百事樂膠囊對慢性應激抑郁大鼠海馬磷脂酰肌醇—3激酶信號通路相關因子的影響

孟盼 杜青 張秀麗 柳卓 向韻 劉林 王宇紅

摘要：目的 觀察百事樂膠囊對慢性輕度不可預見性應激（CUMS）大鼠海馬磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信號通路關鍵因子表達的影響，探討其抗抑郁的作用機制。方法 將SD大鼠隨機分為空白組、模型組、氟西汀組和百事樂膠囊高、中、低劑量組，每組10只。采用CUMS加孤養的方式建立抑郁模型，造模同時灌胃給藥，連續21 d。采用新奇攝食實驗和Open-field實驗評價行為學變化，ELISA檢測血清單胺神經遞質，免疫熒光和Western blot檢測大鼠海馬PI3K、蛋白激酶B（AKT）、血清糖皮質激素調節蛋白激酶1（SGK1）表達。結果 與空白組比較，模型組大鼠攝食潛伏期顯著延長，水平和垂直活動次數明顯減少（P<0.01），血清單胺神經遞質含量下降（P<0.01），海馬PI3K、AKT表達顯著降低且SGK1表達顯著升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，百事樂膠囊高、中劑量組大鼠攝食潛伏期顯著縮短（P<0.05），水平和垂直活動次數顯著增加（P<0.01），血清單胺神經遞質含量顯著升高（P<0.05，P<0.01），海馬PI3K、AKT顯著增加且SGK1表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結論 百事樂膠囊可通過緩解模型大鼠抑郁樣行為，調控海馬PI3K信號通路關鍵因子，發揮其抗抑郁的功效。

關鍵詞：百事樂膠囊；抑郁癥；海馬；磷脂酰肌醇-3激酶；蛋白激酶B；血清糖皮質激素調節蛋白激酶1；單胺神經遞質；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.010

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）08-0041-05

Effects of Baishile Capsules on Hippocampal PI3K Signaling Pathway in Chronic Mild Unpredictable Stress Rats MENG Pan1， DU Qing1， ZHANG Xiu-li1， LIU Zhuo1， XIANG Yun1， LIU Lin2， WANG Yu-hong1，2 （1. Training Bases of Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry， Changsha 410208， China； 2. First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）

Abstract： Objective To observe the effects of Baishile Capsules on the hippocampal PI3K signaling pathway in chronic mild unpredictable stress （CUMS） rats； To discuss its mechanism of action for anti-depression. Methods SD rats were randomly divided into 6 groups， control group， model group， fluoxetine group， Baishile Capsules high-， medium- and low-dose groups， with 10 rats in each group. The cums depression model was established， and gavage for medication was conducted at the same time for 21 days in a row. The behavioral changes of rats in each group were detected by the novel feeding experiment and Open-field experiment； monoamine neurotransmitter in serum were detected by ELISA； the expressions of PI3K， AKT and SGK1 in rat hippocampus were detected by immunofluorescence and Western blot test. Results Compared with the control group， feeding latency of rats in model

基金項目：國家自然科學基金青年基金（81403387）；湖南省教育廳一般項目（14C0862）；中醫內科學省部共建教育部重點實驗室開放基金（ZYNK201503）；湖南中醫藥大學校級青年基金（99820001-147）

通訊作者：王宇紅，E-mail：wyh107@126.com

group was significantly prolonged （P<0.01）， horizontal and vertical activities were significantly reduced （P<0.01）； the content of serum monoamine neurotransmitter decreased （P<0.01）； the expressions of PI3K and AKT in hippocampus decreased， while the expression of SGK1 increased （P<0.01， P<0.05）. Compared with the model group， Baishile Capsule high- and medium-dose groups can significantly shorten the incubation period of feeding rats （P<0.05）， and increase the number of horizontal and vertical activities （P<0.01）； the 5-HT and NE levels in serum were significantly elevated （P<0.05， P<0.01）； the expressions of PI3K， AKT in hippocampal increased； the expression of SGK1 decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Baishile Capsules can alleviate the depression like behavior in rat models， and regulate key factors of hippocampal PI3K signaling pathway， so as to exert antidepressant effects.

Key words： Baishile Capsules； depression； hippocampus； PI3K； AKT； SGK1； rats

抑郁癥是一種以思維遲緩、意志活動減退和認知功能損傷等為主要特征的精神障礙性疾病，具有高患病率、復發率及自殺率，已成為威脅人類身心健康的殺手。抑郁癥的發病機制復雜，涉及單胺遞質系統功能和下丘腦-垂體-腎上腺軸功能紊亂等多種假說，但目前公認的假說都以海馬作為其發病的靶部位。磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號通路與抑郁癥的發生和發展密切相關，其下游信號主要分為依賴于蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的和非依賴于AKT的，可參與調節細胞的生長、發育、分化和存活。百事樂膠囊由貫葉連翹、姜黃、人參組成，是臨床經驗方。本課題組前期研究發現，其可有效降低海馬神經元凋亡[1]，促進海馬神經再生[2]，增加海馬神經突觸可塑性[3]，但具體作用機制還未明了。基于此，本實驗以PI3K信號通路關鍵因子為切入點，采用百事樂膠囊對慢性輕度不可預見性應激（CUMS）大鼠進行干預，深入探究其發揮抗抑郁功效的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，鼠齡8周，體質量220～250 g，湖南斯萊科景達動物中心，動物許可證號SCXK（湘）2015-0003。飼養于室溫（24±1）℃、濕度（55±10）%環境，明暗交替12 h/12 h，自由飲水攝食。

