HPLC法對不同產地柴胡根中柴胡皂苷a及柴胡皂苷d的含量測定

馬澤剛++黃春花++鐘輝云

摘要：研究采用HPLC法對5個不同品種的柴胡（Bupleurum chinense DC.）根樣品進行了柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的定量分析。結果表明，不同品種中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量差異較大，這可能與柴胡的生長環境、采收年限等因素的影響有關。與傳統方法相比較，HPLC法不僅操作簡便、快捷，而且分析方法準確，重現性好。

關鍵詞：柴胡（Bupleurum chinense DC.）；HPLC；柴胡皂苷a；柴胡皂苷d

中圖分類號：R927.2；O657.7+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）13-2519-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.030

The HPLC Method for Determination of Saikosaponin a and d Content in Bupleurum from Different Habitats

MA Ze-gang， HUANG Chun-hua， ZHONG Hui-yun

（Department of Pharmacy， Sichuan Vocational College of Health and Rehabilitation， Zigong 643000， Sichuan，China）

Abstract： The HPLC method for quantitative determination of saikosaponin a and saikosaponin d content in 5 Bupleurum samples from different habitats was applied. The results showed that， the saikosaponin a and d content of different varieties varied greatly， the reason of it may be related to the growing environment， harvesting years and other factors. Compared with traditional methods， the HPLC was a simple， quick， accurate method with good reproducibility.

Key words： Bupleurum chinense DC.； high-pressure liquid chromatography； saikosaponin a； saikosaponin d

柴胡（Bupleurum chinense DC.）為植物界傘形科柴胡屬植物，以其根入藥，是中國傳統中藥中非常重要和常用的藥材，其性味苦涼，微寒，歸肝、膽實經，具有和解表里，疏肝升陽，疏散退熱等功效[1]。主要治療感冒、發熱、寒熱往來、試驗性肝損傷、調節內分泌和免疫系統等癥狀，在臨床上已經用來治療慢性毒性肝炎[2]。柴胡主要含有皂苷、揮發油、植物甾醇、黃酮類、多糖等成分[3-5]。其中柴胡皂苷為柴胡主要有效成分之一，現代藥理研究表明，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d活性較強[6，7]。中國柴胡資源分布廣泛，產地的自然環境差異大，為考察不同品種柴胡的質量情況，本研究采用HPLC法對中國5個不同產地的柴胡根樣品進行了柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的定量分析，為柴胡生藥質量評價提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 標準品購于成都瑞芬思生物科技公司，經HPLC面積歸一化法測定， 純度>98%；柴胡5個不同樣品（湖北柴胡根、劍閣柴胡根、甘肅柴胡根、青川柴胡根、馬公鄉柴胡根）購于成都藥材市場，經四川衛生康復職業學院副主任藥師鐘輝云鑒定為傘形科植物柴胡。除乙腈為色譜純外，其他試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX EXTEND-C18（250 mm×4.6 mm，5.6 μm）；流動相：乙腈-水，梯度洗脫，其時間程序為0-24-27-30 min，乙腈體積分數相應為25.0%-69.0%-25.0%-25.0%；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm；流速0.8 mL/min。

1.2.2 標準液制備 分別稱取柴胡皂苷a標準品6.3 mg，柴胡皂苷d標準品7.7 mg，用甲醇溶解，再定容至10 mL。

1.2.3 樣品溶液的配制 稱取各樣品粗粉1 g，一共3份，加0.1 g氫氧化鈣，80%甲醇溶液50 mL，60 ℃提取0.5 h，過濾，濾液定容至50 mL。

1.2.4 標準曲線的繪制 將柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的標準液做5、10、20、40、80倍稀釋，以峰面積為縱坐標（y），濃度為橫坐標（x）作標準曲線，進行線性回歸。各物質的回歸方程、相關系數和線性范圍見表1。

2 結果與分析

2.1 柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量測定

取樣品供試液進行HPLC測試結果見表2。由表2可知，不同品種中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量差異較大，其中柴胡皂苷a的含量以湖北柴胡根最高，劍閣柴胡根最低，柴胡皂苷d的含量以青川柴胡根最高，劍閣柴胡根最低。

2.2 重復性試驗

取湖北柴胡根6份，按“1.2.3”制備供試液，按“1.2.1”進樣進行測定，計算柴胡皂苷a的RSD為2.67%（n=6），柴胡皂苷d的RSD為2.31%（n=6）。

2.3 加樣回收率的測定

取1 g湖北柴胡藥材粉末，分別加入32.5、49.4 mg柴胡皂苷a、柴胡皂苷d，按“1.2.1”進行測定，測其峰面積，柴胡皂苷a的回收率為102.35%，RSD為1.04%（n=6）；柴胡皂苷d的回收率為99.21%，RSD為1.31%（n=6）。

2.4 精密度試驗

精密吸取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d混合標準品溶液按“1.2.1”進行測定，連續進樣6次，記錄其峰面積，計算柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的相對標準偏差。試驗測得胡皂苷a、柴胡皂苷d的RSD分別為1.8%、1.6%，表明色譜系統精密度符合要求。

2.5 穩定性試驗

取湖北柴胡供試液室溫下放置，按上述色譜條件每隔2 h測定1次，8 h內共測5次，記錄柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的峰面積，計算相對標準偏差。結果測得柴胡皂苷a的RSD為2.6%，柴胡皂苷d的RSD為2.1%，表明樣品在8 h內穩定。

3 討論

預試驗結果表明，隨著甲醇體積分數的增加提取率增加，當甲醇體積分數達到80%的時候，提取率達到最大，加氫氧化鈣有利于提取純化柴胡皂苷a、柴胡皂苷d。與傳統方法相比較，本試驗的提取方法不僅操作簡便、快捷，分析方法準確，重現性好，而且采用了氫氧化鈣提取柴胡皂苷，提取率高，在方法上有一定的創新。本試驗結果表明，不同品種中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量差異較大，這可能與柴胡的生長環境、采收年限等因素的影響有關。本試驗樣品中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量均達到2010版《中國藥典》規定“柴胡中柴胡皂昔a和d的總量不得少于0.30%”。因此，所測樣品均具有一定的藥用價值。本研究采用HPLC法對5個不同品種的柴胡根樣品進行了柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的定量分析，可為柴胡的質量評價、提取分離純化、臨床應用開發提供一定的科學依據。

參考文獻：

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[3] 沃 源，姚 琳，孫世偉.北柴胡化學成分的研究進展[J].黑龍江醫藥，2011，21（2）：215-217.

[4] 謝東浩，蔡寶昌，安益強，等.柴胡皂昔類化學成分及藥理作用研究進展[J].南京中醫藥大學學報，2007，23（1）：63-65.

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[7] 黃 偉，孫 蓉.柴胡皂苷類成分化學與藥理和毒理作用研究進展[J].中藥藥理與臨床，2010，26（3）：71-74.