超高效液相法(UPLC)用于黑果枸杞指紋圖譜的研究

林 麗，石亞娜，高素芳，晉 玲,3*，王振恒,3，趙 帆

(1. 甘肅中醫學院藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.云南省農業科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650205；3.中(藏)藥資源研究所，甘肅 蘭州 730000)

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超高效液相法(UPLC)用于黑果枸杞指紋圖譜的研究

林 麗1，石亞娜2，高素芳1，晉 玲1,3*，王振恒1,3，趙 帆1

(1. 甘肅中醫學院藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.云南省農業科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650205；3.中(藏)藥資源研究所，甘肅 蘭州 730000)

【目的】 建立黑果枸杞UPLC指紋圖譜分析技術，為快速鑒別黑果枸杞提供依據。【方法】采用超高效液相色譜法進行測定。【結果】以ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm )；流動相為甲醇(A)、0.5 %三氟乙酸、1 %甲酸水溶液(B)、乙腈(C)，以0.3 mL/min流速進行梯度洗脫，檢測波長300 nm，進樣量1.000 μl，柱溫35 ℃ 為色譜條件，建立了黑果枸杞的UPLC特征指紋圖譜共有模式，標定了13個共有峰，14批次黑果枸杞的相似度為 0.809～0.989，不同省份差異較大。【結論】該方法快速、高效，穩定可靠，為黑果枸杞的鑒別和質量評價及質量控制提供了科學依據。

UPLC；黑果枸杞；指紋圖譜

黑果枸杞為茄科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.)黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr)的干燥成熟果實。【研究意義】黑果枸杞味甘，性平，富含蛋白質、枸杞多糖、氨基酸、維生素、礦物質、微量元素等多種營養成分[1-3]。具有良好的醫療保健功能，《四部醫典》、《晶珠本草》等經典藏藥著作中記載用于治療心熱病、心臟病、月經不調、停經等病癥[4]；《維吾爾藥志》記載黑果枸杞果實及根皮治療尿道結石、月經不調、癬疥、齒齦出血等病癥，民間用作滋補強壯、明目及降壓藥[5]。廣泛分布于中國西北地區的寧夏、青海、甘肅、新疆和西藏，在中亞、歐洲高加索亦有分布[6-7]。【前人研究進展】近年來，為了保護黑果枸杞野生資源，開展了對其人工栽培技術的研究，并初步獲得成功[8]。目前，中國部分地區已經開始栽培。隨著對黑果枸杞藥用價值的深入研究對產地區分有一定意義，而采用 UPLC 建立黑果枸杞指紋圖譜分析方法未見報道。【本研究切入點】超高效液相色譜(UPLC)是以 1.8 μl的超細色譜柱填料為核心技術的新型色譜分離分析技術，相對于常規 HPLC 而言，UPLC 有更好的分析效果及靈敏度[9-11]。鑒于植物藥具有復雜的化學成分，色譜指紋圖譜方法是評價植物藥質量的有效方法之一[12-13]。【擬解決的關鍵問題】本研究以不同產地14批次黑果枸杞藥材為研究對象，采用UPLC法建立黑果枸杞的特征指紋圖譜，以期為今后黑果枸杞的開發利用提供依據。

表1 黑果枸杞來源信息

1 材料與方法

1.1 材料

不同產地黑果枸杞來源(表1)，經甘肅中醫藥大學藥學院晉玲教授鑒定為茄科枸杞屬黑果枸杞Lyciumruthenicum的干燥成熟果實。

1.2 儀器

Thermo Fisher ultimate 3000 RSLC超高效液相色譜儀(包括XRS自動進樣器、RS柱溫箱、DAD二極陣列檢測器、Chromeleon 7.2色譜工作站，XRS高壓四元梯度泵)(美國賽默飛世爾科技公司)；Al104萬分之一電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；OHAUS corporation DV SERIES 十萬分之一電子分析天平(奧豪斯儀器有限公司)；DHG-9123A電熱鼓風恒溫干燥箱(上海齊欣科學儀器有限公司)；KQ-250TDB型高頻數控超聲波清洗器(昆侖山超聲儀器有限公司)； 800 型離心沉淀機(10 000 r/min)購自上海手術器十廠； DGG-9620A 電熱恒溫鼓風干燥箱(上海齊欣科普儀器有限公司)。

