加味當歸貝母苦參丸對MFC胃癌荷瘤小鼠瘤組織Toll樣受體通路分子的影響

李海龍 王勇 翟宇 程小麗

摘要：目的 觀察加味當歸貝母苦參丸對MFC胃癌荷瘤小鼠瘤組織Toll樣受體（TLR2、TLR4、TLR6）、腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）和髓分化因子88（MyD88）表達的影響，探討其相關的作用機制。方法 建立MFC胃癌荷瘤小鼠模型進行體內抗腫瘤試驗。將篩選合格的48只MFC胃癌荷瘤小鼠隨機分為模型組，陽性對照組（順鉑組），加味當歸貝母苦參丸高劑量組（當高組）、低劑量組（當低組）和順鉑聯合加味當歸貝母苦參丸高劑量組（順高組）、低劑量組（順低組），各給藥組給予相應藥物灌胃，連續14 d，觀察腫瘤生長情況及小鼠一般情況、腫瘤大體標本及HE染色后組織形態；RT-qPCR和免疫組化分別檢測腫瘤組織TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88的表達。結果 模型組腫瘤細胞豐富，細胞大小不一、體積大、核大深染、異型明顯，可見小灶性壞死，間質血管豐富；各給藥組腫瘤細胞數量減少、排列疏松、細胞體積明顯縮小、核固縮，細胞壞死明顯增加，間質血管數量減少，膠原纖維增多，其中以順低組、順高組較為明顯。與模型組比較，各給藥組TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA和蛋白表達均降低，順低組、順高組TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88蛋白著色變淺，呈弱陽性表達，較順鉑組、當高組、當低組蛋白改變更加明顯。結論 加味當歸貝母苦參丸可能通過下調荷瘤小鼠腫瘤組織TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA和蛋白的表達，發揮抗腫瘤作用。

關鍵詞：加味當歸貝母苦參丸；胃癌；Toll樣受體通路；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.013

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）08-0054-06

Effects of Modified Danggui Beimu Kushen Pills on Toll-like Receptor Pathway Markers on MFC Gastric Cancer Mice LI Hai-long1，2， WANG Yong1，2， ZHAI Yu1，2， CHENG Xiao-li3， AN Xia4， LI Hong-liang2， KANG Wan-rong2， WU Hong-yan2 （1. School of Clinical Medicine， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province， Key Laboratory of TCM Pharmacology and Toxicology in Gansu Province， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 3. Teaching and Research Center， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 4. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China）

Abstract： Objective To study the effects of modified Danggui Beimu Kushen Pills on the expressions of TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 in tumor tissues on MFC gastric cancer bearing mice； To discuss relevant mechanism of action. Methods MFC gastric cancer bearing mice were employed to perform anti-tumor experiment in vivo in this study. A total of eligible 48 mice were randomly divided into model group， DDP positive control group， modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose groups， modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose combined with DDP groups. The treatment was conducted once a day， and lasted for 14 continuous days. After the last administration of gavage orally treatment， all mice were anaesthetized and killed by

基金項目：甘肅省科技廳自然科學基金B類計劃項目（1310RJZA099）；甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室開放基金項目（ZDSYS-KJ-2015-010）

通訊作者：吳紅彥，E-mail：wu.hy@126.com

cervical dislocation method to obtain tumor tissue completely for further HE staining measure and detection of TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 in tumor tissue with the method of RT-qPCR and immunohistochemistry. Meanwhile， the tumor growth was observed and the general conditions of mice were recorded. Results The model group was rich in tumor cells； the sizes of cells were different； the volume was large； the nucleus was deeply stained and the heterotypic shape was obvious， and the small focal necrosis was seen. The number of tumor cells in each administration group was reduced； the arrangement was loose； the cell volume was significantly reduced， and the nuclear pyknosis was reduced. Cell necrosis significantly increased； the number of interstitial blood vessels decreased； collagen fibers increased， especially in modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose combined with DDP groups. Compared with the model group， the expressions of TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 mRNA and protein decreased in each administration group. TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 were lighter and weakly positive expressed in modified Danggui Beimu Kushen Pillshigh-dose and low-dose combined with DDP groups， the protein changes were more obvious Compared with DDP positive control group， modified Danggui Beimu Kushen Pills high-dose and low-dose groups. Conclusion Modified Danggui Beimu Kushen Pills can down-regulate TLR2， TLR4， TLR6， TRAF6 and MyD88 expression of tumor tissue in MFC gastric cancer bearing mice at both mRNA and protein levels to play anti-tumor pharmacology action.

