藥用植物研究中的分子標記技術應用進展

陳紅波++余金芮++楊春先++錢剛

摘要：通過對近年來常用分子標記技術的原理、技術特點及其在藥用植物研究領域中應用現狀的總結，以期為藥用植物資源開發與評價提供參考，也進一步為藥用植物功能基因的篩選和驗證提供思路。

關鍵詞：分子標記；藥用植物；簡單序列重復（SSR）；擴增片段長度多態性（AFLP）；單核苷酸多態性分析技術（SNPs）

中圖分類號：S567 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）13-2401-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.001

Progress and Application of Molecular Marker Technology in Medicinal Plants

CHEN Hong-boa， YU Jin-ruib， YANG Chun-xianb， QIAN Ganga

（a.Department of Cell Biology and Genetics； b.School of Dentistry， Zunyi Medical College， Zunyi 563003， Guizhou， China）

Abstract： By summarizing the principle and technical characteristics of the commonly used molecular marker technology in recent years and its application in the field of medicinal plant research，this paper provides a reference for the development and evaluation of medicinal plant resources， and further provides ideas for the screening and verification of functional gene of medicinal plants.

Key words： molecular marker； medicinal plants； simple sequence repeat（SSR）； amplified fragment length polymorphisms（AFLP）； single nucleotide polymorphisms（SNPs）

中國是野生中藥材資源最為豐富的國家，目前已識別有11 000多種，無論其種類或數量均列世界之首[1]，為中國中藥文化產業的國際化創造了豐富的資源條件。但近年來，隨著人們對養生、保健等意識的不斷提高，導致中藥材的市場需求極度擴增，一些以野生種質消耗為主的名貴中藥材正面臨瀕危甚至滅絕。傳統的研究利用方法在藥用植物識別、開發、利用以及保護等方面都相對落后。然而近些年，以RFLP[2]為代表的DNA分子標記技術的興起，為實現當代藥用植物研究的現代化提供了現實手段與條件。分子標記技術（亦或分子鑒別技術或DNA分子標記技術）[3，4]，是一種基于遺傳物質的研究方式，這使其具備了不受生長環境的影響、檢驗精度高及重現性好等優點。隨著DNA分子標記技術的不斷運用與革新，以分子雜交為基礎的第一代標記技術，由于操作過程復雜、周期長等原因，正逐漸退出分子研究領域。而圍繞PCR技術為核心的新型分子標記技術正廣為使用，并日臻成熟。

1 常用分子標記技術的原理及特點

1.1 簡單序列重復（Simple sequence repeat，SSR）

SSR亦稱為微衛星DNA，它由2-5個堿基組成，如（GA）n、（TG）n、（GAC）n等，其中最常見為二核苷酸重復形式。SSR序列的長度在不同基因組間由于重復次數以及程度的不同具有高度的變異性，而展現出較高的多態性。SSR標記原理是根據其兩端的保守序列設計特異性引物，經過PCR擴增后，再利用變性或者非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產物進行分離，繼而體現不同樣本基因組DNA的多態性。

簡單重復序列具有較多優點，其共顯性可區分純合型與雜合型，以及還有靈敏度高、穩定性好以及操作簡便等優點。但目前SSR獲得的方式參差不齊，前提都是要提前知道目的基因的序列信息。

1.1.1 簡單重復區間序列（Inter-simple sequence repeat，ISSR） ISSR是Zietkiewicz等[5]于1994年發展起來的一種加錨SSR技術。它的原理是在SSR引物的5′或3′端錨定2個或以上的SSR堿基，引起特定位點退火，從而提高擴增專一性，得到的特異性片段再通過變性或非變性聚丙烯酰胺凝膠進行分離，最后根據不同的多態性條帶分析多態性。

其優點在于無需提前知道樣品基因序列，ISSR可為研究者快速高效地提供基因組信息；引物序列相對較長，通過提高退火溫度進而保證了結果的可靠性；樣本DNA質量要求不高，且所需量少；引物的通用性廣，不具種屬特異性。但在實際應用中也存在一定缺陷，如：穩定的實驗體系條件需要探索構建，且顯性標記亦不能區分純合型和雜合型。

