全人工繁殖達氏鱘胚胎發育的形態學和組織學觀察

劉 亞，龔 全，李 強，杜 軍，趙 剛

(四川省農業科學院水產研究所，四川 成都 611730)

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全人工繁殖達氏鱘胚胎發育的形態學和組織學觀察

劉 亞，龔 全，李 強，杜 軍，趙 剛

(四川省農業科學院水產研究所，四川 成都 611730)

【目的】為探討達氏鱘胚胎在各階段的形態學特征和發育過程。【方法】用Leica EZ4 HD體視顯微鏡和 Leica DM2500正置熒光顯微成像系統分別對全人工繁殖達氏鱘受精卵的胚胎發育過程和組織切片進行了觀察和描述。【結果】全人工繁殖達氏鱘受精卵呈球形、灰褐色或淡黃色、不透明，卵徑2.6～3.2 mm。受精卵在水溫為16～18 ℃下歷時159 h后開始出膜，整個發育過程可人為地劃分為受精卵、卵裂、囊胚、原腸胚、神經胚、器官發生和出膜7個階段，34個發育時期。整個胚胎發育過程所需總積溫為2322～2544 ℃*h。【結論】總體而言，達氏鱘胚胎發育階段經歷鱘形目魚類普遍存在的輻射狀卵裂方式，與其它鱘魚胚胎發育早期階段有較高的相似性。

達氏鱘；全人工繁殖；胚胎發育；形態學；組織學

【研究意義】達氏鱘(AcipenserdabryanusDumeril)，隸屬于鱘形目(Acipenseriformes)，鱘科(Acipenseridae)，鱘屬(Acipenser)，又稱長江鱘、沙臘子，屬于國家一級重點保護動物，為我國特有種。達氏鱘主要分布在長江干流和金沙江下游，在嘉陵江和沱江流域也有分布[1]，曾經是長江上游干流和主要支流的漁業捕撈對象之一。由于過度捕撈、生存環境的破壞、水利水電工程建設和環境污染等因素的影響， 20世紀中后期其資源量急劇下降。按照世界自然保護聯盟(IUCN)1994年評估標準和1996年的評估結果，達氏鱘處于極危級(CR)[1]。【前人研究進展】目前，對達氏鱘的研究主要集中于資源調查、池塘養殖、疾病防治及生長特性等方面[2-8]，而其發育生物學研究僅有零星報道。據資料記載，前人[9]在1976年對野生達氏鱘親魚開展了拴養繁殖，并進行了胚胎發育的形態學觀察，獲得部分圖片，但由于研究條件的限制，早期圖示資料有限，且缺乏系統性研究。【本研究切入點】本研究首次對全人工繁殖子一代達氏鱘的胚胎發育進行形態學并結合組織學觀察，并比較正常和異常發育的受精卵形態學特征。通過討論野生拴養繁殖和全人工繁殖條件下胚胎發育的差異以及達氏鱘與其近緣種胚胎發育的異同。【擬解決的關鍵問題】旨在掌握和揭示達氏鱘胚胎發育規律，豐富達氏鱘發育生物學的基礎資料，為人工繁殖、養殖生產以及育種研究等提供科學依據，從而促進該資源的保護和合理利用。

1 材料與方法

1.1 親魚來源及性腺發育基本情況

實驗用親魚雌雄各5尾，為四川省農業科學院水產研究所在長江宜賓段捕獲野生子一代個體，于2006年進行內塘馴養。雌魚體長：104～126 cm，體重：9.2～17 kg，年齡7～9齡，性腺發育Ⅳ期，均為初產魚。雄魚體長：102～118 cm，體重：8.9～14.5 kg，年齡7～9齡，性腺發育Ⅳ期。

1.2 催產和孵化

通過注射LHRH-A2及鯉魚腦垂體進行人工催產，采用半干法人工授精，得到受精卵。受精后的魚卵用20 %的滑石粉脫粘，經清洗后轉入孵化器中流水孵化，孵化水溫16～18 ℃。

