蝴蝶蘭“雙龍”品種離體葉片不定芽誘導(dǎo)的研究

王景君，呂清，裴冬麗*

(1.商丘市第一高級(jí)中學(xué)，河南 商丘 476000；2.商丘師范學(xué)院 植物與微生物互作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 商丘 476000)

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蝴蝶蘭“雙龍”品種離體葉片不定芽誘導(dǎo)的研究

王景君1，呂清2，裴冬麗2*

(1.商丘市第一高級(jí)中學(xué)，河南 商丘 476000；2.商丘師范學(xué)院 植物與微生物互作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 商丘 476000)

以蝴蝶蘭“雙龍”品種的離體葉片為外植體，利用正交試驗(yàn)法研究MS基本培養(yǎng)基種類、TDZ、蔗糖3個(gè)因素及水平組合對(duì)蝴蝶蘭離體葉片不定芽誘導(dǎo)的影響.結(jié)果表明：蝴蝶蘭“雙龍”品種誘導(dǎo)離體葉片不定芽產(chǎn)生的最佳培養(yǎng)基是1/2MS+0.3 mg/L TDZ+10 g/L蔗糖.

蝴蝶蘭；組織培養(yǎng)；不定芽；葉片

蝴蝶蘭，又名“洋王皇后”，具有很高的觀賞價(jià)值.除此之外，蝴蝶蘭還具有藥用和食用價(jià)值，既能深加工研發(fā)出相關(guān)產(chǎn)品，又能做切花，組盆銷售，是人們爭(zhēng)相購(gòu)買的年宵花之一，具有很大的經(jīng)濟(jì)效益和發(fā)展?jié)摿?早期進(jìn)行的蝴蝶蘭組織培養(yǎng)是首先誘導(dǎo)花梗腋芽萌發(fā)，然后以叢生芽方式進(jìn)行增殖[1].近年來(lái)，蝴蝶蘭大多以原球莖途徑進(jìn)行繁殖，但是這種方式原球莖的誘導(dǎo)率較低，誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)，尤其通過(guò)葉片誘導(dǎo)原球莖比較困難[2].有報(bào)道指出，蝴蝶蘭葉片可以不經(jīng)過(guò)原球莖階段直接再生不定芽[3]，其發(fā)生時(shí)間短，誘導(dǎo)率高，且材料來(lái)源廣.因此，本實(shí)驗(yàn)采用蝴蝶蘭離體葉片不通過(guò)愈傷組織直接誘導(dǎo)不定芽的方式進(jìn)行繁殖.MS培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽濃度較高,微量元素及有機(jī)成分齊全而豐富,對(duì)多數(shù)植物的增殖培養(yǎng)而言,是較為理想的一種基本培養(yǎng)基[4].對(duì)噻重氮苯基脲(thidiazuron,TDZ)已被成功用于多種植物的體外誘導(dǎo)不定芽形成和促進(jìn)腋芽增生，特別是對(duì)難以誘導(dǎo)的木本植物其效果尤為明顯[5].蔗糖是組織培養(yǎng)中最常用的碳源,在植物組織培養(yǎng)中,糖的用量不僅影響著培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)量,還影響其代謝水平、次生代謝物的合成以及細(xì)胞的形態(tài)和發(fā)生,是影響植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵因素之一[6].本實(shí)驗(yàn)主要研究MS基本培養(yǎng)基的種類、TDZ以及蔗糖的不同濃度對(duì)蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生的影響，從而為高效誘導(dǎo)體系奠定一定的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

蝴蝶蘭“雙龍”品種.

1.2 材料的處理

采用蝴蝶蘭“雙龍”品種無(wú)菌苗的離體葉片.挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的無(wú)菌苗，于超凈工作臺(tái)上將其離體葉片切成0.5 cm×0.5 cm左右大小，上表面朝上置于培養(yǎng)基上.配置不同種類的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，pH調(diào)至6.0，121 ℃滅菌20 min.前期暗處理15 d，后期轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)(白天16 h，夜晚8 h)，培養(yǎng)溫度為25 ℃.

1.3 蝴蝶蘭不定芽組織的誘導(dǎo)

誘導(dǎo)蝴蝶蘭不定芽組織的培養(yǎng)基選用(1/4～1)MS+(0～0.3) mg/L TDZ+(10～30) g/L蔗糖.選用基本培養(yǎng)基、TDZ、蔗糖3個(gè)參考因子，每個(gè)因子取3個(gè)水平，采用L9(34)正交表，因子水平安排見表1.每瓶5個(gè)葉片組織塊，每個(gè)處理3瓶，試驗(yàn)重復(fù)3次.