1.1.2 表達序列標簽（Expressed sequence tags，ESTs） 表達序列標簽是基于EST數據庫或cDNA文庫的一種標記技術，是一種能快速、高效地揭示基因容量的標記方法，由1989年Venter首次提出。它能特異地展示出基因某一位點的表達情況，能夠直接反映出功能基因的生物信息[6]，同時也為地道藥用植物的鑒別、開發利用提供了新的候選基因。因此，基于ESTs開發的SSR技術（即EST-SSR）是一種穩定、可靠的分子標記技術[7]，可直接用于基因作圖[8]，從而指導功能基因的預測。

EST-SSR與傳統SSR技術相比較，無需構建DNA文庫而節約了實驗成本。而且，在功能基因研究方面，EST-SSR更接近功能基因組；表達序列標簽直接來源于編碼序列，從而為基因組比較學以及同源基因的研究提供更可靠的途徑。但也有不足之處：與SSR相比，多態性較低；同時，ESTs只代表了基因組DNA的一部分，所包含的信息不夠全面，且現行的一些序列拼接軟件也存在一定的局限性，分析過程中也可能丟失一些重要的基因組信息。

1.2 擴增片段長度多態性（Amplified fragment length polymorphisms，AFLP）

AFLP是1992年荷蘭科學家Zabeau和Vos發明的一項新專利[9]。其原理是植物基因組DNA經過限制性內切酶酶切后（通常采用雙酶切），與特定的接頭相結合而得到帶有特定接頭的特異性片段，這些片段再與PCR引物的3′端識別后進行特異性擴增，最后再將擴增產物通過聚丙烯酰氨凝膠電泳篩選，進而分析其多態性。

AFLP是RFLP技術與PCR技術的結合，其具備了高多態性、操作簡易、可以同時處理大量樣品等優點。近年來，AFLP已廣泛應用于藥用植物遺傳圖譜的繪制、物種遺傳多樣性分析及分類研究、輔助育種、功能基因定位等多方向的研究[10，11]，且AFLP目前已被公認為構建DNA指紋圖譜最可靠的分子標記。其缺點主要是對樣品DNA的質量要求較高，實驗成本也較昂貴，擴增所得結果的分析也相對困難。

1.3 DNA條形碼技術

2003年Guelph大學的Hebert等首次提出DNA條形碼的概念。它是以足夠變異且相對較短的DNA序列為標準，建立的一種新的生物身份鑒別系統，從而實現對物種快速、精準地識別和鑒定，其類似于超市使用條形碼鑒別不同商品。通過特異DNA的比對，對于新種和隱種的發現也具有現實性的幫助[12]。Lahaye等[13]通過單獨使用matK基因對1 000多種蘭科植物進行系統分析，結果證明單獨使用matK基因能夠發現蘭科隱種并證明了DNA條形碼分析的可行性；Newmaster等[14]運用DNA條形碼技術發現了感應草屬的3個隱種以及草沙蠶屬的1個新種。在2008年召開的植物無國界會議上提出了“超級條形碼”技術[15]，決定將葉綠體全基因組序列作為條形碼序列應用在植物物種的鑒別上。Shinozaki等[16]第一次完成了單一物種葉綠體全基因組的測序；2008年Diekmann等[17]又提出了一套較為標準的葉綠體DNA提取方法。Parks等[18]通過對松屬37個樣本進行葉綠體全基因組測序分析，驗證了葉綠體基因組可以作為植物物種水平上的條形碼。近年來，DNA條形碼技術在藥用植物研究中的報道也逐漸增多，對于加快中國生物進化研究的步伐具有重要意義[19，20]。