1.3 胚胎發育過程觀察

用解剖針去除外膜，經清水沖洗，采用Leica EZ4 HD體視顯微鏡觀察并拍照，同時取部分樣品固定于10 %甲醛溶液中以供后期復查和作為組織切片樣品備用。胚胎發育前期每0.5 h觀察1次，到達囊胚期后每2 h觀察1次，每次觀察取樣30粒以上，觀察時間從剛受精開始至全部出膜結束。各發育階段的起始時間以發育過程中50 %以上個體達到該時期為準。

1.4 組織切片及HE染色

將胚胎發育各階段的受精卵用10 %甲醛固定24 h后轉移至70 %酒精中保存。經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。縱切胚胎動物極和植物極，切片制好后置于37 ℃恒溫箱中烘干。將烘干后的切片進行HE染色，在Leica DM2500正置熒光顯微成像系統下觀察組織學形態結構，拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 達氏鱘胚胎發育時序

根據達氏鱘胚胎發育各階段形態和組織學特點，參考其他學者[10-17]的研究工作，對達氏鱘的胚胎發育過程進行分期和描述。在16～18 ℃溫度條件下，達氏鱘胚胎從受精開始至發育至出膜耗時129 h，人為可劃分7個階段，包括：受精卵、卵裂、囊胚、原腸胚、神經胚、器官發生和出膜。根據胚胎發育時序及形態特征變化，將7個階段劃分為34個時期(表1)。整個胚胎發育過程所需總積溫為：2322～2544 ℃*h。

2.2 各階段發育特征

2.2.1 受精卵階段 成熟達氏鱘卵呈球形、灰褐色或淡黃色、不透明；卵徑2.6～3.2 mm，卵膜緊貼于卵的表面(圖2-1)；卵為粘性、沉性卵。剛受精的卵，動物極集中多數細胞質，中央出現暗色的色素環包圍著明亮的極性斑，植物極色素均勻(圖1-1)，卵膜開始吸水，并逐漸開始形成卵周系(圖2-2)。受精后約25 min，受精卵吸水膨脹，卵徑約3.2～3.8 mm，形成較大的卵周隙，此時受精卵具有較強黏性；動物極朝上，植物極朝下，細胞質從植物極向動物極流動，在動物極中心形成一個暗斑，暗斑周圍有一寬的明亮帶(圖1-2)；受精后大約1 h，色素在偏心的動物極積累形成褐色帶(圖1-3)，胚盤形成期，胚盤隆起不明顯(圖2-3)。

2.2.2 卵裂階段 達氏鱘的卵裂為特殊的輻射裂。受精后4 h，動物極出現一縱向分裂溝，為經裂，將動物極分裂成大小相似的2個分裂球，此時胚胎進入2細胞期(圖1-4)。受精后5 h，第2次分裂開始，為經裂；此時卵裂溝與第1次卵裂溝垂直，受精卵被分割成 4 個大小基本相同的分裂球，胚胎進入4細胞期(圖1-5)。受精后6 h，第3次卵裂開始，仍然為經裂，受精卵被分裂成8個大小不等的分裂球(圖1-6)；進入8細胞期。同時第1次分裂溝在植物極閉合，植物極被分為兩部分。受精后7 h，第4次卵裂開始，出現橫向分裂溝，為緯裂，此時，胚胎被分成16個大小不等的分裂球(圖1-7)；進入16細胞期。同時第2次分裂溝延伸至赤道下方，但大多數并未在植物極形成完全閉合。受精后8 h，第5次卵裂開始，第 2 次的縱向分裂溝在植物極閉合，胚胎被分成 32 個大小不等的分裂球(圖1-8)，進入32細胞期。受精8.8 h后，動物極分成越來越小的不規則細胞，進入多細胞期。此時，動物極中心出現較深的色素，植物極完全分裂(圖1-9)。

2.2.3 囊胚階段 受精后9 h 30 min，胚胎進入囊胚早期，動物極色素變淺并逐漸變得明亮，植物極色素較深。動物極分裂球變小，單個細胞可辨認(圖1-10)；植物極分裂球仍較大。受精后 11 h，胚胎進入囊胚中期，分裂球更小，動物極細胞核分裂出現不同步，整個受精卵的分裂球之間有明顯的間隙(圖1-11)。受精后16 h，進入囊胚晚期，動物極、植物極分裂球均不斷變小，動物極細胞間的界線變得模糊，單個細胞難以辨認，動物極開始往植物極下包(圖1-12)，形成囊胚腔(圖2-4、2-5)。

