基于道南效應和溶解擴散效應分析低濃度乙醇中綠原酸的納濾分離規律

李存玉　劉莉成　金立陽　李紅陽　彭國平

[摘要]該文采用納濾分離低濃度乙醇中綠原酸，探索道南效應和溶解擴散效應對綠原酸分離的影響規律。實驗表明溶液pH、乙醇濃度影響綠原酸分離行為，30%乙醇中綠原酸pH 3～7，截留率相差7027%，通過響應面法建立二次回歸模型，納濾膜截留相對分子質量、溶液pH、乙醇濃度存在交互作用，綠原酸存在狀態決定了其分離行為，隨著乙醇濃度的增加，游離態綠原酸因溶解擴散效應易吸附溶解在膜表面而促進其透過，解離態綠原酸在道南效應和溶解擴散效應的雙重作用下，難以進入膜表面，而截留率顯著升高。優選出的納濾富集工藝相較于傳統減壓濃縮優勢明顯，解決了中藥分離精制過程中，低濃度有機試劑環境中中藥成分在溶劑回收時存在效率低下、成分損失嚴重的技術難題。

[關鍵詞]綠原酸； 納濾； 乙醇，道南效應； 溶解擴散效應

[Abstract]To separate chlorogenic acid from low concentration ethanol and explore the influence of Donnan effect and solutiondiffusion effect on the nanofiltration separation rule The experiment showed that solution pH and ethanol volume percent had influences on the separation of chlorogenic acid Within the pH values from 3 to 7 for chlorogenic acid in 30% ethanol， the rejection rate of chlorogenic acid was changed by 7027% Through the response surface method for quadratic regression model， an interaction had been found in molecule weight cutoff， pH and ethanol volume percent In fixed nanofiltration apparatus， the existence states of chlorogenic acid determinedits separation rules With the increase of ethanol concentration， the free form chlorogenic acid was easily adsorbed， dissolved on membrane surface and then caused high transmittance due to the solutiondiffusion effect However， at the same time， due to the double effects of Donnan effect and solutiondiffusion effect， the ionic state of chlorogenic acid was hard to be adsorbed in membrane surface and thus caused high rejection rate The combination of BoxBehnken design and response surface analysis can well optimize the concentrate process by nanofiltration， and the results showed that nanofiltration had several big advantages over the traditional vacuum concentrate technology， meanwhile， and solved the problems of low efficiency and serious component lossesin the Chinese medicines separation process for low concentration organic solventwater solution

[Key words]chlorogenic acid； nanofiltration； ethanol； Donnan effect； solutiondiffusion effect

中藥分離精制過程中，含有低濃度有機試劑的中間體在溶劑回收時存在效率低下、成分損失嚴重的技術難題。如柱色譜分離時采用不同濃度有機溶劑洗脫，洗脫液中有機溶劑濃度偏低時需要高溫回收溶劑，對富含酚酸等熱敏性成分具有破壞，且難以控制成分轉化而影響分離效率，目前尚未出現適用可行的技術手段 [1]。納濾是膜分離技術中的一種，截留相對分子質量在100～1 000，具有分離過程可常溫操作，無熱效應，能耗低等技術優勢[2]，在熱敏性中藥成分分離精制領域具有獨特優勢[3]。納濾對溶質分子的分離原理主要包含道南效應和溶解擴散效應，其中道南效應又稱電荷效應，納濾膜荷負電性，與離子間形成靜電作用，加上立體阻礙，造成膜對離子的截留率有差異；在含不同價態離子的多元體系中，道南效應使得膜對不同離子的選擇性不一樣。此外，由于納濾膜孔與溶質分子的相互作用，也呈現出在位阻效應基礎上的溶解擴散理論，溶質溶解在膜中，并隨著推動力擴散傳遞，物相之間存在化學平衡。但目前對低濃度有機溶劑處理尚處于初步階段[4]，且分離機制不清晰。本文以富含酚酸的金銀花為例，探索低濃度乙醇環境中的綠原酸分離規律。