1.4 基因芯片技術

基因芯片又稱DNA芯片或寡核苷酸陣列，它是將大量已知的探針固定在支持物上[21，22]，通過核酸雜交，再利用激光掃描及分析，來實現對目的基因表達水平或多態性的分析。其高通量、自動化的優勢使其廣泛用于基因的定位、藥物的靶向分析及新藥研發中。Schena于1995年第一次在論文中發表了DNA chip相關研究，Fodor又于第二年年底研制出了第一塊DNA芯片[23]。

基因芯片技術目前主要應用于一些新藥的研發[24，25]、藥物靶向研究以及疾病的診斷等方面。Watanabe等[26]采用高密度基因芯片技術，對經 Egb761處理的小鼠的皮層和海馬細胞的基因表達進行了研究，分析得出其具有拮抗神經病變的藥理作用。李美德[27]應用全基因組表達芯片來檢測從黃芩根中分離出的漢黃芩素作用于肝癌細胞后的基因表達情況，結果發現406個差異明顯的表達基因，通過差異基因的篩選和分析，從而確定了漢黃芩素抗肝癌的分子機制，對藥物靶向基因的確定，以及抗癌藥物的開發提供了新的依據。郭旭東[28]通過基因芯片技術對急性心肌梗死（AMI）患者和健康者外周血的RNA進行差異分析，發現其中的差異基因CYP4F3和USP25可能為AMI診斷的基因標記。張玉金等[29]通過利用從中國2010年版藥典中篩選出的基原植物以及從NCBI數據庫中下載的相應序列進行分析，得到13 814條特異性探針，為中國藥典中基原植物檢測芯片的建立做出了重要貢獻。近年來，不同領域的實用芯片陸續都有報道，且基因芯片技術目前已是高通量藥物篩選的主要途徑，同時也是中藥活性成分篩選的重要手段。

1.5 單核苷酸多態性分析技術（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）

SNPs是等位基因之間的單個核苷酸差異，如單個核苷酸的缺失、插入或者是突變等[30]。SNPs標記技術相比微衛星技術而言，SNPs描述的是一種雙等位基因的多態性，而SSR則是多位點等位基因之間的多態性，故SNPs在數量上遠遠超過SSR，因此具有更高的多態性。在人的基因組中，大概1 000 bp就會出現一個SNP，因此可以其作為DNA的一種特異性標記[31]。Xu等[32]通過對水稻親本9 311的SNP檢測，得到了768萬個多態位點，從而繪制了1張高密度的Bin圖譜并成功定位了1個QTL。目前，由于SNP技術主要依靠于基因組DNA的大量測序或者是基因芯片技術，且技術要求高以及實驗成本大等原因，導致在藥用植物方面的研究也相對匱乏。

2 DNA分子標記技術在藥用植物中的研究應用

2.1 中藥材種質資源的鑒定、評價及道地性研究

種質資源是指親本遺傳給子代的遺傳物質，其包括“道地性”種質資源、新種及重要培育品系等。徐蕾等[33]通過運用SSR標記技術在鐵皮石斛種群遺傳多樣性的研究，證實了鐵皮石斛具有較高的遺傳多態性，并順利將36份鐵皮石斛材料分成了3個類別。Shen等[34]利用篩選出的ISSR引物準確地鑒別出了8個野生種石斛藥品。李永清等[35]利用ISSR技術成功將36份鐵皮石斛材料劃分為6個類群。趙香妍等[36]通過ISSR標記技術在北京地區野生柴胡種質資源中的研究，得出北京地區野生柴胡具有一定的地域性分布特征，應加以保護及推廣種植。

2.2 中藥材真偽的鑒別及品種鑒定

隨著中藥材市場需求的不斷擴大，中藥材市場魚目混珠的情況時有發生，同類藥材由于道地性等導致藥效也相差甚遠，而常規的檢測方式卻很難區別。但現行的DNA分子鑒別技術基于高穩定性、不受環境因素及個體發育影響等優點，可以保證鑒定結果的準確性。馬曉沖等[37]通過研究證明基于SNP的分子標記技術能夠穩定地鑒別中藥材澤瀉。滕艷芬等[38]利用matK基因已成功將正品與混淆產品鑒別開來。