表1 全人工繁殖達氏鱘胚胎發育過程

2.2.4 原腸胚階段 受精后約22 h，原腸初期開始，一深色的色素帶出現在赤道附近形成(圖1-13)。受精后 22 h，胚胎進入原腸初期，色素帶處產生一個短而不深的狹縫狀胚孔(圖1-14)。受精后約30 h，原腸中期開始，此時側唇和腹唇形成，外胚層細胞通過側唇和腹唇繼續內卷，形成胚環；動物極覆蓋胚胎表面的 2/3，植物極、動物極界限明顯(圖1-15)。受精后約35 h，內胚層細胞仍然暴露在植物極外面，形似栓狀，故稱為“卵黃栓”。較大的卵黃栓像一個大塞子嵌在胚環內，進入大卵黃栓期，動物極和植物極界限很清晰(圖1-16)。受精后約38 h，進入小黃栓期，植物極僅有一個很小的卵黃栓，動物極幾乎覆蓋整個卵(圖1-17)。在原腸早期可見包被層EVL及深層細胞DC(圖2-6)，原腸中期和后期，原腸胚明顯(圖2-7、2-8)；上胚層Ep，內胚層 En，下胚層 Hy可見(圖2-9)。

1．剛受精的卵；2．卵周隙形成；3．胚盤隆起期；4．2細胞期；5．4細胞期；6．8細胞期；7．16細胞期；8．32細胞期；9．多細胞期；10．囊胚早期；11．囊胚中期；12．囊胚晚期；13．原腸初期；14．原腸早期；15．原腸中期；16．大卵黃栓期；17．小卵黃栓期；18．隙狀胚孔期；19．神經胚早期；20．寬神經板期；21．神經褶靠攏期；22．神經胚晚期；23．神經管閉合期；24．眼囊形成期；25．尾牙形成期；26．尾牙分離期；27．短管心臟期；28．長管心臟期；29．聽板形成期；30．肌肉效應期；31．心跳期；32．尾達頭部期；33．出膜前期；34．出膜期圖1 全人工繁殖達氏鱘胚胎發育Fig.1 Embryonic development of artificially-bred A. dabryanus Dumeril

2.2.5 神經胚階段 受精后約39 h，卵黃栓逐漸消失，胚孔的二側唇相互靠攏，胚孔邊緣接近閉合，只留下極其狹窄的裂隙，進入隙狀胚孔期(圖1-18)。受精后約 41 h，胚胎背部開始形成馬蹄狀的神經板，隨后，神經板增厚，并在周圍神經板腦部周圍出現神經褶(圖1-19)。受精后約42.5 h，進入寬板神經期，在頭部神經板周圍有清楚的呈馬蹄形的神經褶(圖1-20)；神經板中央有向下增長的呈縱行的神經溝。受精后43.5 h，腦部處的神經褶邊緣升高、增厚并逐漸靠攏。神經板下陷、變窄，在軀干部的兩側出現排泄系統原基(圖1-21)。受精后45h，腦部神經褶繼續靠攏，神經板最后閉合成神經管(圖1-22)；軀干部的神經褶也開始靠近，排泄系統原基加長。受精后51 h，神經管閉合，沿神經褶融合線的聯合清晰可見；頭部逐漸膨大加長，胚胎頭部形成為前、中、后 3 個腦泡(圖1-23)；胚胎的頭和尾部已很明顯，胚體位于背面，卵黃囊位于腹面；排泄系統原基也顯著加長，但沒有達到神經管末端。該階段神經板形成(圖2-10、2-11)，視泡開始出現(圖2-12)，神經管NT及脊索NO形成(圖2-13、2-14、2-15、2-16)，此后肌節So也可見(圖2-17)。

