金槍魚肉降解用高產蛋白酶菌株的篩選及鑒定

吳麗娜++趙小惠++郭凱晴++楊宇杰++方旭波++陳小娥

摘要：采用透明圈法從舟山普陀白山土壤中篩選出3株能分泌胞外蛋白酶的菌株，并對蛋白酶活力最高的菌株進行分子鑒定及最適宜生長條件分析。選擇福林酚試劑法測定其蛋白酶活力，對蛋白酶活力最高的菌株進行16S rRNA基因測序，用MEGA軟件構建系統發育樹，并考察其接種量、溫度、時間對該菌株產酶活力的影響。結果表明，zjoub-1菌為高產蛋白酶菌屬，并確定為枯草芽孢桿菌。該菌株用于金槍魚暗色肉發酵時的最適宜條件為接種量2%、pH 7.4、溫度37 ℃、時間48 h。在此生長條件下，菌株產蛋白酶活力最高，為49.21 U/mL，能夠有效地降解金槍魚暗色肉。

關鍵詞：金槍魚肉；透明圈法；福林酚試劑法；篩選；鑒定；生長條件

中圖分類號：S965.332 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）13-2506-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.027

Screening and Identification of A Strain with High Protease in Fermentation of Tuna Dark Meat

WU Li-na1，ZHAO Xiao-hui1，GUO Kai-qing1，YANG Yu-jie1，FANG Xu-bo1，2，CHEN Xiao-e1，2，ZHANG Yin-zhao3

（1.College of Food and Medicine， Zhejiang Ocean University， Zhoushan 316022， Zhejiang，China；

2.State Key Laboratory of Aquatic Products Processing of Zhejiang Province， Zhoushan 316022，Zhejiang，China；

3.Zhejiang Fengyu Biological Products Limited Company， Zhoushan 316104， Zhejiang，China）

Abstract：Using Three strains of bacteria secreting extracellular protease were isolated from soil of Baishan in Zhoushan by transparent circle method， the bacterium with highest protease activity was identified and the most suitable growth conditions was studied. The collected samples were screened by transparent circle method to get three pure strains whose protease activity would be measured by Forint phenol reagent method. The strain with the highest protease activity was identified by the 16S rRNA sequence analysis and the phylogenetic tree was constructed by MEGA software. The inoculation amount，temperature，time and pH had been analyzed on the influence of its protease activity. The results showed that the study demonstrates that the zjoub-1 strain with highest protease activity was defined as bacillus subtilis. The optimal condition for fermentation of Tuna dark meat was as follows： the inoculation quantity was 2%，the incubation temperature was 37 ℃， the incubation time was about 48 h， the initial pH was 7.4. Under this circumstance， the strain has the highest protease activity， which illustrates that the strain with high protease activity can degrade the Tuna dark meat efficiently.

Key words：Tuna dark meat；transparent circle method；Forint phenol reagent method；isolation；identification；growth conditions

近年來，舟山市水產加工企業紛紛搶抓泰國金槍魚加工部分向中國轉移的機遇，及時調整生產線，積極拓展金槍魚原料加工貿易，大力發展中間產品加工，金槍魚肉加工業呈現出蓬勃發展的勢頭。金槍魚在加工處理過程中會產生高達6成以上的暗色肉、表皮、魚骨及內臟等下腳料，其中暗色肉占50%以上[1]，但是由于國內加工技術落后及關鍵加工設備研發滯后，這些下腳料目前只能被簡單加工成飼料魚粉，產品附加值低，也有部分被直接丟棄，不僅污染環境，而且造成資源的浪費[2]。因此，加大對這類低值下腳料的開發研究力度，已經成為浙江省金槍魚加工產業鏈發展的重中之重。

研究表明，金槍魚暗色肉是一種優質的飼用蛋白原料[3]，具有較高的蛋白質含量，其氨基酸組成也較平衡。除了加工飼料魚粉外，目前國內對于金槍魚暗色肉等下腳料的利用研究主要集中在通過酶解法制備飼用肽上，對金槍魚暗色肉的微生物發酵研究相對較少。研究表明，采用微生物發酵法制備飼用肽能夠提高飼用肽的適口性及其蛋白質含量，提高消化吸收利用率，而且減少了肽酶和脫苦的成本，簡化了生產工序。

蛋白酶是一類廣泛應用于紡織、食品、醫藥、洗滌劑、有機合成及制革脫毛等方面的重要工業和研究用酶[4]，其份額占整個酶制劑市場的一半以上。蛋白酶既可以從動植物組織中直接提取，也可以通過微生物發酵工藝進行大規模生產[5]。目前，生產蛋白酶制劑主要利用霉菌、酵母菌、芽孢桿菌等微生物發酵制備。隨著蛋白酶應用的日趨廣泛，急需分離篩選能分泌具有較高蛋白酶活力并適用金槍魚暗色肉發酵大規模生產應用的菌株[6]。