Key words： modified Danggui Beimu Kushen Pills； gastric cancer； Toll-like receptor pathway； mice

胃癌是全球高發的惡性腫瘤之一，據國家癌癥中心2015年統計，胃癌在我國惡性腫瘤死亡排名第3位[1]。體內外實驗顯示，當歸貝母苦參丸干預胃癌和肝癌的藥效明確[2-3]。當歸貝母苦參丸出自《金匱要略》，原用于治療妊娠小便困難。本實驗以當歸貝母苦參丸為基礎方，增加黃芪、山慈菇、全蝎組成當歸貝母苦參丸加味方。該方具有活血化瘀、化痰散結、解毒攻癌，兼顧調節機體補虛扶正、化生氣血的功效。近年來研究發現，Toll樣受體（TLRs）與炎癥相關腫瘤發生發展密切相關[4]。TLRs是機體天然免疫系統中模式識別受體，可識別不同病原體相關分子模式（PAMPs），從而啟動相關下游TLR4胞內信號通路，包括髓分化因子（MyD88）依賴和非依賴途徑[5]。TLR4激活MyD88后，活化的MyD88聚集并結合IRAK1和IRAK2，然后作用于腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6），進一步激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）信號轉導通路[6]。本研究采用RT-qPCR和免疫組化檢測，探討加味當歸貝母苦參丸的抑瘤作用及對荷瘤鼠MFC胃癌組織TLR2、TLR4、TLR6和MyD88表達的影響，為其臨床防治胃癌提供有效的科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級BALB/c-nu小鼠60只，雌、雄各半，體質量（20±2）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養于室溫20～25 ℃、濕度45%～55%環境，分籠飼養，自由攝食飲水。

1.2 細胞、藥物及制備

MFC前胃癌細胞，中科院上海細胞庫。加味當歸貝母苦參丸（黃芪、當歸、浙貝母、苦參、山慈菇、全蝎），飲片購自甘肅中醫藥大學附屬醫院，加10倍量水浸泡1 h，加熱煮沸40 min，濾出煎液，藥渣再加6倍量水加熱煮沸40 min，合并2次煎液，70 ℃水浴蒸發濃縮至含1.0 g原藥材/mL；順鉑注射液，江蘇毫森藥業股份有限公司，20 mg/支，批號20160522，將30 mg順鉑粉針加生理鹽水，稀釋為0.25 mg/mL，4 ℃冰箱保存備用。

1.3 主要試劑和儀器

胎牛血清（杭州四季青公司），反轉錄試劑盒DR036A（上海寶生物工程有限公司），擴增試劑盒（PREMEGO公司），二抗（中杉金橋公司），TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88一抗（IMMONOWAY公司）。生物安全柜、DMEM培養基（健順生物公司），CO2培養箱（力康公司），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS），ABI7500熒光PCR儀（美國ABI公司）。

2 實驗方法

2.1 造模

將凍存細胞株取出，快速置于37 ℃水浴解凍，并轉移細胞液于離心管中，加入適量培養液（高糖DMEM+10%胎牛血清），1000 r/min離心3 min，棄上清液，加入適量培養液重懸細胞，將細胞懸液接種入培養瓶，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養，待細胞完全貼壁后，PBS清洗細胞3遍，更換培養液。1～2 d換液1次。每日倒置顯微鏡下觀察，當細胞生長狀態良好鋪滿瓶底時，25%胰酶常規方法消化、傳代，待細胞長至對數生長期時傳代，棄去培養基，將細胞制成懸液，濃度調整為15×106/mL，小鼠腋下接種胃癌MFC細胞，每只0.2 mL。