金銀花為忍冬Lonicera japonica的干燥花蕾或帶初開的花，因具有清熱解毒、疏散風熱等功效[5]而廣泛用于臨床，如清開靈注射液、銀黃注射液等。金銀花中主要成分是以綠原酸為代表的酚酸，熱穩定性差，長時間加熱易分解[6]，本文結合納濾分離的技術優勢，在單因素考察的基礎上，以納濾截留相對分子質量、乙醇濃度及pH為影響因子，應用BoxBehnken中心組合設計建立數學模型[7]，以綠原酸截留率作為響應值，利用響應面分析軟件分析，優選納濾濃縮工藝參數，同時與常規濃縮工藝對比，分析納濾濃縮的可行性，從而為低濃度有機水溶液中藥物成分精制純化提供技術支撐。

1材料

金銀花藥材購自安徽惠隆中藥飲片有限公司，批號20150702，經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定為忍冬科植物忍冬L japonica的干燥花蕾。

復合聚酰胺納濾膜，截留相對分子質量100，450，800（南京拓鉒醫藥科技有限公司）；綠原酸對照品（批號110753200413，質量分數≥98%），購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

Agilent 1100高效液相色譜儀，VWD檢測器（美國安捷倫公司）；TNZ1納濾分離設備（南京拓鉒醫藥科技有限公司）；RE2000B型旋轉蒸發儀（南京科爾儀器設備有限公司）；SHBⅢ型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；PB10型pH計（德國Sartorius公司）；KH250B型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）。

2方法

21金銀花供試品溶液

稱取金銀花藥材適量，分別加入10，8倍純化水提取，每次1 h，045 μm微孔濾膜過濾，合并濾液，液相檢測綠原酸濃度，進而按照試驗設計加入乙醇試劑，在保持綠原酸濃度不變的前提下，調節金銀花提取液中乙醇濃度達到試驗需求。

22納濾操作

組裝納濾膜與TNZ1納濾分離設備，取金銀花供試品溶液置于納濾系統中進行循環平衡，待綠原酸在納濾膜中的吸附解吸附達到平衡時，取樣平衡液，進而將溶液進行納濾，待納濾完成后，取樣納濾液。

23pH對綠原酸截留率的影響

在相同綠原酸濃度條件下，選擇金銀花10%乙醇為供試品溶液，調節pH為2，3，4，5，6，7，8，采用截留相對分子質量450的納濾膜進行富集濃縮，待納濾完成后，根據平衡液及納濾液中綠原酸濃度，分析pH對綠原酸截留率的影響。

24乙醇濃度對綠原酸截留率的影響

在相同綠原酸濃度條件下，pH為3，5，7，調節乙醇濃度分別為0，5%，10%，20%，30%的金銀花供試品溶液，采用截留相對分子質量450的納濾膜進行富集濃縮，待納濾完成后，根據平衡液及納濾液中綠原酸濃度，分析乙醇濃度對綠原酸截留率的影響。

25響應曲面試驗設計分析因素交互作用

對含有有機試劑的金銀花提取物溶液進行納濾富集，其中乙醇濃度和溶液pH對綠原酸截留率具有一定影響，且二者存在交互作用，基于此采用DesignExpert 806軟件，根據中藥提取液在膜分離精制過程中的關鍵影響因素：納濾膜截留相對分子質量、乙醇濃度、溶液pH作為變量，以-1，0，1代表變量水平，進行BoxBehnken設計三因素三水平實驗方案，見表1。

26減壓濃縮對比

根據響應面實驗優選出的對乙醇濃度參數，配置金銀花提取物溶液進行減壓濃縮，操作壓力-010 MPa，溫度80 ℃，取金銀花提取物溶液1 000 mL濃縮至100 mL，分析減壓濃縮對綠原酸轉移率的影響。

27綠原酸檢測

按照2015年版《中國藥典》一部，金銀花含量測定項下方法測定。

271色譜條件Hanbon Hedera ODS2色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm），流動相乙腈04%磷酸溶液（13∶87），檢測波長327 nm，流速1 mL·min-1，理論塔板數按綠原酸計算應不低于1 000。