本研究結合透明圈法從土壤中篩選得到3株產蛋白酶的菌株，選出產蛋白酶活力最高及透明圈（H/C）值最大的菌株，通過16S rRNA基因測序及系統發育樹構建對其進行分子鑒定，擬為具有高蛋白酶活力飼料添加劑的研發提供參考菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

對采自舟山普陀區白山的土樣進行分離篩選及鑒定。

試管斜面培養基：蛋白胨5 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15 g/L，調節pH至8.0，121 ℃滅菌20 min備用。

脫脂牛奶固體培養基：脫脂奶粉10 g/L，瓊脂20 g/L，水1 L，pH 7.2～7.4，115 ℃滅菌15 min備用。

酪素培養基：KH2PO4 0.36 g/L，MgSO4 0.5 g/L，ZnCl2 0.014 g/L，Na2HPO4·7H2O 1.07 g/L，NaCl 0.16 g/L，CaCl2 0.002 g/L，FeSO4 0.002 g/L，干酪素4 g/L，Tryptilase 0.05 g/L，瓊脂20 g/L，調節pH至7.0，121 ℃滅菌20 min備用。

搖瓶培養基：蛋白胨5.0 g，牛肉浸取物3.0 g，NaCl 5.0 g，去離子水1.0 L，pH 7.0。

種子培養基：蛋白胨5 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，調節pH至8.0，121 ℃滅菌20 min備用。

SPX-250B-Z型生化培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；UV-6000型紫外分光光度計：蘇州江東精密儀器有限公司；四方均質器：鐵道部電化院四方電氣設備廠；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海棱光技術有限公司；BS110型電子分析天平：北京賽多利斯天平有限公司。

1.2 方法

1.2.1 產蛋白酶菌株的富集、分離純化及篩選 稱取1 g經處理的土樣加入裝有25 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，用六層紗布封口，置于80 ℃水浴鍋中加熱10 min，以殺死樣品中的微生物營養體細胞。然后在30 ℃、150 r/min的條件下振蕩培養24 h，取樣鏡檢形成芽孢的情況。取1 mL處理液以10倍稀釋法分別稀釋到1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7 5個梯度。分別取0.1 mL菌液于無菌的酪素培養基平板上，用滅過菌的涂布棒將菌液均勻涂布在酪素平板上，倒置于30 ℃培養箱中培養24～48 h。觀察酪素平板上菌落周圍的透明圈，觀察透明圈狀況[7]。以透明圈的直徑（H）/菌落直徑（C）表示菌株產蛋白酶的狀況。挑取（H/C）值較大的菌株接入試管斜面培養基，30 ℃培養24 h，備用。觀察在平板上得到的優勢菌落，選取形態特征一致的單菌落，在脫脂牛奶固體培養基上多次劃線分離，經過數次培養后得到純化的單菌落。觀察菌落特征，選擇不同顏色及形態的單菌落，接種于斜面保存培養基，置于冰箱中保存。

1.2.2 菌株蛋白酶活力測定

1）發酵種子液的制備。輕輕刮取一環經斜面活化后的菌株接種至裝有50 mL搖瓶培養基的250 mL三角瓶內，于37 ℃、150 r/min的條件下振蕩培養20 h后，作為暗色肉發酵種子液備用。使用前，種子液稀釋至菌體濃度為108個/mL[8]。

2）蛋白酶活力測定方法。按照國標福林酚試劑法[9]測定這3株菌發酵液蛋白酶活力。通過比較這3株菌發酵液蛋白酶活力的大小，選出蛋白酶活力最強的菌株及透明圈（H/C）值大的菌株進行分子鑒定。

1.2.3 菌株的鑒定

1）菌落形態和個體形態觀察。將制備的菌懸液稀釋到合適的稀釋度，取0.1 mL涂布于脫脂牛奶固體培養基上，于30 ℃培養箱培養48 h，觀察單菌落形狀、顏色、是否濕潤、邊緣情況等。革蘭氏染色具體操作方法參照文獻[10]。

2）菌株的分子鑒定。菌株的分子鑒定具體操作方法參照文獻[11]。

1.2.4 菌株產蛋白酶活力的單因素試驗

1）發酵溫度對菌株產蛋白酶活力的影響。將篩選所得蛋白酶活力最高的菌株以2%接種量接至裝有50 mL搖瓶培養基的250 mL三角瓶中，分別選擇0、23、30、37、44 ℃進行發酵，每隔48 h后取樣，測定其蛋白酶活力[12]。