1.2 藥物

百事樂膠囊，湖南省中醫藥研究院，批號20150414；氟西汀膠囊，禮來（蘇州）制藥有限公司，批號0722A。

1.3 主要試劑與儀器

去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）ELISA試劑盒，R&D;公司；兔抗大鼠PI3K、AKT、血清糖皮質激素調節蛋白激酶1（SGK1），英國Abcam公司；FITC熒光二抗，美國Proteintech公司；近紅外熒光二抗Alexa Fluor?700，美國LI-COR Odyssey；即用型SABC液、正常山羊血清封閉液、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司，Protein Marker，美國MBI Fermentas公司。生物組織切片機（THERMO SCIENTIFIC），NC膜（美國Millipore公司），開野視頻跟蹤系統（Panlab），萬分之一電子天平（日本島津），超純水儀（威立雅水務集團），正置熒光顯微鏡及圖像分析系統（Cail Zeiss），近紅外雙色激光成像系統（美國LI-COR Odyssey）。

2 實驗方法

2.1 分組和給藥

所有大鼠適應性飼養3 d，按體質量隨機分為空白組、模型組、氟西汀組（5.4 mg/kg）組和百事樂高、中、低劑量組（2.88、1.44、0.72 g/kg），每組10只。造模同時灌胃給藥，給藥體積10 mL/kg，空白組和模型組給予等量純凈水。每日1次，連續21 d。

2.2 造模

參照文獻[2]方法，采用CUMS加孤籠飼養方法復制抑郁模型。空白組每籠飼養5只，不給予任何刺激；其余各組單籠飼養，每日隨機給予不同刺激，共21 d，包括禁食24 h、禁水24 h、傾籠45 ℃、夾尾1 min、4 ℃冰浴15 min、晝夜顛倒24 h、噪音5 min，每日隨機安排1種，平均每種刺激使用3次。

2.3 行為學檢測

2.3.1 Open-field實驗 第22日，各組大鼠進行行為學檢測。大鼠從80 cm×80 cm×40 cm、底面均分為25個方格的黑色敞箱的角落放入，適應1 min后，拍攝并記錄各組大鼠3 min內水平活動次數（四爪皆進入方可記1次），垂直活動次數（兩爪騰空放下記1次），以水平和垂直活動次數作為評價其抑郁行為的指標。

2.3.2 新奇攝食實驗 Open-field實驗結束后，各組大鼠禁食不禁水，第23日放入微光環境通用隔音試驗箱內，箱內中央放入事先稱好的飼料，安靜環境下使用動物行為采集監控系統觀察并記錄6 min，其中適應2 min，記錄后4 min大鼠進入箱內首次開始接觸并攝入飼料的時間（記為攝食潛伏期），以此作為實驗動物在陌生環境下情緒變化的行為學評價指標。

2.4 ELISA檢測血清單胺神經遞質含量

第23日大鼠行為學測試結束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉，腹主動脈取血，促凝管收集，3000 r/min離心10 min，血清放入1.5 mL離心管，-80 ℃保存，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

2.5 樣本采集

行為學測試結束后，各組大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，仰位固定于手術臺上，腹腔取血。每組取5只大鼠，快速剖開胸部使心臟暴露，用灌注穿刺針沿著心臟的縱軸方向經心尖部插入左心室至主動脈根部，立即快速灌入約4 ℃生理鹽水250 mL，待流出的液體澄清后慢速灌注4%多聚甲醛溶液（4 ℃）至動物四肢僵硬后取出腦組織標本，固定于4%多聚甲醛24 h，75%、95%、100%梯度乙醇脫水，浸蠟，包埋，切片，備用。每組再取5只大鼠，采血后直接取全腦后分離雙側海馬，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。

2.6 免疫熒光檢測

切片常規脫蠟、沖洗，滴加封閉液，37 ℃孵育30 min，去除多余液體；分別加入PI3K、AKT、SGK1的一抗（1∶1000稀釋），37 ℃溫育30 min，4 ℃過夜。0.01 mol/L PBST漂洗5 min×3次；加FITC熒光標記的二抗，37 ℃濕盒避光孵育30 min。0.01 mol/L PBST避光漂洗5 min×3次；甘油緩沖液封片，采用ZEISS圖像分析軟件計算各組大鼠PI3K、AKT、SGK1免疫陽性細胞數。