272對照品溶液的制備精密稱取綠原酸對照品0020 1 g，置10 mL量瓶中，用流動相溶解并制成每1 mL含綠原酸201 mg的溶液。

273線性關系精密吸取綠原酸對照品溶液 005，010，020，050，100，200 mL 分別置于20 mL的量瓶中，流動相定容至刻度，Agilent 1100高效液相色譜儀檢測，以峰面積為縱坐標（Y），對照品溶液濃度為橫坐標（X），得線性回歸方程Y=1032X-1101，R2=0999 4。綠原酸在5025～201 mg·L-1，線性關系良好。

274樣品測定取待測樣品按271項下的色譜條件，進樣量10 μL，高效液相色譜儀測定峰面積，將測得的峰面積積分值代入273項回歸方程計算待測樣品中綠原酸含量。

28截留率和轉移率計算

分別精密吸取納濾（或減壓濃縮）分離過程中產生的原液、平衡液、納濾（或濃縮）液，按上述相關項下的檢測條件，計算待測組分的質量濃度。

R=（1-C1C2）×100%（1）

D=C3·VC0·V0×100%（2）

式中，R為截留率，D為轉移率，C0為原液中綠原酸濃度，C1為納濾液中綠原酸濃度，C2為平衡液中綠原酸濃度，C3為減壓濃縮液中綠原酸濃度，V0為原液體積，V為減壓濃縮液體積。

3結果

31pH對綠原酸納濾分離的影響

綠原酸截留率曲線見圖1，在10%乙醇環境中，隨著溶液pH升高其截留率呈現出隨之增加的趨勢，其中在pH 3～7升高趨勢明顯，因此在響應曲面法參數優選中著重進行考察。綠原酸截留率的變化是由于其存在狀態從游離態逐步向離子態轉變，根據納濾膜分離的道南效應[89]，從而引起截留率升高。而在pH 2～4綠原酸截留率偏低，是由于游離態存在的綠原酸在含有有機溶劑的溶液環境中的納濾溶解擴散系數增加[1011]，促進綠原酸通過納濾膜，引起截留率下降，從而提示pH與有機試劑在納濾分離時存在交互作用。

32乙醇濃度對綠原酸納濾分離的影響

不同pH條件下綠原酸截留率曲線見圖2，乙醇濃度對綠原酸截留率的影響不盡相同。當pH 3時，隨著乙醇濃度的增加，綠原酸截留率呈現出下降趨勢；當pH升高至5以上時，隨著乙醇濃度的增加，綠原酸截留率呈現則明顯升高。說明綠原酸存在狀態決定了其納濾分離行為，當以游離態形式存在時，乙醇濃度增加提升了其膜面溶解擴散系數[12]，而隨著游離態向解離態的轉化，增強了綠原酸與膜面的道南效應，導致解離態綠原酸難以進入納濾膜表面，且此效應與乙醇濃度呈現出一定正相關。當pH為7時，綠原酸在水溶液條件下的截留率接近90%，雖然具有較高的截留率，但為保證綠原酸穩定性，操作條件傾向于酸性溶液環境。基于膜截留相對分子質量、溶液pH、乙醇濃度對綠原酸截留行為的交互影響，選擇響應面法對綠原酸的分離行為及濃縮參數進行優化研究。

33響應面法分析優化納濾分離參數

根據BoxBenhnken中心組合設計原理，根據單因素試驗結果，根據前期的實驗結果，在排除溶質與膜面吸附的前提下，操作方法為：溶液溫度20 ℃、操作壓力10 MPa條件下，每組試驗平行操作3次，截留率取平均值。選取截留相對分子質量、乙醇濃度、pH 3個因素，在單因素試驗的基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法，研究三因素不同組合對綠原酸截留率的影響。試驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

