一株耐砷菌的鑒定及處理含砷廢水研究

唐 萌，張艮林，黃雄英，萬 靜，張紫涵

(1.云南大學建筑與規劃學院，云南 昆明650091；2.云南大學材料科學與工程學院，云南 昆明650091；3.國際河流與生態安全研究院，云南 昆明650091；4.云南大學生態學與環境學院，云南 昆明650091)

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一株耐砷菌的鑒定及處理含砷廢水研究

唐 萌1，張艮林2，黃雄英3，萬 靜4，張紫涵4

(1.云南大學建筑與規劃學院，云南 昆明650091；2.云南大學材料科學與工程學院，云南 昆明650091；3.國際河流與生態安全研究院，云南 昆明650091；4.云南大學生態學與環境學院，云南 昆明650091)

對從云南省個舊市大屯海篩選出的一株耐砷菌進行鑒定和除砷性能研究。經生理生化實驗和16S rDNA測序鑒定其為庫克菌(Kocuria carniphila)。實驗表明，此菌對模擬廢水中的As(Ⅲ)具有較好的去除效果。當pH值為8，發酵液投加量為5mL，CaCl2質量分數為5%，搖床轉速為180 r/min時除砷率達到最大值55%。

耐砷菌；16S rDNA測序；含砷廢水處理

砷(As)稱為類金屬，在世界范圍內廣泛存在，雖然含量很少，但卻是地殼中毒性最大的元素之一，其豐度為2 g/t。含砷廢水主要來源于有色金屬冶煉、硫化物的開采利用、農藥、染料、制酸、合金、玻璃及防腐劑等工業的排水，因此每年因工業生產會使大量的砷進入到環境中。

美國權威科學雜志公布的調查結果顯示，我國的新疆、內蒙古、甘肅、云南、河南和山東等地都是砷污染高危地區，砷含量高于10 μg/L的地區總面積約為58萬km2，近2000多萬人生活在砷污染高危地區[1-3]。由于水體砷污染對人體的危害，1993年世界衛生組織將飲用水中的砷標準由原來的50 μg/L降低為10 μg/L。在2007年,我國也將飲用水中的砷標準調整為10 μg/L，2006年美國環保局將砷列為第一位飲用水污染物[4-7]。水體砷污染已經造成了嚴重的環境問題，受到了社會各界的廣泛關注。本文通過對除砷微生物的研究，希望能發現并找到對砷有較高去除率的微生物，從而為微生物法除砷機理探究提供理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

菌種前期篩選自云南省個舊市大屯海，現為實驗室4℃保存。

種子培養基：酵母浸膏5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，初始pH為7.0，121℃滅菌15 min。

發酵培養基：蔗糖40.0 g/L、磷酸氫二鉀(分析純)5.0 g/L、磷酸二氫鉀(分析純)2.0 g/L、氯化鈉(分析純)0.1 g/L、酵母浸膏4.0 g/L、硫酸鎂(分析純)0.2 g/L，pH=7.0，115℃下滅菌15 min。

1.2 菌種鑒定

1.2.1 細菌形態觀察

細菌個體觀察：采用傳統革蘭氏染色法，取經活化20 h的菌液，通過涂片、干燥和固定后，再進行初染、媒染、脫色、復染等步驟，最后進行觀察。若菌體呈紅色，則為革蘭氏陰性菌；若菌體呈藍紫色，則為革蘭氏陽性菌。

細菌菌落觀察：取經活化20 h的菌液，稀釋后用涂布器涂布到LB固體培養基上，在30℃的恒溫培養箱中培養24 h后觀察菌落形態特征。

1.2.2 生理生化實驗[8,9]

根據《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》，本實驗主要進行了明膠液化實驗、淀粉水解實驗、伏-普實驗(VP實驗)、葡萄糖氧化發酵實驗 、檸檬酸鹽利用實驗和吲哚實驗。

1.2.3 16S rDNA序列鑒定[10-13]

DNA的提取采用土壤中總DNA的提取方法，設計PCR引物為：Eu 7F，5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；Eu 1540R，5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。PCR程序設定為：94℃預變性4 min；94℃ 45sec、55℃ 45 sec、72℃ 1 min，循環30次；72℃修復延伸10min；4℃保溫。PCR產物送上海生工生物工程技術服務公司進行測序，所得16S rDNA序列提交到Genbank核酸序列數據庫中，將16S rDNA序列與已知序列進行比對，下載與該菌株同源性較高的序列，通過Clustal軟件進行分析，然后用MEGA軟件構建該菌株的系統發育樹。

1.3 除砷條件優化研究

實驗以模擬廢水為研究對象，分別進行了不同的pH、發酵液投加量、CaCl2質量分數和轉速等條件下的單因素實驗，處理后的反應液采用原子熒光法進行測定。

2 結果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 菌株的形態學研究

此菌株的形態學特征鑒定結果表明：菌落形態成圓形、邊緣整齊、淡粉色、蠟狀、菌落小，表面濕潤光滑，細胞形態成較大球形(如圖1所示)。

2.1.2 菌株的生理生化特征研究

此菌株的生理生化特征研究結果如表1所示。

表1 菌株的生理生化特征研究結果

2.1.3 16S rDNA鑒定

將PCR產物送到上海生工生物工程技術服務公司進行測序，并將所得16S rDNA序列與Genbank核酸序列數據庫中的已知序列進行對比，然后經Clustal軟件進行同源性分析，并用MEGA軟件構建出該菌株的系統發育樹(如圖2所示)。

從菌株的系統發育樹可以看出，此菌株與庫克菌(Kocuria carniphila)在同一個分支上，并且此菌株的基因序列與庫克菌(Kocuria carniphila)的基因序列的同源性達到了98.3%。