2.3 遺傳多樣性及種屬親緣關系的研究

藥用植物遺傳多樣性及親緣關系的研究，對于認識物種的進化歷程、遺傳育種及物種改良等均具有重要意義。傳統的研究方法均是基于對表達產物的研究探索，但藥用植物的化學成分及其含量、外部形態等均會由于生長環境及其他因素影響而有所差別。因此，從傳統研究的角度探索藥用植物的遺傳多樣性就存在很大的局限性，而從分子角度出發的分子標記技術能有效地揭示物種進化演變過程中遺傳物質流動的真實本質，從而使得分子標記技術能夠闡明物種進化、遺傳背景以及種內或種間遺傳關系，為中國珍貴及瀕危中藥材的開發、利用和資源保護提供真實依據。

近年來，隨著分子標記技術的不斷應用與發展，已有多種DNA標記技術成功運用于中藥材遺傳多樣性研究及親緣性分析中。YANG等[39]運用SSR分子標記技術對吉林省5個不同產地的人參材料進行分析，得出不同產地的人參在遺傳物質上呈現出較高的多態性。Li等[40]于2013年利用SSR標記法對洋玉蘭葉綠體全基因組進行近緣物種比對分析，結果顯示洋玉蘭葉綠體基因組的重復序列保守性相對較高。2014年，Galina等[41]又運用SSR標記技術對俄羅斯瀕臨滅絕的人參進行了種群遺傳性狀的分析。朱田田等[42]利用ISSR對甘肅不同產地中麻黃的遺傳關系進行了分析，得出中麻黃遺傳距離跟地理距離有一定的關系。黃穎楨等[43]通過使用ISS標記技術對金線蓮遺傳多樣性進行分析，得出在野生種質資源間金線蓮具有豐富的遺傳多樣性。葉煒等[44]通過利用ISSR對金線蘭及其近緣物種的遺傳多樣性進行研究，得出種群間可能存在基因的交流。唐曉清等[45]利用AFLP技術對不同農家栽培類型的丹參進行分析，結果表明AFLP技術可以作為識別丹參不同栽培類型間遺傳差異的手段。李勇等[46]利用AFLP技術通過對金蓮花遺傳多樣性的研究，得出地理位置較近的種質遺傳相似度較高。唐美瓊等[47]利用AFLP技術對廣西草珊瑚遺傳性狀進行研究分析，結果顯示廣西草珊瑚遺傳多樣性偏低，須盡快采取相應措施。沈亮等[48]通過AFLP技術分析梭梭遺傳多態性得知該物種種內豐度較高，各地區之間的分化較小。李永清等[49]通過ISSR在37份藥用石斛親緣關系研究中的應用，得出ISSR分子標記技術完全可以應用于石斛物種親緣關系的分析。朱田田等[50]通過對不同黃芪和黨參栽培品種遺傳關系的ISSR分析，得出不同品種的黃芪和黨參擁有較高的遺傳多樣性，而且種間差異較大。蔣雨晗等[51]利用ISSR分子技術對14份不同來源的白芍進行研究分析，證明了4個栽培種跟野生種之間有一定的遺傳差異性，而且可以從基因水平把外型相似的白芍栽培品種區別開來。

2.4 DNA遺傳圖譜的構建及數量控制基因定位

DNA遺傳圖譜也稱基因遺傳圖譜或連鎖圖譜，系指基因在染色體上相對應的位置。自從第一張遺傳圖譜的構建以來，越來越多關于藥用植物DNA圖譜的構建也相繼報道。周志勇等[52]首次用AFLP技術構建了人參和西洋參的DNA指紋圖譜，這對人參的鑒別提供了非常有效的工具。虞泓等[53]利用AFLP對石斛4個內種和1個外群種進行DNA多態性分析，用篩選得到的引物構建了5個種的DNA圖譜，并應用bootstrap進行了檢驗，該研究證明了AFLP標記技術可用于構建石斛基因組指紋圖譜。趙紅燕[54]則利用EST-SSR、ISSR、RAPD、SRAP等4種分子標記技術成功構建了浙江鐵皮石斛563個遺傳連鎖。鄭偉耀等[55]運用SSR標記天麻基因組DNA，分析得出擴增位點與天麻素含量有關。巫桂芬等[56]通過黃麻基因DNA分子指紋圖譜的構建，得出每一種被識別出的物種均有其特有的分子“身份證”。

