HPLC法同時測定冷凍保鮮冬蟲夏草中尿苷和腺苷

鄭永彪， 汪曉娟， 韓曉萍

(1.青海省食品藥品檢驗所，青海西寧810016;2.青海省制藥廠，青海西寧810003)

冬蟲夏草是我國著名的珍貴中藥，為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis(BerK.)Sacc.寄生在蝙蝠娥科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體［1］;主要含多種氨基酸、核苷類 (腺苷、尿苷、鳥苷)、冬蟲夏草甾醇、糖醇類 (β-谷甾醇、麥角甾醇、D-甘露醇)、脂肪酸、酯、烷烴等成分［2］。

冬蟲夏草干燥品收載于《中國藥典》2010年版一部，標準中有性狀和高效液相色譜法測定腺苷，規定腺苷質量分數不得低于0.010%［3］;冷凍保鮮冬蟲夏草系新采挖的冬蟲夏草除去似纖維狀的附著物及泥土等雜質，快速進行沖洗、清潔和甩干，然后冷凍、密封貯藏，為青海南英雪線王冬蟲夏草生物科技有限開發的新型加工品。前期預實驗表明，在同一色譜條件下能同時對尿苷和腺苷進行定量測定，且在冷凍保鮮冬蟲夏草中，尿苷的含有量遠高于腺苷，10批樣品的分析結果顯示尿苷含有量約為腺苷的5倍以上，故為有效全面地控制藥材質量，體現中藥整體用藥的物質基礎的優越型，本研究建立了冷凍保鮮冬蟲夏草中腺苷和尿苷同時測定的HPLC方法，該法簡便可行，精確可控，可用于冷凍保鮮冬蟲夏草的質量控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜儀，Waters2998二極管陣列檢測器，Empower 2工作站;Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent 1100 LC/MSD trap質譜儀;METTLER AB204電子天平;水浴鍋;超聲波震蕩器;密理博超純水器。

1.2 試藥 冬蟲夏草藥材10批 (批號分別為1～10，青海南英雪線王冬蟲夏草生物科技有限公司提供)，腺苷對照品 (879-200001，中國藥品生物制品檢定所)，尿苷對照品 (887-200001，中國藥品生物制品檢定所)，乙腈和甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件［4-5］色譜柱為 Waters sunfire(250 mm×4.6 mm，5 μm);以水為流動相A，以乙腈為流動相B，按表1進行梯度洗脫;檢測波長為260 nm;柱溫35℃;理論塔板數按尿苷峰計算應不得低于3000。

表1 梯度洗脫順序

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取尿苷對照品20 mg和腺苷對照品2 mg，置于100 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，制得每1 mL約含尿苷20 μg、腺苷2 μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品 (自然晾干，并同步測定水分)粉末0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱質量，超聲提取45 min(250 W，40 KHz)，取出，放冷至室溫，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，棄取初濾液，精密量取續濾液25 mL置于蒸發皿中，蒸干，殘渣用水溶解并轉移至10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得［6］。

2.4 系統適應性和專屬性考察 分別精密吸取上述兩種溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定即可。色譜圖見圖1，表明在該色譜條件下，尿苷和腺苷分離良好，說明樣品的處理方法能很好的去除雜質對目標色譜峰測定的干擾。

圖1 供試品和對照品的色譜圖

同時用LC-MS方法對上述兩種溶液中的目標峰進行了一致性指認。液相參數同上述2.1項，質譜參數為［7-8］:ESI源，霧化氣 (N2)體積流量為4.5 L/min，干燥氣體為12 L/min，干燥溫度380℃，掃描范圍為100～400 m/z，正離子掃描模式，在此色譜條件下的峰指認結果見表2，供試品溶液和對照品溶液中目標物質具有一致性，實驗結果表明在相應的色譜峰位置無雜質干擾。

表2 峰質譜指認結果

2.5 線性關系考察 精密稱取尿苷對照品5.31 mg，腺苷對照品6.18 mg，分別置于50 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，即得 (每1 mL含尿苷 106.2 μg，腺苷123.6 μg)，分別精密量取尿苷16.0 mL和腺苷2.0 mL，置50 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液 (每1 mL含尿苷33.98 μg，腺苷4.944 μg)。分別精密吸取此混合對照品溶液 1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mL加水稀釋并定容到10 mL，得一系列對照品溶液;按2.1項色譜條件進行分析，進樣量10 μL，記錄相應的進樣量和峰面積，以進樣量為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，計算回歸方程，結果見表3。