2.2 分組和給藥

造模后觀察腫瘤體積直徑達0.5 cm時，剔除體積過大或過小小鼠，48只篩選合格小鼠隨機分為模型組、陽性對照組（順鉑組）、加味當歸貝母苦參丸高劑量（當高組）、加味當歸貝母苦參丸低劑量組（當低組）和順鉑聯合加味當歸貝母苦參丸高劑量組（順高組）、順鉑聯合加味當歸貝母苦參丸低劑量組（順低組）。第2日開始，模型組小鼠予蒸餾水0.2 mL灌胃及腹腔注射生理鹽水0.1 mL；當高組、當低組予中藥0.2 mL灌胃，每日1次；順鉑組予蒸餾水0.2 mL灌胃及腹腔注射順鉑（25 mg/kg）0.1 mL，隔5 d給藥1次，共3次；順高組、順低組予等量中藥灌胃及腹腔注射順鉑（25 mg/kg）0.1 mL，共14 d。第15日18：00時禁食，不禁水。第16日處死小鼠取材備檢。

2.3 腫瘤大體標本及組織形態觀察

對荷瘤小鼠腫瘤組織進行剝離并進行肉眼觀察，對腫瘤體積、顏色和質地進行記錄，與此同時，需觀察確定腫瘤組織假膜完整程度，是否存在出血狀況等。隨后4%多聚甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，切片，染色。對腫瘤組織和細胞形態進行鏡檢，實體瘤療效以抑瘤率表示。抑瘤率（%）=（模型組平均瘤重-實驗組平均瘤重）÷模型組平均瘤重×100%。

2.4 熒光定量PCR檢測TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA表達

稱取30 mg腫瘤組織置于無RNA酶的EP管中勻漿，再加1 mL提取液靜置5 min，常規低溫抽提總RNA后溶解并檢測其濃度，用Takara 036A反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。使用ABI7500熒光定量PCR儀進行擴增。擴增條件：95 ℃、5 min預變性，95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，40個循環，并分析融解曲線，確認擴增產物的特異性，相對表達量采用2-ΔΔCT法計算，實驗重復3次，基因引物序列見表1。

2.5 免疫組化檢測TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88蛋白表達

采用ABC法。切片常規脫蠟水化，3%去離子水滅活內源性酶10 min，微波修復抗原5 min，間隔重復1次；然后依次滴加TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88一抗及生物素化山羊抗兔二抗；滴加SABC，DAB顯色，蘇木素復染，梯度脫水透明后封片，顯微鏡下觀察。以胞漿中出現棕黃色顆粒為陽性。應用圖像分析系統記錄各自TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88積分光密度和平均灰度，作為蛋白表達的量化指標，每組各取材5個樣本。

3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較用方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett'T3法。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 加味當歸貝母苦參丸對MFC胃癌荷瘤小鼠瘤組織抑制率的影響

順鉑組小鼠體質量逐漸下降，精神差，進食減少，反應遲鈍，當高組、順高組狀態較好，瘤質量較模型組差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。結果見表2。

4.2 腫瘤大體標本及組織形態觀察結果

模型組腫瘤細胞豐富，細胞大小不一、體積大、核大深染、異型明顯，可見小灶性壞死，間質血管豐富；當低組腫瘤細胞豐富，細胞大小不一、體積相對縮小、核大深染，部分細胞核固縮，可見小灶性壞死、間質血管豐富，腫瘤細胞周圍膠原纖維增多；當低組、當高組、順鉑組、順低組、順高組腫瘤細胞數減少、排列疏松，細胞體積縮小、核固縮，細胞壞死增加，間質血管數量減少，膠原纖維增多。結果見圖1。

4.3 加味當歸貝母苦參丸對荷瘤小鼠MFC胃癌瘤組織TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA表達的影響

與模型組比較，各給藥組TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA表達均有不同程度變化，當高組、順低組和順高組變化較為明顯。結果見表3。

4.4 加味當歸貝母苦參丸對荷瘤小鼠MFC胃癌瘤組織TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88蛋白表達的影響

胞漿或胞膜出現黃色或棕黃色顆粒為陽性著色。與模型組比較，各給藥組TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88蛋白著色較深，表明為強陽性或陽性表達，而模型組則呈現弱陽性或陰性表達。結果見表4、表5和圖2～圖6。

