姜黃素通過IGF-1/Akt/FoxO3a通路保護(hù)魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的PD模型

李夢楠， 馬振凱， 白宏英

姜黃素通過IGF-1/Akt/FoxO3a通路保護(hù)魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的PD模型

李夢楠， 馬振凱， 白宏英

目的 探究姜黃素(Cur)對魚藤酮(Ro)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 建立魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的帕金森病模型，利用姜黃素進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分組為空白對照組，魚藤酮模型組(終濃度：0.1 μmol/L)，姜黃素干預(yù)組(終濃度：0.5 μmol/L、 1.0 μmol/L、 5.0 μmol/L 、10 μmol/L)。MTT比色法檢測細(xì)胞活力，AO/EB熒光染色法觀察細(xì)胞的凋亡情況，AnnexinⅤ-FITC/P雙染檢測細(xì)胞凋亡，Western-blot法檢測細(xì)胞內(nèi)IGF-1、Akt、FoxO3a的蛋白表達(dá)。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示：魚藤酮組較對照組細(xì)胞活力明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，0.5 μmol/L和1.0 μmol/L姜黃素干預(yù)組可減輕0.1 μmol/L魚藤酮對PC12細(xì)胞增殖活力的影響，明顯抑制了魚藤酮對PC12細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，與魚藤酮組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) Western-blot結(jié)果示：魚藤酮組較對照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，0.5 μmol/L和1.0 μmol/L姜黃素干預(yù)組IGF-1、磷酸化的Akt(p-Akt)、磷酸化的FoxO3a(p-FoxO3a)表達(dá)與魚藤酮組比明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。以上結(jié)果均顯示5.0 μmol/L和10 μmol/L姜黃素干預(yù)組與魚藤酮組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；結(jié)論 適宜濃度的姜黃素對魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的PD模型具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用呈濃度依賴性，其保護(hù)作用的機(jī)制可能與激活I(lǐng)GF-1/Akt/FoxO3a通路有關(guān)。

