山梨獼猴桃根化學成分及細胞毒活性研究

黃初升　馬思遠　劉紅星　陸倩　石靈高　廖娜　韋柳斌

[摘要]探究山梨獼猴桃Actinidia rufa根的化學成分。采用葡聚糖凝膠色譜法、薄層色譜硅膠色譜法、高效液相色譜法等方法分離得到9個化合物，鑒定為：2α， 3β， 19α， 23， 24五羥基烏蘇12烯28OβD吡喃葡萄糖苷（1）、2α， 3α， 19α， 24四羥基烏蘇12烯28OβD吡喃葡萄糖苷（2）、2α， 3α， 24三羥基烏蘇12烯28酸（3）、2α， 3α， 24三羥基齊墩果12烯28酸（4）、2α， 3α， 23， 24四羥基烏蘇12烯28酸（5）、2α， 3β， 23， 24四羥基烏蘇12烯28酸（6）、2α， 3β， 23三羥基烏蘇12烯28酸（7）、2α， 3β， 23三羥基烏蘇12， 20（30）二烯28酸（8）、2α， 3α， 24三羥基烏蘇12， 20（30）二烯28酸（9），其中化合物1和2為首次從該屬植物中分離得到。細胞毒活性測試結果顯示化合物2～4 對人卵巢癌細胞株SKVO3和人甲狀腺乳頭狀癌細胞株TPC1具有強的細胞毒活性（IC50在1099～1641 μmol·L-1），而化合物3，4對人宮頸癌細胞株HeLa具有強的細胞毒活性，IC50分別為1553，1307 μmol·L-1。

[關鍵詞]獼猴桃屬； 山梨獼猴桃； 三萜； 抗腫瘤

[Abstract]To investigate the chemical compounds from the roots of Actinidia rufa， nine compounds were isolated by various column chromatography on silica gel and Sephadex LH20， and high performance liquid chromatography （HPLC） Their structures were elucidated as 2α， 3β， 19α， 23， 24pentahydroxyurs12en28oic acid28OβDglucopyranoside （1）， 2α， 3α， 19α， 24tetrahydroxyurs12en28oic acid28OβDglucopyranoside （2）， 2α， 3α， 24trihydroxyurs12en28oic acid （3）， 2α， 3α， 24trihydroxyolean12en28oic acid （4）， 2α， 3α， 23， 24tetrahydroxyurs 12en28oic acid （5）， 2α， 3β， 23， 24tetrahydroxyurs12en28oic acid （6）， 2α， 3β， 23trihydroxy12en28oic acid （7）， 2α， 3β， 23trihydroxyurs12， 20（30）dien28oic acid （8）， and 2α， 3α， 23trihydroxyurs12， 20（30）dien28oic acid （9） Compounds 1 and 2 were isolated from the Actinidia genus for the first time Compounds 2， 3， and 4 showed cytotoxic activity against human SKVO3 and TPC1 cancer cell lines with IC50 values ranging from 1099 to 1641 μmol·L-1， compounds 3 and 4 have cytotoxic activity against human HeLa cancer cell line with IC50 values of 1553 and 1307 μmol·L-1， respectively

[Key words]Actinidia； Actinidia rufa； triterpenoids； antitumor

山梨獼猴桃Actinidia rufa Planch為獼猴桃科獼猴桃屬植物，藥用其根或根皮[1]，產于廣西山區龍勝、德保等縣。獼猴桃屬植物自古以來就有藥用作用，古代藥書《山海經·中山經》、《本草拾遺》、《本草綱目》等均有記載[1]；中醫認為其果性寒，味酸、甘，能調理中氣、生津潤燥、解熱除煩、通淋，用于治療消化不良、食欲不振、嘔吐、燒燙傷；其根或根皮性寒、味苦澀，能清熱解毒、活血消腫、祛風利濕，用于治療肝炎、水腫、風濕性關節炎、跌打損傷、痢疾、絲蟲病、淋巴結核、癰癤腫毒、帶下、胃癌、乳腺癌等[2]。迄今，該屬植物研究較多的主要是美味獼猴桃和中華獼猴桃，研究部位集中于果實和根部。

