一株耐鹽耐氧反硝化菌MCW148的分離鑒定及其脫氮特性

姜天翔++任華峰++陳進斌++苗英霞++邱金泉++王靜

摘要：從渤海某海水養殖場（北美白對蝦）底泥中分離到1株耐鹽高效好氧反硝化細菌MCW148，經過對其形態特征、生理生化以及16S rDNA序列分析，將該菌株初步鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。進一步研究表明，菌株MCW148的最適碳源為葡萄糖，最適培養溫度為35 ℃，最適pH為6。在最適條件下，菌株MCW148在12 h對NO3--N的去除率為62.4%。

關鍵詞：好氧反硝化菌；巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）；脫氮；耐鹽

中圖分類號：X172 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）13-2442-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.011

Isolation and Identification of a Salt-tolerant and Aerobic Denitrification Bacterial Strain MCW148 and Its Denitrification Characterization

JIANG Tian-xiang， REN Hua-feng， CHEN Jin-bin， MIAO Ying-xia， QIU Jin-quan， WANG Jing

（The Institute of Seawater Desalination and Multipurpose Utilization， State Oceanic Administratrion，

Peoples Republic of China， Tianjin 300192， China）

Abstract： A aerobic denitrification bacterial strain MCW148 with salt-tolerance and high denitrification ability was isolated from sediment of shrimp pond in the Bohai Sea. Results indicated this strain was identified as Bacillus megaterium according to its morphology， biochemical properties and 16S rDNA sequence analysis. Further study indicated the optimal carbon was glucose， and the optimal pH and temperature for cell growth and denitrification were 6.0 and 35 ℃， respectively. And the NO3--N removal rate of the strain MCW148 was 62.4% in the optimal conditions for 12 h.

Key words： aerobic denitrification bacteria； Bacillus megaterium； denitrification； salt tolerance

中國是世界上海水養殖發達的國家，養殖面積和總產量均居世界首位。海水養殖正成為中國近岸海域的重要污染源。以養蝦為例，即使是管理最好的養蝦場，也有30%的餌料未被攝食，殘餌溶生的氮、磷營養物質是蝦池及其鄰近淺海的主要污染源。在高密度的水產養殖體系中，飼料中75%～80%的氮會進入養殖水體中，并以氨氮、亞硝酸鹽氮的形式出現不同程度的累積，對水產養殖動物造成危害，從而限制了海水養殖的單位產量，并且其排放的廢水中也含有豐富的含氮化合物，會加快海水富營養化，造成赤潮災害，給近岸海洋生態環境帶來了危害[1]。因此，研究快速消除養殖環境中有機污染的方法，以盡快恢復和優化養殖環境，對中國海水養殖業的健康發展以及灘涂和淺海資源的可持續利用具有重要的理論和現實意義。自從第一株好氧反硝化菌在1984年首次發現[2]以來，國內外陸續有大量菌株被分離出來[3-8]。好氧反硝化菌是一類能在好氧或兼氧條件下進行反硝化的細菌，它的存在使得硝化過程和反硝化過程得以在一個反應器中同步進行，硝化反應的產物可成為反硝化反應的底物，加快了反應速度，降低了運行成本，同時反硝化反應釋放的OH-會補償硝化反應消耗的堿，避免酸性物質的積累，維持系統pH的穩定[8，9]。本試驗主要對1株耐鹽好氧反硝化細菌MCW148進行了鑒定，研究了該菌株高效代謝硝酸鹽氮的生理生化特性，及其最佳培養條件和生長特性，為好氧反硝化菌在海水養殖廢水處理中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種富集、分離純化和培養基組成[4]

稱取1 g樣品放入裝有9 mL無菌水的試管中，80 ℃水浴20 min，充分振蕩混勻，取1 mL 到下一個同樣的試管中，依次稀釋得到各種濃度的菌懸液。分別取10-5～10-7 3個稀釋梯度的稀釋液0.1 mL涂布于NA平板上，然后倒置于培養箱中37 ℃培養24 h。挑取不同形態的單菌落轉接至NA斜面上，37 ℃恒溫培養24 h，置于4 ℃冰箱保存備用。所挑取菌落同時在NA培養基平板上劃線檢驗純度。