表3 尿苷和腺苷的線性實驗結果

結果表明，在所測的進樣范圍內，尿苷和腺苷的進樣量與峰面積之間呈現良好的線性關系。

2.6 精密度考察 分別精密吸取2.2項下的混合對照品溶液，按2.1項色譜條件進行重復進樣5次，進樣量10 μL，記錄峰面積值，結果尿苷和腺苷的RSD值分別為0.41%、0.63%，結果表明，本方法精密度良好。

2.7 穩定性試驗 取冷凍保鮮冬蟲夏草藥材樣品 (樣7)，按2.3項制備供試品溶液，在2.1項色譜條件下，分別于0、6、12、18、24、30、36、48 h進樣分析，進樣量 10 μL，記錄峰面積，結果尿苷和腺苷的 RSD值分別為0.87%、1.5%。結果表明，制備的供試品溶液在48 h內穩定，且穩定性良好。

2.8 重復性試驗 取冷凍保鮮冬蟲夏草藥材樣品 (樣7)5份，精密稱定，按2.3項供試品溶液制備法提取，在2.1項色譜條件下進行分析測定，分別計算尿苷和腺苷的質量分數，結果表明，尿苷和腺苷的質量分數分別為0.161%(RSD為0.54%)、0.0166%(RSD為1.0%)，證明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取冷凍保鮮冬蟲夏草藥材樣品 (樣7)6份，每份取0.1 g，精密稱定，按2.3項供試品溶液制備法提取，在2.1項色譜條件下進行分析測定，計算加樣回收率，結果見表4。結果表明，尿苷和腺苷的平均回收率分別為98.70%(RSD為0.48%)、97.39%(RSD為1.6%)，證明本方法精確度良好。

表4 回收率實驗結果 (n=6)

2.10 結果 按所建立的測定方法，對10批冷凍保鮮冬蟲夏草進行測定，結果表明:10批冷凍保鮮冬蟲夏草中按干燥品計，尿苷的質量分數范圍為0.129%～0.176%，平均質量分數為0.159%;腺苷的質量分數范圍為0.0143%～0.0300%，平均質量分數為0.0232%，結果均在此測定方法的線性范圍內。

上述實驗表明，該方法樣品處理簡便，回收率好，精密度，重復性均符合有關要求，可用于冷凍保鮮冬蟲夏草的質量控制。

3 討論

3.1 根據上述定量測定結果可以發現，10批冷凍保鮮冬蟲夏草中腺苷的質量分數范圍為0.0143%～0.0300%，平均質量分數為0.0232%，高于2010年版《中國藥典》中的限量0.010%;由于核苷類成分為生物代謝產物，其含有量越高表明越多的蟲體組織轉變成了菌絲體［9］。

3.2 在前期對冬蟲夏草干燥品指紋圖譜研究的基礎上［10］，比較了這10批冬蟲夏草新鮮品色譜圖與原來干燥品指紋圖譜的區別，見圖2，發現在相同稱樣量下冷凍保鮮冬蟲夏草中色譜峰的數量和面積均大于干燥品，表明冷凍保鮮冬蟲夏草具有較好的起效物質基礎。

圖2 冷凍保鮮冬蟲夏草和干燥品的圖譜比較

［1］趙余慶，于 明，陳立君，等.冬蟲夏草屬真菌化學研究概況［J］.中草藥，1999，30(12):950-953.

［2］石 巖，王鋼力，林瑞超，等.冬蟲夏草的化學成分綜述［J］.中醫研究，2006，19(7):54-56.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:106.

［4］欒 蘭，王鋼力，林瑞超，等.冬蟲夏草與蟲草發酵菌絲體的HPLC指紋圖譜比較研究［J］.中成藥，2010，32(6):893-897.

［5］張元杰，錢正明，陳肖家，等.HPLC法同時測定補益中藥中尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷的含量［J］.藥物分析雜志，2010，30(1):112-115.

［6］許 勇，王 柯，季 申.高效液相色譜法測定冬蟲夏草口服液中腺苷［J］.中成藥，2011，33(5):909-911.

［7］楊 釗，遲少云，張春輝.冬蟲夏草及其代用品中腺苷和蟲草素的LC-MS-MS定量分析研究［J］.中國中藥雜志，2007，32(19):2018-2021.

［8］黃蘭芳，郭方遒，梁逸曾，等.HPLC-ESI-MS測定冬蟲夏草和蠶蛹蟲草中腺苷和蟲草素含量［J］.中國中藥雜志，2004，29(8):762-764.

［9］梁洪卉，程 舟，楊曉伶，等.HPLC定量分析冬蟲夏草的主要核苷類有效成分［J］.中藥材，2008，31(1):58-60.

［10］王鋼力，金紅宇，韓曉萍，等.冬蟲夏草藥材的質量研究及存在問題［J］.中草藥，2008，39(1):115-118.