本課題組對山梨獼猴桃根進行了化學成分研究，分離得到7個五環三萜類化合物和2個烏蘇烷型三萜皂苷，分別鑒定為：2α，3β，19α，23，24五羥基烏蘇12烯28OβD吡喃葡萄糖苷（1）、2α，3α，19α，24四羥基烏蘇12烯28OβD吡喃葡萄糖苷（2）、2α，3α，24三羥基烏蘇12烯28酸（3）、2α，3α，24三羥基齊墩果12烯28酸（4）、2α，3α，23，24四羥基烏蘇12烯28酸（5）、2α，3β，23，24四羥基烏蘇12烯28酸（6）、2α，3β，23三羥基烏蘇12烯28酸（7）、2α，3β，23三羥基烏蘇12，20（30）二烯28酸（8）、2α，3α，24三羥基烏蘇12，20（30）二烯28酸（9），其中化合物1和2為首次從該屬植物中分離得到。細胞毒活性測試結果顯示化合物2～4 對人卵巢癌細胞株SKVO3和人甲狀腺乳頭狀癌細胞株TPC1具有較強的細胞毒活性[IC50在1099～1641 μmol·L-1]，而化合物3和4對人宮頸癌細胞株HeLa具有較強的細胞毒活性，IC50分別為1553，1307 μmol·L-1。

1材料

Bruker 300超導型核磁共振波譜儀（德國布魯克公司，TMS內標）；紅外光譜儀（賽默飛世爾公司Nicolet 6700型）；質譜儀（Finnigan LCQ advatage MAX）；分析型高效液相（北京北方威瑪龍公司，檢測器UC329）；制備型高效液相（大連依利特，P230P型，檢測器DAD230+）；C18分析型色譜柱（46 mm×250 mm，5μm，月旭公司）；C18制備型色譜柱（

212 mm×250 mm，5 μm，月旭公司）；Sephadex LH20葡聚糖凝膠（美國GE公司）；薄層色譜硅膠（青島海洋化工廠）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX50FB 型，上海申安醫療器械廠）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHQ9070A型，上海精密實驗設備有限公司）；電熱恒溫水箱（DKB8A 型，上海精密實驗設備有限公司）；CO2培養箱（MCO5AC 型，日本SANYO Electric COLtd）；倒置顯微鏡（CKX41 型，日本Olympus公司）；臺式低速冷凍離心機（L535R 型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；酶標儀（Multiskan MK3型，上海賽默飛世爾儀器有限公司）；超凈臺（VFB1500型，上海毅昕實驗室設備有限公司）；胎牛血清（FBS）（美國 Gibco 公司）；青霉素鏈霉素溶液（碧云天生物研究所）；胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；RPMI1640培養基（上海立菲生物技術有限公司）；四氮噻唑藍（MTT）（美國Sigma公司）；7種人腫瘤細胞株：口腔表皮樣癌Kb、宮頸癌HeLa、胃癌SGC7901、鼻咽癌CNE2、肺癌A549、卵巢癌SKVO3、甲狀腺乳頭狀癌TPC1（由江陰康眾康民生物醫藥技術公司和廣西醫科大學提供）；山梨獼猴桃根于2002年6月在廣西植物研究所苗圃采集，由中國科學院廣西植物研究所李瑞高和梁木源研究員鑒定，標本存于中國科學院廣西植物研究所，標本號為020617。

2提取與分離

山梨獼猴桃根用95%乙醇常溫提取3次，提取液減壓回收溶劑得到總浸膏，此項工作由廣西大學陳希慧教授處理完成。取浸膏5920 g懸浮于水中，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓回收溶劑，得到石油醚部位772 g，乙酸乙酯部位1787 g，正丁醇部位512 g。正丁醇部位過ODS開放柱，甲醇水洗脫（3∶7～1∶0），得到FrsC1～C7，FrsC1 （360 mg）和FrsC2 （230 mg）分別經凝膠柱色譜（氯仿甲醇1∶1）分離得到相應的化合物1（21 mg）和2（15 mg）；FrsC4 （230 mg）經制備型高效液相純化（甲醇水60∶40），得到化合物5 （18 mg）和6 （13 mg）。乙酸乙酯部位經硅膠柱色譜（氯仿甲醇20∶1～5∶1）分離，得到FrsB1～B9，FrsB4 （313 mg）經制備HPLC純化（甲醇水65∶35）得到化合物3 （28 mg）和4 （31 mg）；FrsB6 （580 mg）經硅膠柱層析（氯仿甲醇15∶1）分離得到化合物7 （35 mg）；FrsB8 （340 mg）制備HPLC純化（甲醇水70∶30）得到化合物8 （15 mg）和9 （20 mg）。

