苯乙醇苷類化合物與ctDNA的相互作用

袁歡　王濤　祝晨蔯　吳愛芝　林朝展

[摘要]以中性紅為分子探針研究2種苯乙醇苷類化合物（PhGs）毛蕊花糖苷和連翹酯苷B在生理條件下與小牛胸腺DNA（ctDNA）之間的相互作用。熒光光譜、紫外光譜、黏度、DNA熱變性實驗和分子對接結果表明：這2種PhGs主要采用氫鍵作用以溝區方式結合到ctDNA雙螺旋小溝中，毛蕊花糖苷與DNA結合作用更強。

[關鍵詞]苯乙醇苷； ctDNA； 中性紅； 分子對接

[Abstract]In physiological condition， the interaction of acteoside and forsythoside B with calf thymus DNA using neutral red （NR） as a fluorescence probe were investigated by fluorescence， UVvisible spectrophotometry， viscosity， DNA melting techniques， and molecular docking It is observed that acteoside and forsythoside B can react with DNA The major mode of recognition between drug and DNA is groove binding by hydrogen bonds， and the interaction of acteoside with DNA is stronger than that of forsythoside B

[Key words]phenylethanoid glycosides； ctDNA； neutral red； molecular docking

眾所周知，脫氧核糖核酸（DNA）是生命體內基因表達的重要物質基礎。研究藥物小分子與DNA之間的相互作用機理，是當今生命科學領域共同關注的課題。查閱文獻發現，糖苷藥物中的糖基作為藥物分子的一部分不僅可以調節脂水分配系數、調節血漿半衰期、改善藥動學性能，而且其糖基片段上豐富的羥基對DNA等作用靶點具有特異性的識別與結合功能，因此糖基作為直接功能基團可以存在于許多以DNA為靶點的抗腫瘤化療藥物中[1]。含雙糖和三糖的苯乙醇苷類成分（PhGs） 毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B在紫珠屬植物Callicarpa L中廣泛存在，藥理實驗顯示這2個化合物具有良好的抗癌和抗炎活性[23]。PhGs抑制惡性細胞增生的能力主要取決于苯乙基上的取代基，表現為3，4鄰二羥基苯乙基芳香體系有相當強的抗腫瘤作用[4]。毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B中正含有這樣的結構片斷，因此研究二者與DNA的微觀相互作用具有重要意義。

DNA本身熒光極弱，常用溴化乙錠作為熒光探針，但其毒性大，具有強致癌性，污染環境。與溴化乙錠相比，中性紅（NR）作為熒光探針穩定性好、毒性低[5]。本文將以NR為分子探針，選擇紫珠屬植物中富含的2個PhGs成分毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B作為藥物小分子，結構見圖1，采用光譜法和分子對接技術首次研究其與ctDNA的相互作用，旨在闡明PhGs與DNA的作用方式、糖基片段對作用方式的影響。實驗結果為以DNA為靶標的藥物分子設計提供有益探索，同時也為紫珠屬植物的深入臨床醫學研究提供重要理論依據。

1材料

F2500熒光光度計（Hitachi公司），UV1000紫外可見光譜儀（上海天美科學儀器有限公司），CHIRASCAN圓二色光譜儀（英國應用光物理公司），VG ZABHS質譜儀（英國VG公司），AVANCE400超導核磁共振儀（瑞士Bruker公司），伍氏黏度計。

毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B（從紫珠屬植物藤紫珠中分離得到，純度>98%）溶液：配制成濃度為128×10-3mol·L-1的水溶液。中性紅（上海阿拉丁，純度99%）溶液：配制成100×10-5mol·L-1的水溶液。DNA（華美生物工程），溶液濃度以A260 nm/A280 nm>18衡量，濃度以260 nm處吸光度來確定（ε=6 600 L·mol-1·cm-1），4 ℃以下避光保存。緩沖液由01 mol·L-1Tris溶液和01 mol·L-1HCl配制（pH 740），實驗過程中所用試劑均為分析純，用水為二次蒸餾水。

2方法

21紫外測試在5 mL量瓶中，加入1 mL的trisHCl緩沖溶液和50μL的藥物溶液，分別在容量瓶中依次加入不同體積的DNA溶液，trisHCl溶液定容。室溫放置20 min后，以緩沖液為參比，測定200～400 nm紫外圖譜。間隔05 nm，狹縫2 nm。