331模型方程建立與顯著性檢驗利用DesignExpert 806軟件對試驗結果進行回歸擬合，得到綠原酸截留率對截留相對分子質量、乙醇濃度、pH 3個因素的二次多項回歸模型：綠原酸截留率Y=8346-1164 A+597B+2154C+350AB+1181AC-290 BC-071 A2+025 B2+10944 C2。回歸F為11259，在所考察的試驗范圍內，3個因素對綠原酸截留率影響的排序為C>A>B。多元相關系數R2=0993 1，預測R2=0937 4，調整R2=0984 3，說明模型對試驗實際情況擬合較好；P<0000 1說明該模型高度顯著，可用來進行響應值的預測，試驗設計方案正確。

332響應曲面分析及條件優化多元回歸方程式所做的響應曲面圖，見圖3。由此可對兩因素交互影響綠原酸截留率進行分析與評價，以確定最佳因素水平范圍。可以看出，所考察因素對綠原酸截留率均有不同程度的影響，其中溶液pH影響顯著，隨著溶液環境由酸到堿，綠原酸逐步離子化成鹽，根據納濾膜分離的電荷效應，以離子形式存在的綠原酸與荷負電的納濾膜之間的道南效應要強于游離態，從而引起成分截留率升高。納濾膜的截留相對分子質量的影響顯著，隨著截留相對分子質量減小，綠原酸截留率隨之增大；乙醇濃度對綠原酸截留率影響顯著，曲面斜率大，隨著乙醇濃度的升高，以游離態形式存在的綠原酸成分擴散系數增加，從而出現截留率下降的現象，而以解離態存在的綠原酸根據溶解擴散模型，由于在膜面的溶解度較低，截留率上升。

綠原酸截留率數據中A，B，C 3因素之間存在一定的交互作用，納濾膜截留相對分子質量和pH對綠原酸截留率影響交互作用顯著，隨著pH的升高或截留相對分子質量的降低，綠原酸截留率呈現上升趨勢；同理，納濾膜截留相對分子質量和乙醇濃度對綠原酸截留率影響交互作用較顯著，在pH 5條件下，隨著乙醇濃度升高或截留相對分子質量降低，綠原酸截留率呈現上升趨勢；溶液pH與乙醇濃度也表現出一定的交互作用，這主要是綠原酸存在狀態所引起的，在pH 3時，隨著乙醇濃度的增加，綠原酸截留率下降，而pH 7時，隨著乙醇濃度的增加，綠原酸截留率則明顯升高。

34納濾富集參數優化及減壓濃縮對比分析

由DesignExpert軟件優化分析，以提高綠原酸截留率和膜分離效率、保障綠原酸等酚酸類成分的穩定性[13]為目的，得到綠原酸的最佳納濾富集工藝為：截留相對分子質量450，乙醇濃度1637%，pH 613，理論計算綠原酸截留率為9500%。為了驗證回歸模型的有效性，根據擬合的最佳工藝參數和試劑操作的可行性，調整乙醇濃度1600%、pH 60，截留相對分子質量450條件下進行驗證性實驗并與減壓濃縮工藝進行對比，結果見表4。在綠原酸保留方面，納濾高于傳統的減壓濃縮，且由于乙醇含量較低，減壓濃縮效率低下。在對比試驗開展過程中發現納濾富集周期不足減壓濃縮的10%，富集效率及技術優勢明顯。

4討論

中藥分離精制過程中，含有低濃度有機試劑的中間體在溶劑回收時存在效率低下、成分損失嚴重的技術難題。納濾分離主要用于水溶液環境的富集純化，對于低濃度有機試劑的回收尚處于空白應用階段，以低濃度乙醇中綠原酸的富集為例發現，綠原酸存在狀態決定了其分離行為，說明對于低濃度有機溶劑的納濾分離主要遵循道南效應和溶解擴散理論[14]。酸性條件下的綠原酸主要以游離態形式存在，隨著乙醇濃度的增加，綠原酸更易吸附溶解在膜表面，從而促進其透過。解離態形式存在的綠原酸一方面由于道南效應產生的電荷排斥不易進入膜表面，隨著乙醇濃度的增加，其在膜面的吸附溶解行為進一步減弱，所以在2種效應的綜合作用下，綠原酸截留率顯著升高。