1.3 試劑

色譜純甲酸、三氟乙酸( TFA )購自 TEDIA 公司；色譜純甲醇購自賽默飛世爾科技有限公司；色譜純乙腈購自 GARDENA 公司；0.22 μm 有機系濾膜；水為屈臣氏蒸餾水，0.22 μm 水系濾膜；分析純無水乙醇。

1.4 方法

1.4.1 供試品制備 精密稱取1.000 g 黑果枸杞粉末，3份，置于具塞三角瓶中，加入 50 % 乙醇 20 mL(1∶20)，在功率400 w下，超聲提取15 min，在10 000 r/min下離心10 min，取上清液待用。

1.4.2 指紋圖譜條件 色譜柱為 Acquity UPLC BEH C18 色譜柱(50 mm × 2.1 mm，1.7 μm)；甲醇(A)，0.5 % 三氟乙酸、1 %甲酸水溶液(B)，乙腈(C)為流動相，體積流量0.3 mL/min，柱溫 35 ℃，進樣量 1 μl ，波長測定 300 nm。

1.5 方法學考察

1.5.1 精密度試驗 取同一批次供試品(批號)，在“1.4.1”項提取供試品溶液，在“1.4.2”項條件下連續進樣5 次，記錄色譜圖，并計算共有峰相對保留時間和相對峰面積。計算結果顯示，各共有峰的相對保留時間的RSD在0.318 %～1.795 %(RSD≤3.00 %)，見表3；相對峰面積的RSD在 0.197 %～2.993 %(RSD≤3.00 %)，見表4，結果表明儀器的精密度良好。

表2 指紋圖譜流動相線性梯度

表3 精密度試驗保留時間的RSD 值

表4 精密度試驗峰面積的 RSD 值

表5 重復性試驗保留時間的 RSD 值

表6 重復性試驗峰面積的 RSD 值

1.5.2 重復性試驗 取同一批樣品5份，按“1.4.1”項下提取供試品溶液，按“1.4.2”項下的方法分別進樣，記錄色譜圖，并計算共有峰相對保留時間和相對峰面積。計算結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD在0.318 %～2.674 %(RSD≤3.00 %)，見表5；相對峰面積的RSD0.184 %～2.973 %(RSD≤3.00 %)，見表6，結果表明該方法的良好。

1.5.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，按 “1.4.1、1.4.2”項下的方法分別在0，2，4，8，12，24 h進樣測定，記錄色譜圖，并計算共有峰相對保留時間和相對峰面積。計算結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD0.345 %～2.54 %(RSD≤3.00 %)，見表7；相對峰面積的RSD0.361 %～2.759 % (RSD≤3.00 %)，見表8，表明樣品溶液在24 h內穩定。

表7 穩定性試驗保留時間的 RSD 值

表8 穩定性試驗峰面積的 RSD 值

2 結果與分析

2.1 供試品測定

在上述同一條件下，連續測定14批次黑果枸杞供試品的 UPLC 指紋圖譜。

2.2 指紋圖譜

根據以上 14 批供試品測定結果所給出的峰數、峰值(積分數)和峰位(相對保留時間)等相關參數，除去前 1 min 的溶劑峰，進行分析、比較、制定優化的指紋圖譜見圖1 。

圖1 黑果枸杞UPLC特征圖譜(300 nm)Fig.1 UPLC fingerprint chromatogram of Lycium ruthenicum(300 nm)

