7.0條件下，樣品每分鐘水解底物酪蛋白降解釋放出1 μg酪氨酸所需酶量為1個酶活單位(U)。

1.3.4 理化因素對菌株生長及產酶特性影響 ①最適生長溫度及耐鹽性測定。將培養好的菌懸液按3 %接種量接入5 mL種子培養基試管中，分別于不同溫度梯度(10、15、18、25、30、37 ℃)下200 r/min振蕩培養24 h，測定不同溫度下各菌株OD420nm值，確定其最適宜生長溫度。將各菌種分別接入不同NaCl含量 (1 %、4 %、6 %、8 %、10 %、12 %、14 %、16 % )的發酵培養基中，最適生長溫度下培養48 h后測OD420nm值。②菌株的生長曲線及其產酶特性。將產酶菌株種子液按3 %接入量接入裝有150 mL發酵培養基中，在各自最適生長溫度下180 r/min搖床振蕩培養，每隔12 h測定培養基中各菌株OD420nm光密度值及蛋白酶活力，確定菌株生長情況及產酶狀況，并繪制生長和產酶曲線。

1.3.5 產蛋白酶菌株的16S rRNA 基因序列與系統發育分析 用試劑盒提取產酶菌株的基因組DNA，以細菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 進行PCR 擴增。目的產物經上海生工的膠回收試劑盒純化完成測序。測序返回結果利用BLAST工具從GenBank 數據庫中進行序列同源性搜索，選取基因庫中相似度較高的16S rRNA基因序列，通過MEGA 6.0軟件分析產酶菌株遺傳關系并生成系統發育樹狀圖。

表1 產酶菌株的形態特征

圖1 6株菌株在脫脂乳鑒別培養基上的產酶水解圈Fig.1 Transparent circle of 6 cold protease-producing strains on skim milk plate

2 結果與分析

2.1 低溫蛋白酶菌株的篩選

以脫脂乳鑒別培養基為模型，從布倫口湖群不同濕地類型樣品中共分離到24 株疑似產蛋白酶的可培養菌株。將水解圈直徑D/菌落直徑d較大的純培養物劃線純化，進行搖瓶發酵培養，Folin-酚顯色法測定粗酶液酶活力，最終獲得6株分泌低溫蛋白酶性能良好的細菌菌株。

圖1為產低溫蛋白酶功能菌株在脫脂乳鑒別培養基上產生的相應水解圈。革蘭氏染色結果表明，6株產酶菌株中4株為陰性，其余2株為陽性，具體表型特征見表1。

圖2 產低溫蛋白酶菌株生長溫度的測定Fig.2 Determination of growth temperature of cold-protease producing strains

2.2 產酶菌株的生長及產酶特性

2.2.1 產酶菌株的最適生長溫度及耐鹽性測定 由圖2可知，產酶菌株的最佳生長溫度在18～25 ℃左右，生長溫度介于4～37 ℃，屬耐冷菌。耐鹽性研究中，6株產酶菌株耐鹽性一般，最高不超過6 %。菌株5-1在6 % 高鹽度下雖可以生長，但生長極為緩慢。1-3耐鹽性最差，鹽濃度高于4 %即停止生長。

2.2.2 產酶菌株生長曲線及產酶特性 將產酶菌株接入液體培養基進行發酵，每間隔12 h取樣測定其光密度和發酵上清液粗酶活力。由圖3可知，6株低溫菌均有明顯的延滯期，培養24～36 h后進入對數期。1-4、4-1、5-1生長速度較快，發酵48 h后即到達生長穩定期，其余3株菌則在培養60 h后進入平穩期。

圖4表明，菌株的產酶速度各異，3-1和5-1初始產酶速度較快，但1-3、5-1在發酵60 h后即先到達酶活最高點，其它菌株則在72 h后達到酶活高峰。之后隨著培養時間延長，所有菌株酶活力開始減低。綜合圖3～4可知，6株菌的產酶能力與生長具有一定偶聯性，隨菌體密度增大，產酶活力也在明顯上升，至平穩期達到酶活高峰，說明其在生長平穩期酶催化能力最強，酶活力最高。

圖3 低溫蛋白酶菌株的生長曲線Fig.3 Growth curve of cold-protease producing strains

圖4 低溫蛋白酶菌株的產酶特性Fig.4 Enzymatic activity of cold-lipase producing strains

2.3 產蛋白酶菌株的16S rRNA 基因序列與系統發育分析

以6株產低溫蛋白酶菌株的基因組為模板進行 PCR擴增，獲得16S rDNA片段約1500 bp，PCR產物經試劑盒純化后，交由上海生工完成測序工作。測序結果提交至美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)，用BLAST在GenBank數據庫中進行同源序列搜索比對，并構建低溫蛋白酶產生菌的系統發育樹。由圖5可知，1-3、1-6、3-1、9-2屬于假單胞菌(Pseudomonassp.)，4-1屬于節桿菌(Arthrobactersp.)，5-1屬于芽孢桿菌(Bacillussp.) 。

3 討 論

低溫蛋白酶在食品加工保鮮、洗滌紡織、植物保護、生物環境修復等領域具有重要應用發展潛力。雖然生物圈超過80 %部分為永久性低溫地區，為極端微生物資源的發掘提供了豐富源泉，但目前極端酶生物工程技術的開發并不成熟，低溫蛋白酶資源開發廣度及低溫酶結構特征、作用機制、基因工程改造等尚需進一步探索研究。