2）發酵時間對菌株產蛋白酶活力的影響。將篩選所得蛋白酶活力最高的菌株以2%接種量接至裝有50 mL搖瓶培養基的250 mL三角瓶中，發酵溫度37 ℃，分別發酵0、12、24、36、48、60 h后取樣，測定其蛋白酶活力。

3）接種量對菌株產蛋白酶活力的影響。將篩選所得蛋白酶活力最高的菌株按0、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%接種量接至裝有50 mL搖瓶培養基的250 mL三角瓶中，37 ℃發酵48 h后，測定其蛋白酶活力。

4）pH對菌株產蛋白酶活力的影響。將篩選所得蛋白酶活力最高的菌株以2%接種量接至裝有50 mL搖瓶培養基的250 mL三角瓶中，發酵溫度37 ℃，pH分別設置為0、1.9、3.8、5.7、7.4、9.3，發酵48 h后，測定其蛋白酶活力。

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定結果

2.1.1 菌株的分離純化結果 經過一系列的篩選、分離及純化，從土壤中篩選出3株產蛋白酶的菌株，觀察菌落形態特征、革蘭氏染色結果及（H/C）值，結果見表1。從表1中可以看出，不同的菌株有不同的菌落特征，其中zjoub-1菌株在3種菌株當中菌體最大，呈米白色，一般為圓形，不透明，濕潤，光滑，培養時間較長或者溫度較高條件下會出現皺褶，菌落中央出現深色的傘狀線，革蘭氏染色下呈短桿狀，革蘭氏陽性，zjoub-1菌平均透明圈（H/C）值為3.68；zjoub-2菌株菌體大小適中，濕潤，有光澤，菌落顏色呈淡黃色，革蘭氏染色下呈短桿狀，革蘭氏陽性，其平均透明圈（H/C）值為3.23；zjoub-3菌株菌體最小，呈半透明，濕潤，光滑，菌落顏色為白色，革蘭氏染色下呈球狀，革蘭氏陰性，其平均透明圈（H/C）值為2.79。試驗結果表明，3株菌株都能在篩選培養基上形成明顯的水解透明圈。其中，zjoub-1菌株透明圈直徑與菌落直徑的比值均最大，說明其分解蛋白質的能力最強。

2.1.2 菌株的透明圈 zjoub-1菌株、zjoub-2菌株及zjoub-3菌株經過一系列的分離純化，最終得到的培養48 h后的菌株透明圈如圖1所示。由圖1可知，菌落在脫脂牛奶固體培養基上形成的水解圈明顯，脫脂牛奶固體培養基主要成分為蛋白質，整個平板呈乳白色，由于菌株能產生蛋白酶，因此培養基中的蛋白質在菌體生長過程中將會被分解，從而出現透明圈。

2.1.3 芽孢染色結果 如圖2所示，zjoub-1菌株、zjoub-2菌株和zjoub-3菌株的芽孢在油鏡下分別呈藍紫色、藍紫色和紅色，且均為桿狀，可知zjoub-1菌株和zjoub-2菌株為革蘭氏陽性菌，zjoub-3菌株為革蘭氏陰性菌。由此可知，zjoub-1菌株、zjoub-2菌株及zjoub-3菌株均為芽孢桿菌。zjoub-1菌株的菌體大小比zjoub-2菌株大。

2.2 蛋白酶活力

L-酪氨酸標準曲線如圖3所示。3株菌株中，透明圈法測得的酶活力大小依次為zjoub-1>zjoub-2>zjoub-3。福林酚試劑法測得發酵液酶活力的大小依次為zjoub-1（46.73 U/mL）>zjoub-2（24.79 U/mL）>zjoub-3（19.26 U/mL）。因此，選出蛋白酶活力最強及透明圈（H/C）值最大的菌株zjoub-1進行下一步分子鑒定。

2.3 zjoub-1菌株的分子鑒定

2.3.1 16S rRNA基因PCR擴增 zjoub-1菌株16S rRNA基因PCR擴增結果如圖4所示，得到條帶大小為2 000 bp。

2.3.2 16S rRNA基因測序和菌種鑒定 對菌株zjoub-1的16S rRNA基因測序，將菌株zjoub-1的16S rRNA基因序列在NCBI官網中使用Nucleotide BLAST比對，選取該菌種使用MEGA軟件構建系統發育樹，如圖5所示。圖中數字“3”為zjoub-1菌所在位置，由系統發育樹分析可得出zjoub-1菌株為枯草芽孢桿菌，與zjoub-1菌株芽孢染色結果相符合。

2.4 枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力的影響因素

2.4.1 發酵溫度對枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力的影響 發酵溫度是影響蛋白酶活力的重要因素之一。由圖6可知，隨著發酵溫度的升高，枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力也逐漸上升。當發酵溫度為37 ℃時，金槍魚暗色肉發酵后枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力最高，為47.31 U/mL。