2.3 指紋圖譜建立與相似度評價

將所得的 14 批次黑果枸杞 UPLC 圖譜依次導入國家藥典委員會研制的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件》(2004版A)，以 S1 批藥材譜圖作為參照譜進行指紋匹配，確定了13 個共有峰，建立了黑果枸杞特征指紋圖譜的共有模式，并進行了相似度計算，14 批次藥材的疊加指紋圖譜，見圖2，13 個指紋峰相對保留時間如表9所示，共有指紋峰相對峰面積如表10所示，黑果枸杞與對照指紋圖譜的相似度見表11。

圖2 14批黑果枸杞UPLC指紋圖譜疊加圖(300 nm)Fig.2 UPLC fingerprints for 14 batches of Lycium ruthenicum(300 nm)

編號No.共有峰相對保留時間(min)Retentiontimeofgeneralpeaks12345678910111213S11.6191.9853.5854.1234.3104.7144.7345.1455.4035.6786.1316.5286.913S21.6301.9113.5914.1544.4094.6544.7365.2985.4395.5926.0676.5786.923S31.6292.0063.5674.0094.3814.7014.7235.2555.5085.6555.9826.4896.874S41.6341.9833.6004.1904.3984.6934.7525.1605.4795.6396.0106.4576.976S51.6111.9873.5784.1984.3764.7214.7475.2105.5115.6476.0216.5096.896S61.6451.9143.6124.1074.4114.6784.7055.1965.4575.6486.1136.5526.881S71.6521.9583.3854.2634.3104.6224.7145.1475.4115.6976.1366.5196.929S81.6231.9633.4904.0734.3334.5304.7215.2075.4105.6206.0516.5126.947S91.6092.0343.5714.1554.3624.6634.7455.1755.4945.6766.1456.5766.855S101.6411.9513.5874.1364.4254.6474.6995.1505.4255.6546.1716.4946.921S111.6311.9653.6134.1954.3944.6954.7555.1635.4775.6366.1016.4776.955S121.6141.9733.5744.1924.3774.7224.7495.2155.5135.6416.1146.5166.893S131.6231.9163.6224.1094.4124.6734.7155.1945.4565.6446.1036.5346.887S141.6431.9783.3894.2674.3184.6274.7195.1435.4175.6916.1276.5376.931RSD(%)0.8121.7862.1841.6900.9151.0940.3870.8750.7380.4930.9220.5340.490

表10 黑果枸杞UPLC指紋圖譜共有峰峰面積

表11 不同產地黑果枸杞相似度比較

由表9、10可知，各產地黑果枸杞中共有峰的保留時間非常相近，RSD在 0.387 %～2.184 %，這也再次證實了各共有峰選擇的準確性，但是峰面積相差較大，則說明共有峰所代表成分含量差別較大。由表11可看出，除S9、S10、S11、S12、S13、S14這6 批次樣品的相似度較低(<0.900)外，其他產地的黑果枸杞相似度較好。

3 討 論

3.1 供試品溶液制備條件的考察

試驗比較了不同提取溶劑如甲醇、乙醇的超聲提取、浸提等不同提取方法的提取效果，結果以乙醇超聲提取的總體效果為佳。同時還考察了以乙醇為提取溶劑不同濃度、提取時間和功率的提取效果。結果表明以50 %乙醇為提取溶劑，功率400 w下，超聲提取15 min，提取較完全，操作方法簡便，且方法穩定，重現性好。采用乙醇超聲提取樣品，圖譜信息量較大，符合指紋圖譜整體性的要求，其盡可能反應了藥材所含的全部信息，可以作為綜合質量評價的方法。

3.2 色譜條件的選擇及優化

在流動相系統的選擇中，分別以乙腈-水，乙腈-1 %甲酸水，甲醇-水，甲醇-0.1 %磷酸水，甲醇-0.5 % 三氟乙酸等不同體積分數、不同比例的流動相進行了等度和梯度洗脫實驗。結果表明用甲醇-0.1 %磷酸水，甲醇-0.5 %三氟乙酸洗脫更佳，色譜峰檢測比較全面，分離度好，峰面積較大，調整流動相不同時間洗脫比例之后，各峰的保留時間適中，且基線平穩，不宜漂移，同時提高了色譜圖的分離度，有效避免了色譜圖的拖尾現象，有利于指紋圖譜的分析。