3 展望

中國藥用植物種質資源非常豐富，但是近年來由于氣候的變化以及過度的開采，使得一些稀少的野生藥材資源更是急劇減少，市場也相對混亂，因此從生物本質出發的DNA分子標記技術對于中國藥用植物的鑒定、保護、開采、利用及改造就顯得格外重要。目前，分子標記技術在藥用植物中的研究主要體現在遺傳多樣性研究、種質鑒別及評價、DNA指紋圖譜構建以及基因定位幾個方面。

目前在藥用植物研究應用中的DNA分子標記技術尚存在以下幾個問題：DNA標記技術在中藥材研究中的應用較少，而且存在方向聚集現象，近年關于藥用植物親緣性的研究越來越多，然而在其他一些領域，如藥材活性成分分離與提取以及相關成分控制基因定位等方面的研究卻少有報道，研究范圍不夠全面和深入。另外，每一種分子標記技術都有其各自的優缺點，實驗結果具有一定片面性，而標記技術的聯合應用也處于相對空白狀態；技術要求高，技術培訓相對缺乏。因此，需要加大分子標記技術的研究應用，以便增加其在藥用植物研究中的實用性和可靠性，通過以不同分子技術的研究為基礎，可達到明確中藥材有效藥用成分的基因構成，以及各種藥用植物基因的調控原理及產物的靶向作用原理，以便對中國中藥品種的保護利用及產業化做出更大的貢獻，以此實現中國中藥文化的規范化、產業化以及國際化。

參考文獻：

[1] 李繼珩.天然藥物開發應用前景[J].醫藥導報，2002，21（8）：472-475.

[2] BOTSTEIN D，WHITE R，SKOLNICK M，et al. Construction of genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism[J].American Journal of Human Genetics，1980， 32（3）：314-331.

[3] 黎 裕，賈繼增.分子標記的種類及其發展[J].生物技術通報， 1999，15（4）：19-22.

[4] 楊 柳，程 波，曾凡波.DNA分子遺傳標記技術及其在生藥學中的應用[J].中國藥師，2004，7（7）：559-561.

[5] ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR） anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomes，1994，20（2）：176-183.

[6] XIANG L X，HE D，DONG W R，et al. Deep sequencing-based transcriptome profiling analysis of bacteria-challenged Lateolabrax japonicus reveals insight into the immune-relevant genes in marine fish[J]. BMC Genomics，2010，11（1）：472-493.

[7] EMEBIRI L C. An EST-SSR marker tightly linked to the barley male sterility gene（msg6） located on chromosome 6H.[J]. Journal of Heredity，2010，101（6）：769-774.

[8] RIAR DS，RUSTGI S，BURKE I C，et al. EST-SSR development from 5 Lactuca species and their use in studying genetic diversity among L. serriola biotypes[J].Journal of Heredity，2011， 102（1）：17-28.

[9] VELAPPAM N，SONDGRASS J L，HAKOVIRTA J R. Rapid identification of pathogenic bacteria by single-enzyme amplified fragment length polymorphism analysis[J].Diagnostic Microbiology and infections Disease，2001，39（2）：77-83.

[10] 韓艷麗，朱建華.DNA分子標記技術在中草藥鑒定中的應用[J].現代中藥研究與實踐，2008，22（4）：62-65.

[11] 陳要臻，郭丁丁，馬逾英，等.白芷擴增片段長度多態性反應體系的建立及優化[J].時珍國醫國藥，2008，19（12）：2844-2846.