2.4.2 發酵時間對枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力的影響 由圖7可知，枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力隨著發酵時間的延長而增加，但48 h后蛋白酶活力呈下降趨勢，可能是因為隨著發酵的進行，營養物質被消耗，營養物質的缺乏影響微生物代謝的活動，大大減少蛋白酶的生成。當發酵時間為48 h時枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力最高，為47.93 U/mL。

2.4.3 接種量對枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力的影響 由圖8可知，接種量的增加可以明顯提高菌株產蛋白酶活力，當接種量為2%時，枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力最高，為48.25 U/mL。

2.4.4 pH對枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力的影響

由圖9可知，隨著pH的升高，枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力也逐漸升高，當pH為7.4時，枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力最高，為49.21 U/mL，隨后枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力隨著pH的升高而下降。

3 討論與結論

金槍魚下腳料的原料主要為熟制后的暗色肉，脂肪含量相對較高，這一特性導致采用傳統的魚粉加工工藝很難生產出高質量的飼料產品[13，14]。因此，對金槍魚下腳料進行深度開發，提高其利用率和附加值顯得尤為迫切。目前，對于金槍魚暗色肉等下腳料的高值化加工利用主要通過酶解法制備飼料肽，對金槍魚暗色肉的微生物發酵研究較少。研究表明，采用微生物發酵制備小肽能夠將暗色肉中的大分子蛋白降解成小分子肽，同時有效抑制雜菌生長、降低組胺的生成，有效提高發酵暗色肉產品中的肽含量，提高金槍魚暗色肉蛋白質消化率，從而改善其營養價值，對彌補中國蛋白飼料尤其是優質蛋白資源的短缺，提高金槍魚下腳料利用率具有現實意義。常用的蛋白飼料發酵菌種包括酵母菌、霉菌、枯草芽孢桿菌及乳酸菌等，其中枯草芽孢桿菌作為益生菌能通過提高免疫力、調節腸道菌群、防止腹瀉等作用，促進動物生長，提高生產性[15-17]。因此，分離篩選能分泌具有良好酶學特性并適用于金槍魚暗色肉發酵大規模生產應用的蛋白酶高產菌株具有較大的應用價值。

此外，微生物的培養是一個復雜的過程，其產蛋白酶活力的高低受很多因素的影響，如發酵時間、接種量、溫度、pH等，因此對其發酵條件的優化顯得尤為重要[18]。菌株生長一定時間后，菌群會大量繁殖，金槍魚暗色肉中營養物質的消耗速度加快，到了發酵后期，金槍魚暗色肉中的營養物質不能滿足菌株產蛋白酶的要求，所以蛋白酶活力也相對降低了。延長發酵時間一方面可以使菌群大量繁殖從而達到穩定生長期，但在后期也可能產生不利的影響。綜上所述，發酵時間對枯草芽孢桿菌發酵金槍魚暗色肉有較大的影響，故選取48 h為最適宜的發酵時間。接種量影響菌株在金槍魚暗色肉發酵中的生長、代謝、繁殖的速度。選定適宜接種量可以縮短發酵體系內菌體密度達到高峰的時間，有利于產物的形成及發酵基質的利用，并減小被雜菌污染的幾率。接種量過大會導致發酵體系溶氧不足，菌株生長緩慢，且易衰老，不利于發酵的進行；接種量過小則會延長發酵周期，影響最終產率。本試驗中接種量為2%時，枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力最高。溫度主要影響微生物產酶的活力，從而影響其生長和代謝。發酵溫度過高會縮短菌株生長周期，導致其過早老化，使得金槍魚發酵產物產生不良的腐敗風味。本試驗研究表明，發酵溫度為37 ℃時，枯草芽孢桿菌產蛋白酶活力最高。只有適宜的pH才能滿足菌株的生長需要，因為pH可影響酶活性、菌體細胞的結構及菌體對營養物質的吸收，從而影響菌體的生長和反應活性。本試驗中枯草芽孢桿菌在pH為7.4時，產蛋白酶活力最高。

本研究通過富集培養、分離純化，從舟山普陀白山的土壤中篩選出1株高產蛋白酶活力的zjoub-1菌株，平均透明圈（H/C）值為3.68，蛋白酶活力為46.73 U/mL。經16S rRNA基因測序以及MEGA軟件構建系統發育樹得出該菌株為枯草芽孢桿菌；對zjoub-1菌株的培養條件進行優化，當接種量為2%、pH為7.4、溫度為37 ℃、發酵時間為48 h時，該菌株產蛋白酶活力最高，培養條件均最優時，蛋白酶活力可達49.21 U/mL，為金槍魚暗色肉的發酵提供了良好的基礎。

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