表1 供試因素和水平

1.4 不定芽的繼代培養(yǎng)

取蝴蝶蘭不定芽長(zhǎng)勢(shì)良好，并由不定芽處生長(zhǎng)出葉片的組織，將其進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)基為1/2MS.

1.5 不定芽的生根壯苗

將長(zhǎng)勢(shì)良好，無(wú)污染，分化程度較好的不定芽接入到生根培養(yǎng)基上，在25 ℃光照下培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2MS+1 mg/L IBA.待其生根后，做壯苗處理，壯苗培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 6-BA+0.1mg/L 2,4-D.

1.6 煉苗

將培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)旺盛，長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良的完整植株移栽到瓶外的培養(yǎng)土中，進(jìn)行煉苗處理.首先將培養(yǎng)瓶拿到自然光下1-2 d，然后打開瓶蓋5 d左右，將蝴蝶蘭取出，在清水中將根部培養(yǎng)基清洗干凈，栽入營(yíng)養(yǎng)土和蛭石1∶1混合的基質(zhì)中，定期澆水.

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選誘導(dǎo)蝴蝶蘭不定芽分化的最適培養(yǎng)基

蝴蝶蘭離體葉片接種于培養(yǎng)基上(圖1-A)，暗處理15 d內(nèi)，葉片變黃，之后光照培養(yǎng)，葉片膨大，40 d后開始出現(xiàn)芽點(diǎn)(圖1-B)，逐漸長(zhǎng)出不定芽.葉片上長(zhǎng)出的芽簇，嫩綠，飽滿、生長(zhǎng)迅速的為直接誘導(dǎo)出的不定芽(圖1-C).

對(duì)于蝴蝶蘭“雙龍”品種，由表2的結(jié)果可以看出，蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)不定芽的最適組合為A2B3C1，即1/2MS+0.3 mg/L TDZ+10 g/L蔗糖，誘導(dǎo)率達(dá)到33.3%.采用最小顯著極差法分析各因子水平(表3)，可以看出最佳組合為A2B3C1，與表2結(jié)果一致.由于極差值越大，表示該因素越重要，由表3可以得出，在蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)不定芽的3種因素中，起到重要作用的是TDZ和基本培養(yǎng)基，而蔗糖的影響次之.

表2 蝴蝶蘭“雙龍”品種葉片誘導(dǎo)不定芽正交試驗(yàn)表配比及誘導(dǎo)結(jié)果

表3 最小顯著極差法的分析結(jié)果

2.2 不定芽的繼代培養(yǎng)及生根、煉苗

挑選生命力強(qiáng)，嫩綠芽狀，密集叢生的不定芽(圖1-C)轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，不定芽不斷叢生，待其壯大后(圖1-D)，轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)(圖1-E)，使其長(zhǎng)成完整植株，再進(jìn)行擴(kuò)繁.將培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)旺盛的蝴蝶蘭完整植株移栽到瓶外培養(yǎng)土中，進(jìn)行煉苗處理(圖1-F).

圖1 蝴蝶蘭離體葉片不定芽的發(fā)生以及試管苗形成與移栽A：接種后的葉片組織；B：切口處的芽點(diǎn)；C：葉片直接再生的不定芽；D：繼代培養(yǎng)；E：壯苗和生根培養(yǎng)；F：煉苗.Fig.1 Adventitious bud occurrence of Phalaenopsis leaves test-tube seedling formation and transplantingA：The leaf tissues after inoculation; B：Bud points germination at the incision; C：Adventitious buds regenerated from leaves;D：Subculture; E：Strong seedling and rooting culture; F：Seedling adaptation.

3 討 論

影響不定芽誘導(dǎo)的因素有很多，如基本培養(yǎng)基種類、pH值、激素種類和配比、蔗糖濃度、暗處理時(shí)間等.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)法探究基本培養(yǎng)基種類、TDZ、蔗糖濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響.采用最小顯著極差法分析各因子水平可以看出，在蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)不定芽的3種因素中，起到重要作用的是TDZ和基本培養(yǎng)基，而蔗糖的影響次之.TDZ對(duì)外植體分化有很大影響，是葉片不定芽發(fā)生所必需的條件[8].本實(shí)驗(yàn)中不添加TDZ的培養(yǎng)基均未誘導(dǎo)出不定芽，而添加了0.3 mg/L TDZ的培養(yǎng)基其誘導(dǎo)出不定芽的個(gè)數(shù)均比較多，說(shuō)明TDZ在不定芽誘導(dǎo)中起決定作用，適宜濃度的TDZ可以提高誘導(dǎo)率.MS基本培養(yǎng)基不同的離子濃度對(duì)于不定芽的誘導(dǎo)有不同的影響，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1/2MS是最為合適的基本培養(yǎng)基，這與前人的研究結(jié)果是一致的[7].作為組織培養(yǎng)的碳源，蔗糖最為合適，它能夠維持一定的滲透勢(shì).本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于蝴蝶蘭“雙龍”品種離體葉片不定芽的誘導(dǎo)最佳蔗糖濃度為10 g/L.有報(bào)道指出，暗培養(yǎng)對(duì)不定芽發(fā)生有顯著的促進(jìn)作用[9]，因此，本實(shí)驗(yàn)采用15 d暗處理培養(yǎng).