PC12細(xì)胞； 姜黃素； 魚藤酮； 細(xì)胞凋亡

帕金森病(PD)是一種老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變疾病，其主要病理特征為腦黑質(zhì)中多巴胺神經(jīng)元的死亡和黑質(zhì)-紋狀體通路的退化及部分殘存神經(jīng)元中路易斯小體(Lewy body，LB)的形成。 PD發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前常見因素包括氧化應(yīng)激損傷、線粒體結(jié)構(gòu)和功能的缺失、暴露環(huán)境、飲食、老齡化等。魚藤酮是最早用來作為一種殺蟲劑的神經(jīng)毒素，可透過血腦屏障選擇性的作用于線粒體復(fù)合物I和細(xì)胞微管[1]，引發(fā)脂質(zhì)過氧化和大量自由基生成、細(xì)胞內(nèi)鈣超載，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[2]。PC12細(xì)胞具有神經(jīng)分泌細(xì)胞和神經(jīng)元的性質(zhì)，且PC12細(xì)胞所含的酶類、膜受體、合成的遞質(zhì)等方面很接近中腦多巴胺神經(jīng)元[3]，是國內(nèi)外研究PD常用的細(xì)胞模型。蛋白激酶B(Akt)又稱PKB或Rac，在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用。磷脂酰肌醇-3羥基激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)在AKT通路的激活過程起到重要的作用：PI3K在細(xì)胞外生長因子的作用下激活并在細(xì)胞膜產(chǎn)生3，4二磷酸磷脂酰肌醇和3、4、5三磷酸磷脂酰肌醇，AKT在二磷酸磷脂酰肌醇的作用下產(chǎn)生同二聚體并達(dá)到部分激活的狀態(tài)，進(jìn)而在3、4、5三磷酸磷脂酰肌醇和PH結(jié)構(gòu)域的協(xié)助下AKT與細(xì)胞膜的結(jié)合并錨著，而二聚體進(jìn)一步增強(qiáng)了AKT的活性，最后活化的AKT隨后由細(xì)胞膜上釋放下來，使其得以到細(xì)胞漿內(nèi)繼續(xù)傳遞生物學(xué)信號。IGF-1是胰島素一號增長因子(insulin-like growth factor 1，IGF-1)。研究發(fā)現(xiàn)IGF-1通過激活PI3K/Akt途徑調(diào)節(jié)糖代謝起到抗細(xì)胞凋亡的作用。 IGF-1抑制凋亡作用機(jī)制：PI3K/Akt信號途徑被認(rèn)為是IGF-1抑制細(xì)胞凋亡的經(jīng)典途徑，IGF-1與IGF-1R的胞外域結(jié)合后引起跨膜β亞基結(jié)構(gòu)的改變，β亞基內(nèi)酪氨酸激酶活性即被激活產(chǎn)生自動磷酸化，或者直接活化PI3K，或者通過激活胰島素受體底物IRS-1，活化的IRS-1通過改變信號分子PI3K兩個(gè)亞基的比例使之活化[4]，從而激活A(yù)kt。PIP3與Akt結(jié)合，導(dǎo)致Akt從胞漿轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜，并使Akt的Ser473和Thr308位點(diǎn)磷酸化，促進(jìn)Caspase-3等下游底物發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞生存，抑制細(xì)胞凋亡[5]。姜黃素是從姜黃中分離出的多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，因其成本低廉、副作用小、抗氧化作用強(qiáng)等成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。而目前PD的治療以多巴胺的替代品和多巴胺受體激動劑為主，只能緩解臨床癥狀卻不能延緩多巴胺神經(jīng)元的減少甚至消亡。所以弄清楚PD的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的預(yù)防和治療方案是亟待解決的難題。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究姜黃素能否通過調(diào)節(jié)IGF-1、Akt、FoxO3a的表達(dá)直接作用于魚藤酮誘導(dǎo)的PD模型而發(fā)揮保護(hù)作用，旨在為PD的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 PC12細(xì)胞(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)，姜黃素，魚藤酮(北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司)；胰蛋白酶，DMEM-H培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液PBS(美國HyClone公司)，小牛血清(美國GEMINI公司)；吖啶橙AO、溴化乙錠EB(美國Sigma公司)，AnnexinⅤ-FITC 細(xì)胞凋亡試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)MTT(美國Amresco公司)，兔抗鼠IGF-1抗體、p-AKT抗體、p-FOX3a抗體(美國Santa cruz公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 PC12細(xì)胞置于15%的小牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液中，溫度37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1～2 d換液，待細(xì)胞鋪滿瓶底70%～80%后，用不含EDTA的胰酶消化后傳代培養(yǎng)，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)分為空白組：不添加任何藥物組；魚藤酮組：只加入魚藤酮組；魚藤酮+姜黃素(終濃度分別為0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L)組：終濃度0.1 μmol/L魚藤酮處理細(xì)胞24 h后再加入不同濃度的姜黃素，共同孵育24 h后收集各組細(xì)胞分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 PD細(xì)胞模型的建立 取對數(shù)期的PC12細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108～9/L，按照1×105～6接種于96孔板(100 μl/孔)，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育至鋪滿孔底約70%。96孔板從第2列至第8列分別為調(diào)零孔(無血清培養(yǎng)基填充)，空白對照組(不做藥物處理)，不同濃度的RO(5 nmol/L，20 nmol/L，100 nmol/L，500 nmol/L，1000 nmol/L)組，每組設(shè)5個(gè)附孔，培養(yǎng)24 h后每孔加5 mg/ml的MTT10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)孵育3～4 h，終止培養(yǎng)棄去孔內(nèi)液體，每孔加100 μl DMSO后放置于搖床上震蕩混勻10 min，待甲臜顆粒完全溶解后，用酶標(biāo)儀在570 nm處讀取吸光度值(OD值)。再按照計(jì)算公式姜黃素干預(yù)組細(xì)胞增殖活力=加藥組OD值/對照組OD值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

低劑量(5 nmol/L和20 nmol/L)魚藤酮處理該細(xì)胞24 h內(nèi)對細(xì)胞活性無明顯影響(P>0.05)；超過 100 nmol/L的魚藤酮對細(xì)胞活性具有明顯的抑制作用(P<0.05)，并且其抑制作用與所加魚藤酮濃度呈劑量相關(guān)性。而濃度為500 nmol/L和1000 nmol/L時(shí)，細(xì)胞活力抑制更為明顯，這可能與高濃度魚藤酮有直接損傷細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞死亡的作用。