菌株分離培養基（NA）：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，pH 7.2～7.4，蒸餾水1 000 mL。

硝酸鹽還原產氣培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，KNO3 1.0 g，pH 7.2～7.4，蒸餾水1 000 mL。

種子培養基：葡萄糖10.0 g，CaCl2 0.2 g， MgSO4·7H2O 0.5 g，（NH4）2SO4 2.0 g，KCl 0.2 g，乙酸鈉 3.32 g，pH 7.2～7.4，蒸餾水1 000 mL。

反硝化基礎培養基：KNO3 2.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，葡萄糖 10.0 g，pH 7.2～7.4，蒸餾水1 000 mL。

1.2 反硝化性能測定

250 mL三角瓶中加入100 mL反硝化性能測定培養液，滅菌后加入1 mL培養至對數期的菌液，置于120 r/min、30 ℃下培養，每3 h取樣測定培養基中的NO3--N、NO2--N濃度和細菌生長量（以吸光度OD600 nm表示）。

1.3 菌株的鑒定

菌落形態及生理生化鑒定：30 ℃培養24 h，觀察菌落形態；革蘭氏染色、碳源利用等生理生化指標測定參照文獻[10]的方法進行。

16S rDNA PCR擴增和序列測定：將菌株保存至平板中，送往上海生工生物工程技術服務有限公司完成測序和分析。

1.4 菌株生長條件及脫氮特性

1.4.1 最適碳源 分別以葡萄糖、乙酸鈉、丁二酸鈉、草酸鈉、檸檬酸鈉為碳源，貧營養反硝化性能測定培養基中的其他成分不變，滅菌后按照1%的量加培養至對數期的菌液，然后置于120 r/min、30 ℃條件下培養，分別在0、12、24、36、48 h取樣測定培養基中的NO3--N、NO2--N濃度，計算其去除率。

1.4.2 最適溫度 以葡萄糖為碳源，配制化學需氧量（COD）為200 mg/L、NO3--N質量濃度為10 mg/L的貧營養反硝化性能測定培養基，滅菌后按照1%的量加培養至對數期的菌液，分別置于15、20、25、30、35、40 ℃下，120 r/min連續振蕩培養24 h，測定培養液中的NO3--N濃度，計算其去除率。

1.4.3 最適初始pH 培養溫度30 ℃，初始pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，其他試驗設計同“1.4.2”。

2 結果與分析

2.1 樣品的富集培養及菌種的分離純化

污泥樣經過3次富集培養后得到混合微生物的培養物，它可以在含有200 mg/L NO3--N的合成培養基（FM）中生長，在培養過程中通過測定培養液的OD600 nm和NO3--N的濃度，發現該混合培養液中的NO3--N含量不斷減少，而OD600 nm不斷上升，說明該混合液培養物具有很強的好氧反硝化能力。

上述混合培養物在對氯苯胺的BTB平板上進行劃線分離，挑取單菌落，經過復篩、純化后得到1株具有高效脫氮功能的耐鹽好氧反硝化細菌菌株MCW148。

2.2 MCW148菌株反硝化性能

通過實驗室模擬養殖系統廢水的水質（表1）分析，把MCW148菌株接種于NO3--N初始濃度為150 mg/L的合成培養基中，30 ℃、120 r/min搖床培養，定時取樣測定菌體生長、NO3--N和NO2--N的濃度情況。結果（圖1）表明，MCW148能在12 h內將NO3--N濃度從140 mg/L以上降至0.05 mg/L以下，同時，NO2--N的濃度先逐步升高，然后逐步降低至0.05 mg/L以下，說明MCW148菌株具有高效的反硝化脫氮能力。另外，由圖1還可知，MCW148菌株的生長同步于NO3--N濃度的降低，且MCW148菌株的生長曲線、NO3--N的代謝曲線中的遲緩期基本都在0～3 h，然后進入對數期（4～15 h），約在24 h達到最高的菌體生長量。