膜分離技術具有分離參數易控、分離行為重現性、參數可線性放大等技術優勢，在對低濃度乙醇納濾分離時，需要注意納濾液中乙醇濃度的變化以及乙醇對納濾膜的溶脹損傷。在納濾處理含有低濃度乙醇溶劑時，進料液與納濾液中乙醇濃度未出現明顯變化，提示在傳統的精制分離產生的含低濃度有機試劑水溶液，可通過納濾分離技術處理，在去除溶質成分的同時不改變溶劑比例，可提升生產分離效率。同時，在低濃度乙醇的浸泡下，納濾膜通量出現下降趨勢，說明膜材質發生溶脹，納濾膜孔徑縮小，降低了膜通量提升了截留效率，但未對膜完整性產生明顯影響。

采用響應面分析法中的BoxBehnken模式，對納濾濃縮參數進行優化篩選，數學模型擬合程度高，實驗誤差小，且優于傳統的減壓濃縮工藝，可用于實際生產預測。得到優化工藝條件為：截留相對分子質量450，乙醇濃度1600%，pH 600，在此條件下綠原酸截留率為9260%，通過對低濃度乙醇的納濾分離，不僅為中藥成分精制純化提供技術支撐，而且對于中藥資源的合理化利用及其制藥廢水處理帶來新的機遇。

[參考文獻]

[1]彭國平，蕭偉，倪健 中藥制藥化學[M] 北京：中國中醫藥出版社， 2016：123

[2]時浩，李存玉，瞿其揚，等丹參水提液的納濾濃縮工藝考察[J]中國實驗方劑學雜志，2014，20（17）：43

[3]李存玉，馬赟，李紅陽，等 超濾納濾聯用優化益母草生物堿的濃縮工藝[J] 中國中藥雜志， 2017， 42（1）： 42

[4]劉臻 有機溶劑對納濾膜作用機理研究[D] 北京：北京化工大學， 2007

[5]中國藥典一部[S]2015：221

[6]郭滿滿，肖卓炳，于華忠，等熱重法研究綠原酸的熱穩定性、分解動力學及貯存期[J]藥物評價研究，2011，34（5）：348.

[7]金林，趙萬順， 郭巧生，等響應面法優化白芍提取工藝的研究[J] 中國中藥雜志， 2015， 40（15）：2988

[8]Levenstein R， Hasson D， Semiat R Utilization of the Donnan effect for improving electrolyte separation with nanofiltration membranes[J]J Membr Sci， 1996， 116（1）：77

[9]趙彥彥，袁其朋有機相納濾分離過程中濃度、電荷、溶劑對溶質截留行為的影響[J]膜科學與技術，2006， 26（5）：31

[10]Andriy Yaroshchuk， Merlin L Bruening， Edxon Eduardo Licón Bernal SolutionDiffusionElectroMigration model and its uses for analysis of nanofiltration， pressureretarded osmosis and forward osmosis in multiionic solutions [J] J Membr Sci， 2013， 447：463

[11]Shaaban A M F， Hafez A I， AbdelFatah M A， et al Process engineering optimization of nanofiltration unit for the treatment of textile plant effluent in view of solution diffusion model [J] Egypt J Petrol， 2016， 25（1）：79

[12]吳芳，封莉，張立秋 納濾去除水中中性藥物的預測模型[J]. 膜科學與技術， 2016， 36（4）：97

[13]朱鵬，苗瀟磊，陳勇 綠原酸、隱綠原酸和新綠原酸在中性和堿性pH條件下的降解動力學[J]藥學學報，2016，51（1）：122

[14]李存玉，馬赟，龔柔佳，等 響應面分析法耦合調節Donnan效應優化苦參提取液的納濾濃縮工藝[J] 中草藥， 2016， 47（19）：3395

[15]段金廒，宿樹蘭，郭盛，等 中藥資源產業化過程廢棄物的產生及其利用策略與資源化模式[J] 中草藥， 2013， 44（20）：2787

[責任編輯孔晶晶]