本實驗通過對布倫口湖泊濕地可培養產酶細菌的分離和篩選，了解高原湖泊濕地產低溫蛋白酶細菌的生長特征、產酶性能及遺傳多樣性。研究分離到的6株產酶功能菌株的最適生長溫度不超過25 ℃，符合低溫微生物的生理特性，屬于耐冷菌范疇。菌株的生長范圍介于4～37 ℃，在常溫和低溫下均能正常生存生長，推測可能是常溫菌長期適應低溫條件自然選擇的結果。目前國內針對分泌低溫蛋白酶菌株的分子鑒定、系統發育及酶學性質基礎研究尚不多，分離到的產酶菌株多隸屬于以下菌屬：Pseudomonas、Pseudoalteromona、Shewanella、Colwellia、Sphingobacterium、Flavobacterium及Arthrobacter屬等。本研究從布倫口湖群濕地分離的6株產低溫蛋白耐冷菌，能在15 ℃條件下發酵分泌低溫蛋白酶，耐鹽性一般。結合形態學及16S rDNA序列同源性分析，鑒定其中四株菌屬于假單胞菌(Pseudomonassp.)，與倪永清[14]、易浪波[15]、高云航[16]等結果一致。而假單胞菌是低溫生境中的優勢菌群，廣泛存在于極地、冰川雪山、常年凍土、深海等常年酷寒環境中[17-20]，是目前微生物中較豐富的酶庫，表現出較強的降解能力。另外兩株菌分屬于節桿菌屬(Arthrobactersp.)和芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，在四川若爾蓋高原[21]、西藏尼瑪縣甲熱布錯湖[22]、渤海和黃海[23]地區同樣分離到。

本研究自東帕米爾高原湖泊群濕地中分離到的6株產酶菌株，其16S rDNA序列與已知分類地位的同屬模式菌株相似度在98 %以上，因此最多只能區分到屬(genus)，不能到種[24]。此外，盡管分離到的4株假單胞菌株的16S rRNA 基因序列同源性在98 %～99 %左右，但菌落形態、大小等表型特征及生長、產酶性能存在差異，說明目前主要依據的可培養菌株16S rRNA基因序列差異并不能準確反映產低溫酶功能微生物的遺傳多樣性。在后續實驗或可嘗試采用重復序列rep-PCR指紋分析技術，結合菌株的生理學代謝譜、產酶性狀譜等將同源性較高的Pseudomonas菌株劃分到不同的亞群，進而對應于同屬不同的種或者種組[25-26]，以更加全面地揭示極端環境中產酶菌株遺傳多樣性與種群進化關系，挖掘出優質高效、具有新特性的高產低溫蛋白酶新菌種，為低溫酶制劑的研究應用奠定更堅實的理論基礎。

圖5 基于16S rDNA序列產酶菌株的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of cold-adapted bacteria producing protease based on 16S rDNA sequence

4 結 論

從新疆東帕米爾高原布倫口湖群濕地共篩選到6株高產低溫蛋白酶菌株，其在15 ℃條件下均能生長繁殖，但耐鹽能力一般，在生長穩定期達到產酶高峰。16S rRNA 基因序列初步確定4株為假單胞菌 (Pseudomonassp.) ，另2株分屬于芽孢桿菌(Bacillussp. ) 和節桿菌(Arthrobactersp.)。

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(責任編輯 陳 虹 )

Isolation and Identification of Cold-adapted Bacteria Producing Protease from Bulunkou-lake Group Wetlands

WANG Ji-lian, LI Ming-yuan, REN Yu

(College of Biology and Geographic Sciences, Kashgar University, Key Laboratory of Ecology and Biological Resources in Yarkand Oasis of Education of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Xinjiang Kashgar 844006, China)

【Objective】The bacterial strains producing cold-adapted protease from the Bulunkou-lake group wetlands, East Pamirs were isolated and identified, which would provided a useful basis for further study of cold-adapted protease．【Method】The bacterial strains by the screening media containing skim milk were isolated. The phenotypic characteristics, the optimum growth temperature, salt resistance, growth characteristic and enzyme properties of the strains were studied, and their taxonomic identity and genetic variability by the 16S rRNA gene sequences were determined. 【Result】6 high-yield protease-producing strains growing at 15 ℃ were obtained and belonged to psychrotrophs. The 6 strains had low salt-resistance but could be fermented under relative low temperature, which could reach the peak production of enzyme in the stable phase. Primary identification showed that 4 strains belonged to the genusPseudomonas, the other two belonged to the genusBacillusandArthrobacter. 【Conclusion】Although many closely related populations were isolated, they had different physiological characteristics, which would expand the existing resource database of cold-adapted strains producing protease and provide a basis for the further study of structure characteristics of cold-active protease and application in the field of biological engineering.

Bulunkou-lake group wetlands; Cold-adapted protease; Psychrotrophs; 16S rRNA

1001-4829(2017)6-1330-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.016

2016-07-12

新疆維吾爾自治區高校科研計劃項目(XJEDU2016 S072)；新疆維吾爾自治區自然科學基金(2016D01B011)

王繼蓮(1986-)，女，山東鄆城人，講師，研究方向：低溫微生物學，E-mail:wjilian0710@sina.com。

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