因此，通過對此菌株的生理生化特征研究和16S rDNA測序鑒定，我們可以認為此菌株為庫克菌(Kocuria carniphila)。

2.2 除砷條件優化研究

2.2.1 pH值對除砷率的影響

配制50 mL濃度為100 mg/L的含As廢水5份，分別置于5個250 mL的三角瓶中，加入4 mL發酵液和5 mL 10%的CaCl2溶液，用0.1 mol/L的H2SO4或NaOH溶液調節pH值分別為2、4、6、8、10。置于30℃的恒溫震蕩箱中，以150 r/min的轉速處理2 h，靜置20 min取其上清液測定殘留As濃度，實驗數據如圖3所示。

由圖3可以看出，當pH在2～8時，除砷率隨pH的增大而逐漸增高；pH值在8～10時，除砷率隨pH的增大而減小；當pH值為8時，除砷率達到了最大值33.73%。由此可以看出，此菌株在偏堿性的環境中除砷率效果更好。

2.2.2 發酵液投加量對除砷率的影響

配制50 mL濃度為100 mg/L的含As廢水5份，分別置于5個250 mL的三角瓶中，用0.1 mol/L的H2SO4或NaOH溶液調節pH值為8，再加入5 mL 10%的CaCl2溶液，分別調節發酵液投加量為0、1、2、3、4、5、6 mL。置于30℃的恒溫震蕩箱中，以150 r/min的轉速處理2 h，并靜置20 min取其上清液測定殘留As濃度，實驗數據如圖4所示。

由圖4可以看出，當發酵液的投加量為0～1時，除砷率出現了劇增，除砷率從投加量為0時的6%增大到了發酵液為1時的36.62%；當發酵液投加量繼續增大時，除砷率也在逐漸增大。當發酵液投加量為5 mL時，除砷率達到了最大值47.66%，此后隨著發酵液投加量的增大，除砷率反而減小。因此對于此菌株而言，發酵液投加量為5 mL時為最佳投加量。

2.2.3 CaCl2濃度對除砷率的影響

配制50 mL濃度為100 mg/L的含As廢水5份，分別置于5個250 mL的三角瓶中，用0.1 mol/L的H2SO4或NaOH溶液調節pH值為8，發酵液投加量為5 mL，再加入5 mL質量分數(%)為0、5、10、15、20、25的CaCl2溶液。置于30℃的恒溫震蕩箱中，以150 r/min的轉速處理2 h，并靜置20 min取其上清液測定殘留As濃度，實驗數據如圖5所示。

由圖5可知，不同質量分數的CaCl2溶液對除砷率也有一定的影響。當不投加CaCl2溶液時，除砷率只有41%；當CaCl2溶液的質量分數為5%時，除砷率達到了最大值55%。之后隨著CaCl2溶液的質量分數的增大，除砷率緩慢減小。由此可知，CaCl2溶液對菌株的除砷有一定的促進作用。對此菌株而言，CaCl2溶液的最佳質量分數為5%。

2.2.4 搖床轉速對除砷率的影響

配制50 mL濃度為100 mg/L的含As廢水5份，分別置于5個250 mL的三角瓶中，用0.1 mol/L的H2SO4或NaOH溶液調節pH值為8，發酵液投加量為5 mL，再加入5 mL質量分數為5%的CaCl2溶液，調節搖床轉速為100、140、180、220、260、300 r/min。置于30℃的恒溫震蕩箱中，處理2 h，并靜置20 min取其上清液測定殘余As濃度，實驗數據如圖6所示。

由圖6可知，當搖床轉速為100～180 r/min時，隨著轉速的增加除砷率也在逐漸增大，在搖床轉速為180 r/min時，除砷率達到了最大值55%。之后隨著轉速的持續增大，除砷率反而減小。因此可以看出，對于此菌株除砷的最佳轉速為180 r/min。

3 結論與趨勢

本實驗從云南省個舊市大屯海篩選出來的菌株，對模擬廢水中的As(Ⅲ)具有較好的去除效果。經生理生化特征研究和16S rDNA鑒定，此菌株為庫克菌(Kocuria carniphila)。菌株的除砷率已達到了55%，后期的研究中我們將對菌株的除砷機理進行研究，從而進一步揭示此菌株對水體As(Ⅲ)的去除機制。

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The Identification of an Arsenic-Resistant Bacteria and its Ability of Treating Arsenic-containing Wastewater

TANG Meng1,ZHANG Gen-lin2,HUANG Xiong-ying3,WAN Jing4,ZHANG Zi-han4

(1.School of Architecture and Planning,Yunnan University, KunmingYunnan 650091,China)

The study on identification and arsenic removal performance of an arsenic-resistant bacteria’s from DatunLakeinGeJiu in Yunnan Province was conducted.It was identified to be Kocuriacarniphilathrough physiological and biochemical experiment and 16SrDNA sequence analysis.Experimental results showed that the bacteriahad a better removal effectforAs(Ⅲ)from simulated wastewater.The bacteria’s arsenic removal rate could reach 55%when the pH was 8,the amount of fermentation liquid was 5ml,the mass fraction of CaCl2was 5%, and the shaker’s rotating speed was 180r/min.

arsenic-resistant bacteria; 16SrDNA sequence analysis; treatment of arsenic-containing wastewater.

2017-05-18

國家自然科學基金(51468065)；云南省應用基礎研究計劃項目(2014FB111)；云南省教育廳科學研究基金資助性項目研究生項目(2016yjs004)；大學生創新創業訓練計劃項目(201510673006；201610673005)。

唐萌(1993-)，男，陜西省寶雞市人，碩士研究生，研究方向：重金屬污染防治。

張艮林(1978-)，男，副研究員，博士，研究方向：水體重金屬污染治理技術與應用。

X703

A

1673-9655(2017)05-0024-04