熱酸水解玉米穗軸及其脫毒處理方法研究

劉秀花,梁梁,李艷旭,梁峰

(商丘師范學院 生物精煉河南省工程實驗室，河南 商丘 476000)

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熱酸水解玉米穗軸及其脫毒處理方法研究

劉秀花,梁梁,李艷旭,梁峰

(商丘師范學院 生物精煉河南省工程實驗室，河南 商丘 476000)

對木質纖維原料進行預處理是生產微生物油脂的關鍵.本試驗以最常見的農田廢棄物玉米穗軸為原料，對半纖維素水解條件和水解液脫毒方法的選擇進行了探究.結果發現，121℃、0.1 MPa、料液比為1∶10、硫酸質量分數為0.7%、處理時間為2 h的條件下稀酸預處理玉米穗軸粉，水解液中還原糖含量最高可達49.68 g/L.經發酵實驗證實，采用Ca(OH)2中和后，聯合活性炭吸和還原劑進一步脫毒處理上述水解液，水解液中發酵抑制劑的去除效果最好，獲得了長枝木霉液體培養油脂產量達到3.188 g/L，具有一定的應用前景.

玉米穗軸；長枝木霉；生物能源；脫毒；微生物油脂

化石能源的枯竭和環境的壓力，促使許多政府和組織致力開發可再生能源.其中，生物柴油(脂肪酸烷基酯)在交通運輸領域的地位以及它的綠色可再生特性引起人們關注，成為近十多年來的熱門話題.生物柴油具有可再生、清潔和安全三大優勢，表現為無毒、可生物降解和可再生能源、很低的排氣顆粒物和溫室氣體CO、CO2的排放，因此生物柴油作為一種替代能源有巨大的潛力.生物柴油對中國農業結構調整、能源安全和生態環境綜合治理有十分重大的戰略意義.促進生物柴油的產業化生產不僅可以幫助國家減少對進口石油的依賴，也可以減輕環境污染和全球變暖的問題.作為一個大型農業國家,中國生物柴油開發可以幫助偏遠農村地區恢復生態系統,促進農村經濟發展,關注農民、農村和農業，解決“三農問題”[1].

發展生物柴油，我國有十分豐富的原料資源.目前中國生物柴油的開發利用還處于發展初期，要從總體上降低生物柴油成本，使其在中國能源結構轉變中發揮更大的作用，只有探索更為經濟的方法，才能走符合中國國情的生物柴油發展之路.

世界各國尤其是發達國家，都在致力于開發高效、無污染的生物質能利用技術.歐洲已成為全球生物柴油的主要生產地.而生物柴油產業瓶頸是原料供應問題，傳統生物柴油與糧食作物爭地，不可持續發展.要滿足日益增長的對生物柴油的需求，必須開發脂質如微藻類油和真菌微生物油脂來源.而中國數量龐大玉米穗軸等農作物廢棄物可充分地發揮優勢，通過水解這類纖維質原料，利用水解液培養微生物來生產微生物油脂，進而轉化為生物柴油是一條擴大生物柴油原料來源的新途徑.微生物油脂轉酯后其成分接近天然石化柴油，具有更高的適用性.由于玉米穗軸水解液中含有許多抑制發酵的副產物，使得用水解液作底物發酵比用純葡萄糖發酵要復雜得多.酚類化合物、糠醛、乙酸是水解液中幾種主要的抑制物，人們嘗試了用石灰乳中和[2]、過堿法[3]、活性炭吸附[4]、真空濃縮[5]、有機溶劑萃取[6]和離子交換[7]等多種脫毒方法除去這些抑制物，在改善水解液發酵性能，提高產品得率方面取得了一定的成果.Adnan Cavka等還研究了還原劑的處理對玉米穗軸水解液發酵性能的影響，分析結果表明硫氧化合物等還原劑的積極效應主要是由于他們在低溫和弱酸性(如25℃和pH5.5)條件下磺酸鹽抑制芳香族化合物和呋喃醛的反應能力[8].但在報道的文獻中，多數是以玉米秸稈、甘蔗渣、碎木屑為原料在一定條件下水解，水解液再用上述的脫毒方法之一處理后用于發酵.但研究半纖維素的水解條件以提高其水解率，比較各種脫毒方法以進一步提高水解液發酵性能的文章國內并不多見.所以本試驗以最常見的農田廢棄物玉米穗軸為原料，對半纖維素水解條件和水解液脫毒方法的選擇這兩方面進行了探究，以期獲得較好的水解條件和脫毒方法.