表2 全人工繁殖達氏鱘與其它鱘科魚類胚胎發育情況的比較

1.未受精；2.剛授精3 min；3.胚盤形成期；4.囊胚期；5.囊胚腔 Bl；6.原腸早期 包被層 EVL，深層細胞 DC；7.原腸中期；8.原腸胚 9.上胚層 Ep，內胚層 En，下胚層 Hy；10.神經胚期；11.神經板形成；12.視泡出現期；13.神經管 NT，脊索 No形成；14.神經管 NT，脊索 No.；15. 神經胚期(神經管閉合)；16.神經管 NT，脊索 No.；17.神經管 NT，脊索 No.，肌節So ；18、19.體節出現；20.眼囊期；21.聽囊期；22.腦分化期；23.圍心腔形成期；24.消化管形成；25.尾芽游離期；26、27.出膜前期 圖中比例尺大小均為200 μm圖2 全人工繁殖達氏鱘胚胎發育的組織學觀察Fig.2 Histological observations of embryonic development in artificially-bred A. dabryanus Dumeril

達氏鱘A．dabryanus發育水溫(℃)Watertemperatureofembryonicdevelopment總孵育時間(h)Timeofembryonicdevelopment積溫(℃?h)Accumulatedtemperature平均卵徑(mm)Averageeggdiameter全人工繁殖16．0～18．0129～1592322～25442．85野生拴養催產繁殖[9]17．0～18．0115～1172012～20473．00

2.2.6 器官發生階段 胚胎發育至55 h進入視泡形成期，2個眼突形成于前腦泡處，眼原基形成(圖1-24)。受精后約60 h，側板達到頭部前端，排泄系統原基前部增厚，腎小管原基形成，此時胚胎尾部扁平(圖1-25)。受精后65 h，側板從接近到完全聯合，排泄系統從身體中部一直延伸至尾端；胚體向上隆起，高出球面，尾芽呈棒狀并突出(圖1-26)。受精后約74 h，心臟開始呈短管狀，位于頭部的前下方(圖1-27)；頭部開始抬起，尾芽開始逐漸變長變窄。受精后約80 h，心臟原基呈長管狀(圖1-28)，頭明顯抬高，視泡明顯。受精后約 85 h，頭部繼續抬高，心臟呈“C”形；聽板在腦的第三膨大部分的兩側出現(圖1-29)。受精后約 90 h，胚胎尾向腹面彎曲加長，并逐漸接近心臟，肌肉也開始顫動，聽泡形成(圖1-30)。受精后約95 h，心臟呈大“C”狀，尾的末端扁平(圖1-31)。受精后約 101 h，尾末端繼續伸長并接觸頭部，胚胎在卵內轉動(圖1-32)。該階段組織切片圖可見體節的出現(圖2-18、2-19)，眼囊期(圖2-20)、聽囊期(圖2-21)、腦分化期(圖2-22)以及圍心腔和消化管形成(圖2-23、2-24)。

1.剛受精的卵；2.卵裂期，形成3細胞；3.卵裂期，形成6細胞；4.卵裂期，形成7細胞；5～9.卵裂期，動物極細胞分裂不均等；10.胚孔閉合不完全；11.神經管閉合異常；12.頭部發育異常；13～15.尾牙發育異常；16～18.頭部、肌節、尾牙的發育異常；19.胚胎死亡圖3 全人工繁殖達氏鱘胚胎異常發育Fig.3 Abnormality of embryonic development on artificially-bred A. dabryanus Dumeril

2.2.7 出膜階段 受精后113 h，尾的末端略過頭部，尾部鰭褶變寬；尾牙游離(圖2-25)。卵黃囊上血管明顯，心跳搏動加快；胚體在膜內自由地扭動 (圖1-33)。受精后大約在 129 h，尾的末端達到間腦，進入出膜前期(圖2-26、2-27)，隨后仔魚開始孵出(圖1-34)，至159 h同批次魚卵全部孵出。剛孵出的仔魚全長9.0～1.02 mm。

3 討 論

3.1 胚胎發育特征

達氏鱘的卵裂方式為特殊的輻射狀卵裂，這種卵裂方式與真骨魚類的端黃卵不同，其表現在前3次卵裂均為經裂，第4次卵裂為緯裂，這種卵裂方式可能是鱘形目魚類普遍存在的卵裂方式[10-14，18]。與其它鱘形目魚類胚胎發育過程中所不同的是，在達氏鱘胚胎發育過程中細胞分裂8細胞期，同時能夠觀察到第一次卵裂溝僅達到赤道下方和在植物極閉合；而西伯利亞鱘[10]、匙吻鱘[18]、施氏鱘[13]在細胞分裂8細胞期觀察到第一次卵裂溝在植物極閉合，中華鱘[11]在細胞分裂8細胞期觀察到第一次分裂溝越過卵的赤道，擴展到植物極。在心跳期，達氏鱘的心臟呈“C”型，尾牙變扁平，而施氏鱘與中華鱘心臟呈“S”型，尾牙分離變細。總體而言，鱘魚胚胎發育過程早期階段有較高的相似性。