3.3 檢測波長的選擇

對270、280、300、320和530 nm 5個波長進樣掃描，色譜圖進行比較分析，結果300 nm處檢測的色譜圖基線平穩、信息量多、各色譜分離效果好、峰面積大，因此，選 300 nm 作為檢測波長。

3.4 分析時間的選擇

在選擇指紋圖譜的洗脫時間時記錄了20 min的色譜行為圖。結果表明8 min以后基本沒有色譜峰的出現，同時為了照顧樣品的產地、采收時間等的差異性，保證所有樣品的特征峰都能被檢出，因此選擇 10 min 作為分析時間。

4 結 論

本論文中所研究的黑果枸杞UPLC指紋圖譜具有較好的穩定性和重復性，14批樣品指紋圖譜特征性和專屬性很強，其主要峰群的整體圖貌基本一致，13 個共有峰穩定性很好。相似度評價分析得 14 批次黑果枸杞藥材的相似度，8 個甘肅不同產地的黑果枸杞的相似度均在 0.900以上，表現出較高的相似度，青海的4 個樣品相似度較低(0.867～0.875)，新疆的2 個樣品相似度最低 (0.809～0.811)。綜上可得出相同條件不同省份的黑果枸杞相似度較低，具有明顯差異，故可用此方法快速、簡便的鑒別不同產地的黑果枸杞。

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(責任編輯 王家銀)

Analysis of Ultra Performance Liquid (UPLC)for Black Fruit Wolfberry Fingerprints

LIN Li1, SHI Ya-na2, GAO Su-fang1, JIN Ling1,3*, WANG Zhen-heng1,3, ZHAO Fan1

(1.Gansu University of Chinese Medicine, Gansu Lanzhou 730000, China; 2.Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650205, China; 3.(Tibet) Traditional Medicine Resources Institute, Gansu Lanzhou 730000, China)

【Objective】The purpose of this paper is to provide a rapid identification method forLyciumruthenicumMurr based on the establishment of UPLC fingerprint. 【Method】Experiments were performed by UPLC method. 【Result】 Using ACQUITY UPLC BEH C18 column (2.1 mm×50 mm, 1.7 μm), methanol(A), 0.5 % trichloroacetic, 1 % formic acid(B) and acetonitrile(C) as the mobile phase, the detection wavelength 300 nm, column temperature 35 ℃, the flow rate 0.3 mL/min, the injection volume 1.000 μl, the mutual mode of UPLC fingerprint ofLyciumruthenicumMurr was established. There were 13 common peaks in the fingerprint of 14 samples. The similarity of the 14 samples was ranged from 0.809 to 0.989 and it indicated that the UPLC fingerprints of the samples from different provinces were obviously different. 【Conclusion】The UPLC method has good precision, stability and repeatability. The fingerprint established in this study can supply scientific method for the identification, quality evaluation and control ofLyciumruthenicumMurr.

UPLC;LyciumruthenicumMurr; Fingerprint

1001-4829(2017)6-1426-08

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.032

2016-06-16

國家中醫藥管理局中醫藥行業專項“甘肅省代表性區域中藥資源保護利用”(2012070025-02)；甘肅省中醫藥管理局項目“黑河流域黑果枸杞的資源調查及質量評價”GZK-2012-21；甘肅省科技計劃基礎研究創新群體“甘肅省中藏藥資源評價、保護與開發利用”(1606RJIA323)；中央財政引導地方科技創新平臺項目“甘肅省中藥資源與新產品開發平臺建設”(2016-A-02)

林 麗(1965-)，女，高級工程師，學士，研究方向為中藥鑒定及中藥資源可持續利用，E-mail:xrhlin@sina.com，*為通訊作者：晉 玲，(0931)8722303，E-mail :zyxyj@163.com。

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