3結構鑒定

4細胞毒活性（MTT 法）

收集生長良好的腫瘤細胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養基配制成5×104個/mL細胞懸液，于96孔培養板內接種，每孔200 μL（含1×105個腫瘤細胞），置37 ℃，5% CO2溫箱內培養24 h后棄原液，加入樣品溶液200 μL，繼續培養48 h，棄去培養液，每孔加入MTT 溶液（50 g·L-1，PBS 配制） 20 μL，37 ℃孵育4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 100 μL，振蕩10min，用酶標儀測其吸光度[10]。

采用MTT 法，測定了化合物1～9對7種人腫瘤細胞株：口腔表皮樣癌Kb、宮頸癌HeLa、胃癌SGC7901、鼻咽癌CNE2、肺癌A549、卵巢癌SKVO3、甲狀腺乳頭狀癌TPC1細胞株的細胞毒活性，測試結果見表1。

結果顯示化合物9對人口腔表皮樣癌細胞株Kb呈現一定的細胞毒活性，IC50為2879 μmol·L-1，而化合物1～3，5和7 對該細胞株呈現較弱的細胞毒活性，IC50在3158～4563 μmol·L-1；化合物3和4對人宮頸癌細胞株HeLa呈現強的細胞毒活性，IC50分別為1553，1307 μmol·L-1，而其余化合物對該細胞株呈現較弱的細胞毒活性，IC50在3359～4931 μmol·L-1；化合物5～9對人鼻咽癌細胞株CNE2呈現一定的細胞毒活性，IC50在2363～3946 μmol·L-1；化合物1～3，5和7對人胃癌細胞株SGC7901呈現較弱的細胞毒活性，IC50在3255～4791 μmol·L-1；化合物1，4～6和8對人肺癌細胞株A549呈現中等強度的細胞毒活性，IC50在2263～2996 μmol·L-1，其余化合物對該細胞株呈現較弱的細胞毒活性，IC50在3266～

4285 μmol·L-1；化合物2～4對人卵巢癌細胞株SKVO3呈現強的細胞毒活性，IC50分別為1099，1641，1404 μmol·L-1，化合物1，7，9對該細胞呈現一定的細胞毒活性IC50在2123～3751 μmol·L-1；化合物2～4對人甲狀腺乳頭狀癌細胞株TPC1呈現強的細胞毒活性，IC50分別為1434，1238，1123 μmol·L-1，而化合物1和9對該細胞呈現較弱的細胞毒活性，IC50分別為3979，4570 μmol·L-1。

[參考文獻]

[1]崔志學 中國獼猴桃[M] 濟南：山東科技出版社，1993

[2]陶愛麗，文禎中，闞云超，等 獼猴桃屬植物研究進展[J] 南陽師范學院學報， 2005， 4（3）： 56

[3]Fumiko Abe，Tatsuo Yamauchi Trachelosperosides， glycosides of 19αhydroxyursanetype triterpenoids from Trachelospermum asiaticum[J] Chem Pharm Bull， 1987， 35（5）： 1748

[4]Xu Yixin， Xiang Zhaobao， Jin Yongsheng，et al Two new triterpenoids from the roots of Actinidia chinensis[J] Fitoterapia， 2010， 81： 920

[5]XIN Hailiang， WU Yingchun， XU Yanfeng，et al Four triterpenoids with cytotoxic activity from the leaves of Actinidia valvata[J] Chin J Nat Med， 2010， 8（4）： 260

[6]李火云， 焦珂，張鵬，等 擬缺香茶菜化學成分研究[J] 中草藥，2014， 45（2）： 154

[7]肖世基，何達海，丁立生，等 獼猴桃藤山柳莖葉中的三萜化合物[J] 中國中藥雜志， 2013， 38（3）： 358

[8]周媛媛，蔣艷秋，孟穎，等 青龍衣活性部位的化學成分研究[J] 中成藥，2015， 37（2）： 332

[9]李雯，田新雁，肖朝江，等 黃花香茶菜地下部分化學成分及生物活性研究[J] 中草藥，2013， 44（9）： 1091

[10]李杰，劉玉琴 MTT 法腫瘤研究中的改良和應用進展[J] 中國腫瘤臨床，1998， 25（4）： 312

[責任編輯丁廣治]