成熟達氏鱘卵呈球形、灰褐色或淡黃色、不透明、魚卵受精后數分鐘出現粘性，與前人[9]報道的一致。全人工繁殖的達氏鱘魚卵與其它鱘魚魚卵相比較小(表2)且全人工繁殖的達氏鱘魚卵卵徑小于與野生拴養繁殖[9]的(表3)，這與王丙乾[19]等對人工培育與野生史氏鱘的胚胎發育結果一致，均顯示出人工培育卵徑較小，這可能與初產魚、營養物質積累量有關。

3.2 胚胎發育時間和積溫

全人工繁殖的達氏鱘胚胎發育所需積溫較其它鱘魚高(表2)，且高于野生拴養繁殖[9]的(表3)。這個結果與王丙乾等[19]比較人工培育與野生史氏鱘胚胎發育結果相似，均表現出人工培育卵的胚胎發育時間較野生卵的發育時間長，積溫也較高。這可能與親魚培育過程中的營養需求和卵黃沉積度有一定的關系。

3.3 胚胎異常發育現象

在胚胎發育過程中，還觀察到部分受精卵在剛受精、卵裂期、神經胚階段及器官形成時期等階段均異常發育。剛受精的卵，有的偏移動物極中央而在一側集中多數細胞質(圖3-1)；卵裂期，部分胚胎從第二次分裂期至多細胞期形成，動物極分裂不均等，出現3細胞(圖3-2)，6細胞、10細胞(圖3-3至3-9)。在卵裂期，部分胚胎形成的卵裂溝也異常，有的卵裂溝不明顯，有的僅在動物極形成卵裂，植物極未分裂。在神經胚階段，觀察到少量胚胎的胚孔閉合不完全(圖3-10、3-11)，神經管閉合異常；器官形成期，頭部、尾牙以及肌節的發育異常均有觀察到(圖3-12至3-18)。連續觀察上述異常發育的受精卵，發現均無一例外的在后期停止發育，胚胎死亡(圖3-19)。造成這種異常發育的原因還有待進一步研究。

致 謝：在研究過程中受到四川農業大學趙柳蘭、楊淞老師、 肖青同學，西南大學蒲德永老師的幫助，特此感謝。

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(責任編輯 陳 虹)

Morphological and Histological Observation of Embryonic Developmentof Artificially-bredAcipenserdabryanusDumeril

LIU Ya，GONG Quan，LI Qiang，DU Jun，ZHAO Gang

(Fishery Institute of Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 611730，China)

【Objective】The present study was conducted to investigate the morphological characteristics and embryonic development schedule of artificially-bredA.dabryanusDumeril.【Method】The morphological and embryonic histological of fertilized eggs of artificially-bredAcipenserdabryanusDumeril were observed by Leica EZ4 HD and Leica DM2500.【Result】The mature eggs were spherical, beige or pale yellow, opaque and 2.6-3.2 mm in diameter. Under the temperature of 16-18 ℃, its embryonic development lasted for 159 hours. The whole embryonic development of it could be divided into seven stages, including fertilized egg stage, cell division stage, blastula stage, gastrula stage, neurula stage, organ formation stage and hatching stage, and contained thirty four developing phases. The total accumulated temperature of its embryonic development required was 2322-2544 ℃·h.【Conclusion】 In general, the cleavage way ofA.dabryanusDumeril was radial cleavage which was common in sturgeon, indicating that its embryo development in early stage had a high similarity with other sturgeon.

AcipenserdabryanusDumeril；Reproduction；Embryonic development；Morphology；Histology

1001-4829(2017)7-1686-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.039

2016-07-10

四川省科技支撐計劃項目(2016NYZ0047)；四川省重點研發項目(2017SZ0083)

劉 亞(1982-)，女，碩士研究生，助理研究員，主要從事水產養殖和分子生物學方面研究，E-mail：liuya2343@163.com，Tel：18080812343。

S917

A