本文通過(guò)選取不同的影響蝴蝶蘭葉片不定芽生長(zhǎng)的不同因子進(jìn)行試驗(yàn)，從而篩選出蝴蝶蘭離體葉片直接誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生的最適培養(yǎng)基.本研究表明，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析方法對(duì)于研究植物生長(zhǎng)物質(zhì)與不定芽誘導(dǎo)的關(guān)系，以及選擇最佳培養(yǎng)基，是十分有效的工具，其大大減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，節(jié)省了大量的人力、物力和財(cái)力[10].在蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中，利用葉片作為外植體不僅取材方便，而且可以簡(jiǎn)化誘導(dǎo)途徑，提高組培擴(kuò)繁的效率.本實(shí)驗(yàn)采用試管苗葉片作為外植體，降低了污染率，大幅提高了培養(yǎng)效率，為蝴蝶蘭快繁提供了新途徑.

[1]劉榮維,梅慶超,崔元方,等.叢生芽—蝴蝶蘭無(wú)性快速繁殖的新途徑[J].熱帶作物學(xué)報(bào),1993,14(12)：105-107.

[2]李軍,柴向華,曾寶,等.蝴蝶蘭組培工廠化生產(chǎn)技術(shù)[J].園藝學(xué)報(bào),2004,31(3)：413-414.

[3]李進(jìn)進(jìn),廖俊杰,柯麗婉,等.蝴蝶蘭根段的組織培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊,2000,36(1)：37.

[4]柳俊,謝從華.植物細(xì)胞工程(第2版)[M].北京：高等教育出版社,2011：33-36,84-86.

[5]Ma X F，Yu C M，Tang S W，et al.High frequency adventitious shoot induction and plant regenerationfrom hypocotyl of ramie[Boehmerianivea(L.)Gaud][J].Philipp Agric Scientist，2010，93(1)：121-125.

[6]范樹國(guó),江明,邱璐,等.激素和蔗糖濃度對(duì)蝴蝶蘭愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(3)：61-63.

[7]楊海蕓,吳震,王廣東,等.不同培養(yǎng)條件對(duì)蝴蝶蘭離體葉片不定芽發(fā)生的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,30(1)：44-49.

[8]楊美純,周歧偉,許鴻源,等.外部因子對(duì)蝴蝶蘭葉片原球莖狀體發(fā)生的影響[J].廣西植物,2000,20(1)：42-46.

[9]吳雪梅,湯浩茹,李燕,等.不同培養(yǎng)條件對(duì)“豐香”草莓離體葉片再生的影響[J].園藝學(xué)報(bào),2004,31(5)：657-659.

[10]張國(guó)治,嚴(yán)霄,王鳳仙,等.正交設(shè)計(jì)在組織培養(yǎng)研究中的應(yīng)用[J].植物生理學(xué)通訊,1985,21(5)：46-48.

[責(zé)任編輯：徐明忠]

Phalaenopsis “ShuangLong” adventitious buds induction from leaves in vitro

WANG Jingjun1，Lü Qing2，PEI Dengli2*

(1.Shangqiu First Senior High School，Shangqiu 47600，China； 2.Key Laboratory of Plant-Microbe Interactions，Shangqiu Normal University，Shangqiu 47600,China)

The effect of three factors and combination of the kinds of MS basic media，TDZ and sucrosewere studied on adventitious buds induction from leaves in vitro of phalaenopsis “ShuangLong” to be adventitious buds by using the orthogonal experiment design.The results showed that the optimal medium for the adventitious buds induction from leaves in vitro of Phalaenopsis “Shuang Long” is 1/2MS+0.3 mg/L TDZ+10 g/L sucrose.

phalaenopsis；tissue culture；adventitious buds；leaves.

2017-04-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31571997)；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(15A180019、15A210045、16A210037)

王景君(1983—)，女，河南民權(quán)人，商丘市第一高級(jí)中學(xué)教師，主要從事植物學(xué)的研究.

裴冬麗(1971—)，女，河南虞城人，商丘師范學(xué)院教授，博士，主要從事植物分子遺傳學(xué)研究.

S682.32

A

1672-3600(2017)09-0039-04