5 討論

炎癥可通過TLRs誘導內源性介質，促進腫瘤發生發展。TLRs高表達與腫瘤的增殖、侵襲轉移密切相關，如陳戰等[7]研究顯示，胃癌組織中TLR4 mRNA和蛋白表達高于癌旁組織，其表達與胃癌分期、遠處轉移具有相關性，孫運良等[8]研究顯示，TLR4可能參與了胃癌的發生和發展，有淋巴結轉移者TLR4陽性率顯著高于無淋巴結轉移者，TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期者TLR4蛋白表達率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期者，Spearman等級相關分析表明，TLR4蛋白表達與MVD呈顯著正相關。Pimentel-Nunes P等[9]研究表明，TLR2與幽門螺桿菌感染及胃癌發生均相關。本課題組前期研究也發現，TLR2、TLR4、TLR6 mRNA在不同分化程度胃癌細胞中的表達相對于正常胃黏膜上皮GES-1細胞明顯上調；不同濃度脂多糖干預胃癌SGC7901、BGC-823、MGC-803細胞后，TLR2、TLR4、TLR6表達也明顯上調[10]。

劉鵬軍等[11]研究顯示，胃癌組織TRAF6陽性表達高于癌旁正常組織，其陽性表達與胃癌組織分化程度、TNM分期有關，可能參與胃癌的浸潤及轉移。Han F等[12]研究認為，TRAF6是預后不良的胃癌患者的預測。張金明等[13]研究顯示，MyD88在食管癌組織中的陽性表達率為92.0%，明顯高于癌旁組織中17.3%的陽性表達率；MyD88的陽性表達與臨床分期和淋巴結轉移呈正相關。唐樂輝等[14]研究顯示，與癌旁正常組織相比，MyD88在乳腺癌組織中表達明顯增高；MyD88的陽性表達與腫瘤的TNM分期、腫瘤大小、淋巴侵襲轉移密切相關。厲鷗等[15]研究發現，MyD88蛋白在肝癌組織中的陽性表達高于癌旁組織，MyD88和STAT3表達與性別、分化程度、有無HBV感染和肝硬化有關。秦艷等[16]研究發現，MyD88蛋白表達與結直腸腺瘤及結直腸癌中腺瘤異型性相關。

Maeda Y等[17]研究表明，在炎癥相關胃癌小鼠模型中，阻斷MyD88的表達可以降低巨噬細胞中TLR2與COX-2/PGE2的表達，MyD88與COX-2/PGE2共同參與了腫瘤炎癥微環境的產生，并通過誘導TLR2的表達促進腫瘤的發生發展。Obonyo M等[18]研究表明，幽門螺桿菌可以激活巨噬細胞中TLR2和TLR4的表達，TLR2激活MyD88通路對幽門螺桿菌誘導產生IL-6和IL-1β起到至關重要的作用。Kennedy C L等[19]報道，在gp130基因消減（F/F）小鼠胃癌模型中，TLR2可以促進腫瘤的增殖，而沉默MyD88基因可以抑制腫瘤的發生，其作用與促進胃癌上皮細胞凋亡和抑制其增殖有關。

本研究結果顯示，加味當歸貝母苦參丸方可使腫瘤組織瘤體縮小，抑瘤作用明顯，并且與化療藥物聯用后抗腫瘤作用更加明顯。免疫組化研究顯示，當歸貝母苦參丸加味方可抑制腫瘤組織TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA和蛋白的表達，并且與化療藥物聯用后TLR2、TLR4、TLR6、TRAF6和MyD88 mRNA和蛋白下調表達更明顯。另外，TLR2、TLR4、TLR6/MyD88通路及下游TRAF6炎證相關通路參與了胃癌發病機制，加味當歸貝母苦參丸可調控該通路發揮抗腫瘤作用。值得注意的是，中藥治療引起的靶標分子轉錄層次的改變與蛋白層次的改變并不同步，蛋白層次的表達改變更加顯著一些，這說明中藥治療效應除經過基因轉錄外，表觀遺傳改變也可能起作用，這有待進一步深入研究。

綜上所述，當歸貝母苦參丸加味方對荷瘤小鼠MFC胃癌的抗瘤作用與下調TLRs通路分子TLR2、TLR4、TLR6、RAF6和MyD88 mRNA和蛋白的表達有關。

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（收稿日期：2016-11-06）

（修回日期：2016-12-25；編輯：華強）