2.7 Western blot檢測

在凍存海馬中加入組織裂解液，電動勻漿，離心，取上清液。BCA試劑盒測定蛋白濃度。配制15%濃縮膠與10%分離膠，上樣，電泳（濃縮膠60 V、40 min，分離膠80 V、90 min）至溴酚蘭到達凝膠底部即可。采用半干式轉膜法將凝膠中的蛋白分子轉移到NC膜上，封閉1 h，用TBST洗滌后加入相應的一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次后加入近紅外熒光二抗（1∶1000），孵育0.5 h。采用近紅外雙色激光成像系統掃描，并進行數據分析。

3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，實驗數據以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 Open-field實驗結果

與空白組比較，模型組大鼠3 min內水平和垂直活動次數均顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，氟西汀組和百事樂高、中劑量組模型大鼠水平和垂直活動次數顯著增加（P<0.05，P<0.01）。結果見表1。

（下同）

4.2 新奇攝食實驗結果

與空白組比較，模型組大鼠攝食潛伏期顯著延長（P<0.01）；與模型組比較，氟西汀組和百事樂高、中劑量組大鼠攝食潛伏期顯著縮短（P<0.05，P<0.01）。結果見表2。

4.3 百事樂膠囊對模型大鼠單胺神經遞質的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清5-HT和NE含量顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，氟西汀組和百事樂高、中劑量組大鼠血清5-HT和NE含量顯著升高（P<0.05，P<0.01）。結果見表3。

表3 各組大鼠血清神經遞質含量比較（—x±s，ng/g）

4.4 免疫熒光檢測結果

與空白組比較，模型組大鼠海馬CA3區PI3K、AKT免疫陽性細胞數減少，SGK1免疫陽性細胞數增加（P<0.01）；與模型組比較，氟西汀組和百事樂高劑量組大鼠海馬CA3區PI3K、AKT免疫陽性細胞數增加（P<0.05，P<0.01），SGK1免疫陽性細胞數減少（P<0.01），百事樂膠囊中劑量組PI3K免疫陽性細胞數增加（P<0.01），SGK1免疫陽性細胞數減少（P<0.05）。結果見表4、圖1～圖3。

4.5 Western blot檢測結果

模型組較空白組大鼠海馬PI3K、AKT表達明顯降低，SGK1表達明顯增加（P<0.01）；與模型組比較，氟西汀組和百事樂高劑量組大鼠海馬PI3K、AKT表達明顯增加，SGK1表達顯著降低（P<0.05，P<0.01），百事樂中劑量組大鼠海馬PI3K表達明顯增加、SGK1表達明顯降低（P<0.05）。結果見圖4、表5。

5 討論

目前，根據抑郁癥發病機制各種假說開發的治療抑郁癥藥物大多存在起效延遲、復發率高和不良反應大等現象。中藥立足于整體，可調節機體的多系統、多環節、多靶點，對復雜的神經精神疾病有獨特療效。

本實驗采用目前國際公認的新奇攝食實驗和曠場實驗對抑郁癥動物模型進行行為學評價，發現模型組大鼠攝食潛伏期明顯延長，水平和垂直活動次數減少，且血液學檢測中發現血清單胺神經遞質顯著降低。百事樂各劑量組可顯著縮短模型大鼠攝食潛伏期，增加其自主活動和血清單胺神經遞質含量，提示百事樂膠囊可有效改善抑郁樣癥狀。

P13K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，是生長因子受體家族信號轉導過程中的重要成員，其下游依賴于AKT的信號通路即指AKT是P13K下游信號的靶蛋白，可參與胞內物質代謝，調節細胞的生長和凋亡[4]。非依賴于AKT的信號通路即指SGK1是PI3K的下游靶蛋白，其是不同于AKT的另一種PI3K下游靶點，可被PI3K激活后參與細胞存活的調節[5-6]。

PI3K-AKT信號通路是促進細胞生存和維持細胞正常功能的關鍵信息分子鏈[7]。在精神疾患中，PI3K-AKT信號通路受抑制，可使中樞神經元和海馬干細胞功能下降，從而導致精神疾病的產生[8]。SGK1是PI3K下游不同于AKT的一種快速誘導型蛋白激酶，結構與AKT高度相似。SGK1作為皮質醇對神經發生和糖皮質激素受體功能變化的“調解者”，可參與胞內轉運、神經興奮等生理過程[9]。SGK1在慢性不可預測應激大鼠和慢性皮質酮誘導的抑郁樣小鼠海馬中的表達均顯著增加[10-11]。本實驗中，免疫熒光、Western blot結果發現，模型組大鼠海馬PI3K、AKT表達降低，SGK1表達增加，而給予百事樂膠囊后，這些變化明顯發生改變或逆轉，尤以對PI3K/SGK1信號的調節更為顯著。

綜上，百事樂膠囊發揮抗抑郁功效的機制主要通過調節海馬PI3K及其下游SGK1信號而實現。下一步擬采用化學阻斷技術，分別從在體動物和離體原代神經元細胞不同層面探討其對SGK1信號的作用機制及起效靶點。

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（收稿日期：2017-01-06）

（修回日期：2017-01-22；編輯：華強）