我們選擇100 nmol/L的魚藤酮預(yù)處理細(xì)胞24 h以成功建立PD的細(xì)胞模型，再加入上述濃度的姜黃素進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 噻唑藍(lán)MTT比色法檢測姜黃素對魚藤酮細(xì)胞模型的活力 取對數(shù)期的PC12細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108～9/L，按照1×105～6接種于96孔板(100 μl/孔)，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育至鋪滿孔底約70%。96孔板從第2列至第8列分別為調(diào)零孔(無血清培養(yǎng)基填充)，空白對照組(不做藥物處理)，魚藤酮模型組(終濃度0.1 μmol/L)，姜黃素干預(yù)組(終濃度：0.5 μmol/L、 1.0 μmol/L、 5.0 μmol/L 、10 μmol/L)，每組設(shè)5個(gè)附孔，培養(yǎng)24 h后每孔加5 mg/ml的MTT10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)孵育3～4 h，終止培養(yǎng)棄去孔內(nèi)液體，每孔加100 μl DMSO后放置于搖床上震蕩混勻10 min，待甲臜顆粒完全溶解后，用酶標(biāo)儀在570 nm處讀取吸光度值(OD值)。再按照計(jì)算公式姜黃素干預(yù)組細(xì)胞增殖活力=加藥組OD值/對照組OD值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.4 AO/EB熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡 吖啶橙AO是一種具有膜通透性的熒光色素，可通過細(xì)胞核使核DNA或RNA染色發(fā)出綠色或黃綠色均勻熒光，在凋亡細(xì)胞中AO使凋亡小體染上致密的黃綠色熒光或黃綠色碎片顆粒而壞死細(xì)胞黃綠色熒光減弱甚至消失，溴化乙錠EB只能使死細(xì)胞染色產(chǎn)生橘黃色熒光，由此可區(qū)分正常、凋亡和壞死的細(xì)胞。步驟：細(xì)胞按3×105/ml的密度接種于6孔板上，加入姜黃素使其終濃度為0.5 μmol/L、 1.0 μmol/L、 5.0 μmol/L 、10 μmol/L預(yù)處理30 min后，加入魚藤酮終濃度為0.1 μmol/L，同時(shí)設(shè)置魚藤酮組和空白對照組。然后置入37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中生長3 h后，離心(1000 r/min、5 min)收集。加入預(yù)冷PBS液漂洗，離心，重懸，每20 μl細(xì)胞懸液中加1 μl AO/EB工作液，混勻后放置于暗處孵育5 min，每組取一滴懸液滴于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察攝像。

1.2.5 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測 在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中，AnnexinⅤ與PS有高度親和力，故可以通過細(xì)胞外側(cè)暴露的PS與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合，碘化丙啶(PI)是一種不能通過完整的細(xì)胞膜核酸染料，能夠透過凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將AnnexinⅤ與PI雙染色，就可將不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來。操作步驟：各組細(xì)胞按要求處理后離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次收集約(1～3)×105個(gè)細(xì)胞，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μl AnnexinⅤ-FITC混勻后加入5 μl PI，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。重復(fù)3次。

1.2.6 Western-blot法檢測細(xì)胞內(nèi)IGF-1、Akt、FoxO3a的表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)過不同的干預(yù)處理后收集細(xì)胞PBS洗一次，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰水均勻裂解10 min后，裂解液10000 r/min離心5 min。吸取上清液稀釋加入緩沖液，混勻后在沸水浴中加熱5 min使之變性，按80V 40 min，120 V 90 min的條件進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，將膜放在含一抗的5%脫脂奶粉中，一抗稀釋比例IGF-1(1∶1000)、p-AKT(1∶1000)、p-FOX3a(1∶1000)，4 ℃過夜，用TBST液洗膜4次，每次5 min，二抗(稀釋比例1∶4000)室溫下孵育1.5 h，TBST洗膜4次，每次5 min后在暗室進(jìn)行ECL顯影，用圖像分析軟件Quantity One分析條帶的積分光密度值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測細(xì)胞活力 姜黃素能減少魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增加PC12活細(xì)胞的數(shù)量。與空白對照組相比，所有經(jīng)魚藤酮處理后的細(xì)胞活性均有所下降(P<0.01)，姜黃素為0.5 μmol/L時(shí)開始發(fā)揮對魚藤酮致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，細(xì)胞活力較魚藤酮組增加15.0%；1.0 μmol/L時(shí)保護(hù)作用最強(qiáng)，PC12細(xì)胞活力較魚藤酮組增加36.0%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而姜黃素5.0 μmol/L 、10 μmol/L細(xì)胞活力分別較魚藤酮組增加4.6%、2.6%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖1)。

2.2 AO/EB熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡 在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，空白對照組(CO)細(xì)胞形態(tài)正常，幾乎都是發(fā)出綠色熒光；魚藤酮組(RO)處理過的細(xì)胞，可觀察到細(xì)胞發(fā)生了邊緣化、核凝集發(fā)綠色熒光等早期凋亡現(xiàn)象同時(shí)出現(xiàn)伴染色體破壞橘黃色熒光的晚期凋亡；加入姜黃素(Cur)0.5 μmol/L、 1.0 μmol/L、 5.0 μmol/L 、10 μmol/L預(yù)處理30 min后，姜黃素在0.5 μmol/L 時(shí)發(fā)橘黃色熒光的晚期凋亡細(xì)有所減少，1.0 μmol/L時(shí)晚期凋亡細(xì)胞減少最為顯著，5.0 μmol/L 、10 μmol/L雖然也有所減少但不明顯(見圖2)。