2.3 菌株的鑒定

菌株MCW148在LB培養基平板上培養2 d的菌落為乳白色，圓形，中間凸出，表面光滑濕潤，直徑在1 mm左右；細胞呈直桿狀，1.0 μm×3.0 μm，革蘭氏陽性，常以成對或鏈狀排列，單極毛（圖2）。接觸氧化酶陽性；可利用葡萄糖、檸檬酸鈉、阿拉伯糖、木糖等為碳源，但利用葡萄糖效果最好；硝酸鹽還原和反硝化陽性。擴增菌株MCW148的16S rRNA部分基因，長度為1 516 bp。序列分析表明該菌株與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）的同源性最高，為99%[4，11]。結合菌株的形態和生理生化特征，將菌株MCW148初步鑒定為巨大芽孢桿菌。目前，國內外在好氧反硝化菌領域進行了大量的研究[12-16]，但在芽孢桿菌屬中，具有耐鹽和好氧反硝化能力的細菌卻鮮有報道。

2.4 MCW148菌株生長條件及脫氮特性

2.4.1 最適碳源 分別以葡萄糖、乙酸鈉、丁二酸鈉、草酸鈉、檸檬酸鈉為碳源，貧營養反硝化性能測定培養基中的其他成分不變，接種MCW148菌株，在30 ℃、120 r/min搖床條件下培養2 d，定時取樣測定NO3--N濃度。圖3的結果表明，菌株MCW148能夠利用多種碳源進行脫硝酸鹽氮，其中，碳源為葡萄糖時，NO3--N的去除效果最佳，培養12 h去除率便達到了62.4%；其次是檸檬酸鈉，NO3--N在培養12 h時去除率為34.2%，24 h去除率達到了59.7%；丁二酸鈉、草酸鈉24 h的NO3--N去除率分別為45.8%和33.7%；而菌株MCW148基本不利用乙酸鈉為碳源。因此，葡萄糖為菌株MCW148的最適碳源。

2.4.2 最適溫度 由圖4可知，MCW148菌體生長和反硝化的溫度適宜范圍為30～40 ℃，在35 ℃時NO3--N去除率最高，為74%。另外，由圖4可以看出，MCW148的生長和反硝化存在一個臨界溫度，即25 ℃，一旦低于這個溫度，MCW148的生長和代謝活性顯著降低，因此，該菌嗜高溫而對低溫非常敏感，建議35 ℃為其最適生長溫度。

2.4.3 最適初始pH 由圖5可知，MCW148菌株在pH 5～9的范圍內對NO3--N的代謝去除活性均較高，其最佳pH為6，此時的NO3--N去除率為60%。

3 小結

本研究從渤海某海水養殖場（北美白對蝦）底泥中分離到1株耐鹽高效好氧反硝化細菌，經過對其形態特征、生理生化以及16S rDNA序列分析，初步鑒定為巨大芽孢桿菌。該菌株在去除NO3--N的同時，也能降解COD。菌株MCW148在不同種類碳源下去除NO3--N的能力由大到小依次為葡萄糖、檸檬酸鈉、丁二酸鈉、草酸鈉、乙酸鈉。其生長和代謝NO3--N的最佳條件是溫度35 ℃、pH 6，在此條件下，鹽度為3%時，菌株MCW148能達到最佳生長狀況和最大去除率，12 h對NO3--N的去除率為62.4%。

菌株MCW148具有生長速度較快、對NO3--N去除率高的特點，今后，將對該菌株的代謝機理、酶的影響等方面做進一步的探討和研究，并結合其他脫氮微生物以及固定化技術，可為海水水產養殖水質改良等方面提供技術支持。

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