1 材料與方法

1.1 材料

玉米穗軸取自河南省商丘市郊區，曬干，粉碎過22目篩貯存備用.本試驗所使用的長枝木霉13053(Trichodermalongibrachiatum13053)，由本試驗室保存，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心.

1.2 主要試劑

1.3 試驗儀器

分析天平，高壓蒸汽滅菌鍋，循環水式真空泵，生物安全柜，恒溫鼓風干燥箱，玻璃砂芯過濾裝置，低溫干燥凍干機，低溫培養箱，熒光顯微鏡，索式抽提裝置，電熱恒溫水浴鍋，氣浴恒溫振蕩器.

1.4 研究方法

1.4.1 玉米穗軸熱酸解液的制備

稱取20 g曬干粉碎并恒重的玉米穗軸于500 mL的錐形瓶中，加入一定體積及一定質量分數的硫酸，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃、0.1 MPa條件下水解.水解后冷卻至室溫，抽濾除去玉米穗軸殘渣,得玉米穗軸半纖維素降解液.取樣做還原糖含量等定性及定量分析.

在121 ℃、0.1 MPa的條件下，以還原糖含量作為參考指標，選取料液比、硫酸的質量分數、處理時間為考察因素，采用三因素三水平的正交試驗方法，得出最優水解條件.

表1 高溫高壓預處理因素水平表

1.4.2 玉米穗軸半纖維素水解液脫毒

稀酸水解液中產生的發酵抑制物主要包括甲酸、乙酸、糠醛、5-羥甲基糠醛和芳香族化合物等.這些發酵抑制物可以分為3類，即有機酸類、醛類和酚類化合物.

圖1 木質纖維素水解產物及其產生的發酵抑制物[12]Fig.1 Hydrolyzate and Fermentation inhibitors of Lignocellulose

三種水解液脫毒方法，分述如下：A.堿過中和法，玉米穗軸酸解液1000 mL，加Ca(OH)2調pH至9.0，30～60 ℃保溫1 h，抽濾調pH至5.5.B.堿中和聯合活性炭吸附法，玉米穗軸酸解液1000 mL，加Ca(OH)2調節pH至4.0，再加入2.0 g活性炭振蕩1 h，然后抽濾，取濾液，調pH至5.5. C.堿中和聯合活性炭吸附及還原劑處理法，玉米穗軸酸解液1000 mL，加Ca(OH)2調節pH至4.0，再加入2.0 g活性炭振蕩1 h，然后抽濾，取濾液，加入硫代硫酸鈉15 mL，震蕩10 min，取上清液.

上海理工大學測控專業工程認證教學改革總體思路如圖1所示。在以學生為中心的基礎上,通過制定培養目標、培養標準、課程計劃、教學計劃以及保障體系,并通過持續改進,最終實現以輸出為導向(Outcome-Based Education,OBE)。改革的具體實施主要分為四個階段。

1.4.3 DNS法測定還原糖濃度

配制DNS試劑，準確稱取3，5-二硝基水楊酸(化學純)6.3 g于500 mL燒杯中，用少量蒸餾水溶解后.然后逐步加入262 mL 2 mol/L的氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌.直到溶液清澈透明(注意：在加入氫氧化鈉過程中，溶液溫度不要超過48 ℃).再逐步加入四水酒石酸鉀鈉185.0 g、苯酚5.0 g和無水亞硫酸鈉5.0 g.繼續45 ℃水浴加熱，同時補加適量蒸餾水，不斷攪拌，直到加入的物質完全溶解.停止加熱，冷卻至室溫后，移入1000 mL容量瓶中加蒸餾水定容后儲存在棕色瓶中，避光保存.室溫下放置一周后使用[9-11].將水解液稀釋到一定濃度后，在540 nm波長下用分光光度計測定其OD值，根據事先測得的葡萄糖標準曲線計算出水解液中還原糖的濃度.

1.4.4 產油微生物培養

產油培養基配制，向進行過脫毒處理的水解液每1 L中依次加入酵母提取物3.0 g,硫酸鎂0.5 g,磷酸二氫鉀8.0 g.種子液培養,挑取預先活化的斜面菌種一環,接入種子培養基,250 mL三角瓶裝液量為100 mL,于28 ℃、150 r/min條件下培養24 h，收獲種子液;發酵培養,以10%(W/V)接種量將種子液接種到250 mL裝液量為100 mL的脫毒水解液發酵培養基中,于28 ℃、150 r/min條件下培養7 d.