22熒光試驗分別移取濃度為100×10-3 mol·L-1的DNA溶液50 μL，濃度為100×10-3 mol·L-1的NR溶液50 μL于4 mL石英吸收池中，加入緩沖液TrisHCl 3 mL，用微量注射器進行熒光滴定，每次加入10 μL藥物溶液，混合均勻，靜置5 min。以467 nm為激發波長，入射和發射狹縫分別為5 nm，在熒光光度計上記錄500～700 nm波長的發射光譜。

23DNA熔點試驗配制2組NRDNA溶液，其中1組加入適量藥物，水浴加熱，在40～100 ℃，每隔5 ℃監測DNA在260 nm處吸光值的變化。以fss=（A-A0）/（Af -A0）為縱坐標（A，Af 分別為起始吸光度和最終吸光度，A為表觀吸光度），溫度為橫坐標作圖，得到DNA的熱變性溫度曲線圖。

24黏度試驗DNA濃度固定為440 ×10-4 mol·L-1，藥物濃度依次增大，溫度恒定在（25±01） ℃，反應20 min后，進行測量。數據以（η/η0）1/3對藥物濃度作圖。η代表DNA在藥物體系時的黏度，η0代表DNA單獨存在時的黏度。

25分子對接藥物小分子初始結構由分子模擬軟件SybylX13 獲得，運用Tripos力場和GasteigerHückel電荷對分子結構進行優化。DNA晶體結構來自PDB蛋白質數據庫（編號425D）。采用Surflex程序進行分子對接時，考慮了小分子10個構象，結合自由能最低的構象用來做進一步理論分析。dsDNA分子優化前去除其結構中的水分子。對接原型分子通過選擇堿基對生成，對接過程中考慮了配體小分子環的柔性。

3結果與討論

31紫外光譜NR與DNA相互作用的紫外可見光譜圖，見圖2，顯示了DNA的加入對NR吸收光譜的影響。圖2中曲線 （a）是NR的吸收譜圖，可以看出其最大吸收峰在462 nm，DNA的加入使得NR在462 nm處的吸收峰發生了明顯減色效應和一定程度的紅移現象，說明NR與DNA發生了嵌插作用[6]。545 nm處附近出現了1個新吸收峰，此峰應該是NRDNA復合物的吸收峰[7]。462 nm處明顯的減色效應表明NR和DNA堿基之間緊密靠近，DNA中大量堿基層層堆積，使得雙螺旋結構內部形成一個強大的疏水區。紅移現象表明NR嵌入到DNA堿基對后，周圍所處的環境發生了改變，DNA與溶劑水分子形成氫鍵的能力降低。結果表明，NR主要以嵌插方式與DNA結合形成復合物。

毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B與DNA相互作用的紫外可見吸收光譜，見圖3。這2個PhGs由于丙烯酸酯雙鍵與苯環共扼振動發生在333 nm附近，因而這類成分在333 nm附近具有特定的吸收光譜。與DNANR體系的吸收圖譜比較，見圖2。當PhGs溶液中不斷增加DNA濃度時，這類小分子在333 nm處的最大吸收峰強度幾乎沒有發生紅移和減色效應，表明這2個小分子與DNA的作用方式不是典型

32藥物對NRDNA體系熒光猝滅程度的影響NR在pH 740水溶液中熒光很弱，當有DNA存在時，NR在DNA中的嵌插式結合會使體系熒光強度明顯增強。2種PhGs逐漸加入到NRDNA體系時的熒光猝滅曲線，其中F0為不加藥物時在602 nm處的熒光強度，F為藥物存在時在602 nm處的熒光強度，見圖4。熒光光譜顯示隨著PhGs加入到NRDNA體系，熒光峰的形狀和位置并沒有改變，但其熒光強度隨著藥物濃度的增加而不斷降低，并且2個PhGs化合物對NRDNA體系熒光猝滅的程度存在明顯差異，猝滅程度毛蕊花糖苷明顯大于連翹酯苷 B，表明PhGs與NR之間存在競爭結合，間接反映了毛蕊花糖苷與DNA的結合強度大于連翹酯苷B。熒光猝滅的原因可能是富含羥基的PhGs參與了和NR競爭結合DNA的過程，使得NR和DNA結合力減弱，從而導致體系熒光強度降低，推測氫鍵作用對PhGs和DNA的結合具有重要影響[9]。