[12] 劉宇婧，劉 越，黃耀江，等.植物DNA條形碼技術的發展及應用[J].植物資源與環境學報，2011，20（1）：74-82.

[13] LAHAYE R，WANDER B M，BOGARIN D，et al. DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（8）：2923-2928.

[14] NEWMASTER S G，RAGUPATHY S. Ethnobotany genomics：discovery and innovation in a new era of exploratory research[J].Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine，2010，6（1）：2.

[15] KANE N C，CRONK Q. Botany without borders：barcoding in focus[J]. Molecular Ecology，2008，17（24）：5175-5176.

[16] SHINOZAKI K，OHEM M，TANAKA M，et al. The complete nucleotide sequence of the tobacco chloroplast genome：its gene organization and expression[J].The EMBO Journal，1986， 5（9）：2043-2049.

[17] DIEKMANN K，HODKINSON T R，FRICKE E，et al.An optimized chloroplast DNA extraction protocol for grasses （Poaceae） proves suitable for whole plastid genome sequencing and SNP detection[J].Plos One，2008，3（7）：2813.

[18] PARKS M，CRONN R，LISTON A.Increasing phylogenetic resolution at low taxonomic levels using massively parallel sequencing of chloroplast genomes[J].BMC Biology，2009，7：84.

[19] HOLLINGSWORTH P，FORREST L，SPOUGE J，et al. A DNA barcode for land plants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106（31）：12794-12797.

[20] 寧淑萍，顏海飛，郝 剛，等.植物DNA條形碼研究進展[J].生物多樣性，2008，16（5）：417-425.

[21] WANG Y，KLIJN J G，ZHANG Y，et al. Gene-expression profiles to predict distand metastasis of lymph-node-negative primary breast cancer[J].Lancet，2005，9460（365）：671-679.

[22] 張琳西.應用基因芯片對皮膚惡性黑色素瘤差異表達基因的研究[D].西安：第四軍醫大學，2003.

[23] SCHENA M. Microarray biochip technology[M]. Natick，MA：Eaton Publishing，2000：19-63.

[24] 金 敏，李君文.基因芯片技術在環境微生物群落研究中的應用[J].微生物學通報，2008，35（9）：1466-1471.

[25] 王洪水，侯相山.基因芯片技術研究進展[J].安徽農業科學，2007，35（8）：2241-2243.

[26] WATANABE C M，WOLFFRAM S，ADER P，et al. The in vivo neuromodulatory effects of the herbal medicine ginkgo biloba[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（12）：6577-6580.

[27] 李美德.基于基因芯片研究漢黃芩素抗腫瘤作用機制[D].福州：福建中醫藥大學，2013.

[28] 郭旭東.急性心肌梗死的基因診斷[D].長春：吉林大學，2015.

[29] 張玉金，張建永，聶緒強，等.基于NCBI序列數據發掘用于鑒定中國藥典基原植物的基因芯片探針研究[J].中藥材，2014， 37（11）：1987-1991.

[30] 劉 聽，楊官品.分子標記技術新進展：以幾種新型標記為例[J].安徽農業科學，2011，39（23）：44-46.

[31] 楊昭慶，洪坤學.單核苷酸多態性的研究進展[J].國外遺傳學分冊，2000，23（1）：4-8.

[32] XU J，ZHAO Q，DU P，et al. Developing high through put genotyped Chromosome segment substitution lines based on population whole-genome re-sequencing in rice（Oryza sativa L.）[J].BMC Genomics，2010，11：656.

[33] 徐 蕾，劉 莉，彭少丹，等.利用SSR標記研究鐵皮石斛的遺傳多樣性[J].分子植物育種，2015，7（13）：1616-1622.

[34] SHEN J，DING X，LIU D，et al. Intersimple sequence repeats （ISSR） molecular fingerprinting markers for authenticating populations of Dendrobium officinale Kimura et Migo[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin，2006，29（3）：420-422.

[35] 李永清，葉 煒，江金蘭，等.鐵皮石斛種質親緣關系的ISSR分析[J].西南農業學報，2015，38（4）：1530-1534.