1.4.5 菌體油脂提取

過濾收獲菌體，熱酸解法提取發酵產物油脂[13].

2 結果與討論

木質纖維原料稀酸預處理的原理是稀酸在高溫下將半纖維素降解而溶出，從而提高纖維素酶對原料中纖維素的可及度[14-15].

2.1 酸熱預處理玉米穗軸的正交試驗結果

測定高溫酸預處理的水解液中還原糖含量，采用正交試驗表格記錄其數據.

表2 高溫高壓預處理正交試驗結果

分析表2中的正交試驗結果可以看出，121 ℃、0.1 MPa條件下，玉米穗軸稀酸水解液中還原糖含量變化明顯，比較3個因素的極差，可確定各試驗因素對水解液中還原糖含量的影響，且各個因素對預處理玉米穗軸的影響順序為：料液比>預處理時間>硫酸質量分數.

根據各組試驗因素結果可以看出：A取A1，B取B3，C取C3為好，即121 ℃、0.1 MPa條件下稀酸預處理玉米穗軸最好方法為：A1B3C3(料液比為1∶10，硫酸質量分數為0.7%，處理時間為2 h).

利用玉米穗軸等纖維質原料生產生物柴油具有廣闊的應用前景，但真正實現產業化還有許多工作要做，其中玉米穗軸中半纖維素的降解及水解液脫毒效果的好壞對于后續的微生物培養和微生物油脂的產量起著非常重要的作用.

2.2 不同脫毒方法對油脂產量的影響

通過不同的方法對玉米穗軸稀酸水解液進行脫毒處理后，進行微生物產油脂系列試驗.表3中列出了各種脫毒方法對霉菌油脂產量的影響，通過對比可以看出，相對于Ca(OH)2中和聯合活性炭吸附法、Ca(OH)2過中和法，Ca(OH)2中和聯合活性炭吸附及還原劑處理法脫毒效果較好，油脂產量高于另外兩種方法.說明這種方法對除去玉米穗軸稀酸水解液中的抑制物有一定的效果，也說明經過脫毒處理的玉米穗軸稀酸聯合高溫高壓預處理的水解液替代葡萄糖作為碳源培養微生物生產生物柴油具備可行性.

表3 不同脫毒方法處理玉米穗軸水解液培養霉菌的產油量

3 討 論

纖維質原料油脂、酒精等生物燃料的生產主要包括原料預處理、水解液脫毒、微生物培養產油等多個過程，但這些過程相互關聯，作為一個整體而存在.預處理是關鍵，應選擇經濟實用的預處理方法，從源頭減少抑制物的產生.由于原材料及預處理條件不同，預處理液組成有很大差別，應根據水解液中含有的主要抑制劑，選用合適的脫毒方法.但也應當認識到，微生物培養前進行脫毒處理必然會增加生物燃料的生產成本，使工藝過程復雜，同時也會造成部分糖的損失.所以在微生物培養過程中應盡量減少培養前的脫毒處理或者采用經濟實用的脫毒方法并應進一步優化其工藝條件.通過篩選或基因工程手段選育高抗性菌株，從而減少或消除抑制作用的影響，應作為未來研究工作的重點.

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[責任編輯：徐明忠]

A condition study of corn cob acid hydrolysis and hydrolysate detoxification

LIU Xiuhua，LIANG Liang，LI Yanxu,LIANG Feng

(Biorefinery Engineering Lab of Hena Province，Shangqiu Normal University，Shangqiu 476000，China)

One key point affect microbial oil production is the pre-treatment of lignocellulosic.This study used the most common farm waste——corn cob as raw materials，focused on the hydrolysis conditions of hemicellulose and detoxification method of hydrolysate.Result shows that the reducing-sugar in hydrolysate reached 49.68 g/L，when pre-treated the raw materials under 121 ℃ and 0.1MPa for 2 h with solid-liquid ratio 1∶10 and 0.7% H2SO4.According to the outcomes of fermentation using detoxicated hydrolysate，which was neutralized with Ca (OH)2and absorbed with active carbon，Trichodermalongibrachiatumhad an oil production of 3.188 g/L.This study has potential application prospect.

corn cob；Trichodermalongibrachiatum；bioenergy；detoxification；microbial oil

2017-04-16

河南省重點科技攻關資助項目(132102310039，142102310044)；河南省教育廳自然科學研究項目(13A180830)

劉秀花(1963—)，女，河南新鄉人，商丘師范學院教授，主要從事微生物資源、酶制劑、生物能源方面的研究.

TQ925

A

1672-3600(2017)09-0043-04