33藥物對NRDNA熱變性溫度的影響通常把DNA雙螺旋結構失去一半時的溫度稱為該DNA的熔點或熔接溫度，用Tm表示，藥物與DNA的相互作用會影響Tm。嵌插作用能夠使雙螺旋結構更加穩定，因而會使Tm增加5～8 ℃，而溝區結合不會使Tm有明顯增加[10]。當fss=05時所對應的溫度就是Tm，當藥物加入到DNANR后，體系Tm減小，再次證明藥物與DNA的結合不是嵌插式結合，Tm的降低可能是由于藥物與DNA溝區的結合作用，一定程度上改變了體系的構象，使體系穩定性降低，見圖5。

34黏度試驗黏度測定一般被認為是確定鍵合模式最有力的證據之一。當藥物以嵌插方式進入DNA雙螺旋堿基對時，相鄰堿基對之間的距離會增大以便容納插入的配體，導致DNA雙螺旋結構膨脹變粗變長，DNA溶液的黏度會增大；而以溝區結合等非嵌插方式與DNA作用時，DNA 結構不會伸展，此時DNA 溶液的黏度無明顯變化[11]。DNA在不同濃度藥物存在時的相對黏度變化見圖 6。結果顯示，加入藥物后，DNA的相對黏度變化并未明顯增加，表明藥物與DNA的作用未引起DNA雙螺旋骨架的扭曲變化，推測其與DNA作用方式為溝區結合。

35分子對接利用分子對接技術可以直觀形象的反映藥物與DNA 的結合情況，這有助于從理論上確定小分子與DNA相互作用的機制和模式[1214]。結合毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B與DNA相互作用的實驗結果可知，毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B主要以溝區方式與DNA結合。因此分子對接過程中選擇DNA分子的雙螺旋小溝作為PhGs結合靶點，2個小分子與DNA作用的最佳分子對接模型，見圖7。藥物與DNA相互作用過程中根據分子對接分值（total score）值計算得到的結合常數Ka和ΔG，見表1。

對接結果顯示，毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B可以緊密結合在ctDNA的GGTAC小溝區域，形成雙螺旋d（GGTACCCATG）2DNA復合物。2個PhGs中的苯乙基、咖啡酰基和糖環上的羥基可與DNA上的胸腺嘧啶、腺嘌呤、戊糖、磷酸之間生成多個氫鍵，即PhGs與DNA二者之間存在強的氫鍵相互作用，這些氫鍵的存在對于PhGs結合在DNA小溝區域起著至關重要的作用。毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B與DNA結合時的total score值分別為753和711，結合常數Ka分別為339×107和129×107，結合吉布斯自由能變化值ΔG分別為-4299，-4059 kJ·mol-1，計算結果表明毛蕊花糖苷與DNA的結合能力大于連翹酯苷 B，結論與實驗結果吻合。毛蕊花糖苷中主要是苯乙基、葡萄糖基和咖啡酰基結合于DNA小溝，鼠李糖暴露在DNA鏈外；而連翹酯苷 B中主要是苯乙基、葡萄糖基和芹糖結合于DNA小溝，咖啡酰基和鼠李糖暴露在DNA鏈外，表明PhGs中心葡萄糖6位被芹糖取代后的角度更有利于小分子與DNA雙螺旋小溝匹配，見圖7，。原因可能是小分子中的這些多元環由扭轉的自由鍵連接，由此可產生合適的扭轉力來匹配小溝區的螺旋曲線，并在DNA雙螺旋鏈中AT富集的小溝區邊緣主要通過氫鍵作用形成接觸。這種選擇性作用可以非嵌入性地捆縛住DNA，阻止DNA的模板作用，從而達到抗腫瘤、抗病毒的目的。

4結語

本文用光譜學方法和分子對接技術探討了生理條件下PhGs類成分毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B分別與DNA的相互作用。結果表明：結構類似的PhGs由于糖基種類、數目和取代位置的不同導致了與DNA結合模式的差異，這對于從分子水平深入理解PhGs化合物與DNA的作用機制，以及如何修飾一系列結構類似的PhGs藥物促進其在體內吸收和轉運具有極為重要的意義。另外，探究結構不同的PhGs與DNA之間可能的序列選擇性為PhGs可不同程度修復損傷的DNA提供了合理解釋。

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[責任編輯丁廣治]