[36] 趙香妍，劉長利，薛文峰，等. 北京地區野生柴胡種質資源的ISSR研究[J]. 中國現代中藥，2015，17（10）：1008-1013.

[37] 馬曉沖，姚 輝，辛天怡，等. 基于DNA條形碼SNP鑒別東方澤瀉、澤瀉及市售澤瀉藥材[J].中國藥學雜志，2015，50（17）：1474-1478.

[38] 滕艷芬，吳曉俊，徐 紅，等. 石斛及其常見混淆品的matK基因序列比較[J].中國藥科大學學報，2002，33（4）：280-283.

[39] YANG G S，WANG Y，SUN C Y，et al.SSR Analysis of Genetic Diversity of Panax ginseng[J].Medicinal Plant，2010，1（7）：50-53.

[40] LI X W，GAO H H，WANG Y T，et al.Complete chloroplast genome sequence of Magnolia grandiflora and comparative analysis with related species[J].Science China（Life Sciences），2013，56（2）：189-200.

[41] GALINA D，REUNOVA，OLGA G，et al. Microsatellite Analysis of Panax ginseng Natural Populations in Russia[J].Chinese Medicine，2014，4（5）：231-243.

[42] 朱田田，晉 玲，杜 弢，等.甘肅不同產地中麻黃遺傳關系的ISSR分析[J].中藥材，2013，36（9）：1397-1401.

[43] 黃穎楨，陳箐瑛，趙云青，等.金線蓮遺傳多樣性的ISSR分析[J].中草藥，2014，45（15）：2230-2234.

[44] 葉 煒，江金蘭，李永清，等.金線蘭及近緣種植物遺傳多樣性ISSR標記分析[J].植物遺傳資源學報，2015，16（5）：1045-1054.

[45] 唐曉清，王康才，陳 暄，等.丹參不同栽培農家類型的AFLP分析[J].藥物生物技術，2006，13（3）：182-186.

[46] 李 勇，丁萬隆，陳士林，等.金蓮花種質遺傳多樣性的AFLP分析[J].世界科學技術-中醫藥現代化，2011，13（2）：328-331.

[47] 唐美瓊，偉榮昌，姚紹嫦.廣西草珊瑚種質資源遺傳多樣性的AFLP分析[J].中草藥，2012，43（7）：1398-1402.

[48] 沈 亮，徐 榮，陳 君，等.我國肉蓯蓉寄主梭梭種質資源多樣性的AFLP分析[J].中國中藥雜志，2014，39（6）：959-964.

[49] 李永清，江金蘭，葉 煒，等. 37份藥用石斛種質資源親緣關系的ISSR分析[J].福建農業學報，2015（2）：131-135.

[50] 朱田田，晉 玲，劉效瑞，等.不同黃芪和黨參栽培品種（系）遺傳關系的ISSR分析[J].中國中醫藥信息雜志，2015，22（2）：79-82.

[51] 蔣雨晗，張麗萍，周學剛，等.ISSR分子標記在白芍親緣關系的研究應用[J].世界科學技術-中醫藥現代化，2016，18（3）：429-433.

[52] 周志勇，周 鋼，周肆清，等.AFLP法構建人參，西洋參基因組 DNA指紋圖譜[J].藥學學報，2000，35（8）：626-629.

[53] 虞 泓，和 銳，倪念春，等.石斛屬4種植物的AFLP分析[J].中草藥，2004，35（7）：808-810.

[54] 趙紅燕.石斛分子遺傳連鎖圖譜的構建[D].杭州：杭州師范大學，2011.

[55] 鄭偉耀，宋聚先，王曉麗，等.天麻微衛星DNA分子標記與天麻素含量的關系[J].貴陽醫學院學報，2010，35：4-7.

[56] 巫桂芬，徐鮮均，徐建堂，等.利用SRAP、ISSR、SSR標記繪制黃麻基因源分子指紋圖譜[J].作物學報，2015（3）：367-377.