2.3 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡 空白對照組的細(xì)胞凋亡率為2.9%，魚藤酮處理后的細(xì)胞凋亡率上升至51.6%，與空白對照組相比有明顯的差異性(P<0.01)，0.5 μmol/L和1.0 μmol/L的姜黃素組細(xì)胞凋亡率分別為34.5%、18.7%明顯減輕了魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡(P<0.01)，而5.0 μmol/L和1 μmol/L的姜黃素組細(xì)胞凋亡率分別為44.8%、54.5%與魚藤酮組比較無顯著性差異(見圖3)。

2.4 Western-blot法檢測細(xì)胞內(nèi)IGF-1、Akt、FoxO3a的表達(dá) 見表1、圖4。

CO：空白對照組；RO：魚藤酮組；CU 0.5：0.5 μmol/L姜黃素干預(yù)組；CU 1.0：1.0 μmol/L姜黃素干預(yù)組；CU 5.0：5.0 μmol/L姜黃素干預(yù)組；CU 10：10 μmol/L姜黃素干預(yù)組。與空白對照組比較*P<0.01；與魚藤酮組比較#P<0.01

圖1 MTT法檢測細(xì)胞活力

CU 1.0 μmol/L+RO CU 5.0 μmol/L+RO CU 10 μmol/L+RO

圖2 AO/EB熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡

CO：空白對照組；RO：魚藤酮組；CU 0.5：0.5 μmol/L姜黃素干預(yù)組；CU 1.0：1.0 μmol/L姜黃素干預(yù)組；CU 5.0：5.0 μmol/L姜黃素干預(yù)組；CU 10：10 μmol/L姜黃素干預(yù)組。與空白對照組比較*P<0.01；與魚藤酮組比較#P<0.01

圖3 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡

圖4 細(xì)胞內(nèi)IGF-1、Akt、FoxO3a的表達(dá)

組別IGF-1p-Aktp-FoxO3a空白對照組魚藤酮組0.5μmol/L姜黃素組1.0μmol/L姜黃素組5.0μmol/L姜黃素組10μmol/L姜黃素組8.424±0.4301.620±0.215*5.846±0.301#7.615±0.208#2.002±0.3041.862±0.4139.602±0.2231.564±0.147*6.290±0.218#8.042±0.210#1.846±0.3571.628±0.4067.526±0.2060.928±0.213*5.021±0.197#6.885±0.189#1.439±0.3661.188±0.402

與空白對照組相比*P<0.01；與魚藤酮組相比#P<0.01

3 討 論

近十年來研究表明，許多因素參與PD的發(fā)生和發(fā)展過程，例如：氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥、細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡等，不同因素引起的PD最終表現(xiàn)為中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元(DA)的凋亡，也就是說PD發(fā)病的最終結(jié)果歸因于細(xì)胞凋亡這一共同通路[6]。

PI3K/Akt通路是介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞存活的一條經(jīng)典通路[7，8]，PI3K/Akt/FoxO3a通路是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要通路之一[9]。IGF-1對神經(jīng)元的保護(hù)作用多通過激動PI3K/Akt通路發(fā)揮作用[10]。IGF-1激動PI3K/Akt后，活化的PI3K通過3-磷酰化磷酸肌醇酯和磷酸肌醇依賴性激酶(PDK)共同作用而激活A(yù)kt，活化的Akt進(jìn)一步激動促存活因子的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡。FoxO3a是Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游重要的靶基因，活化的Akt可以使促凋亡轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a磷酸化失活，磷酸化的FoxO3a與DNA親和力下降，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，降低Bim蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞的凋亡[11]。姜黃素是從姜黃中提取的天然色素，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、清除自由基等廣泛的藥理作用[12]，姜黃素可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多種機(jī)制發(fā)揮對神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)它對ActD/TNF-a協(xié)同誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制[13]，但姜黃素能否通過激活I(lǐng)GF-1/Akt/FoxO3a通路發(fā)揮對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，報(bào)道極少。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示魚藤酮組細(xì)胞活力明顯降低、凋亡率明顯升高，0.5 μmol/L、 1.0 μmol/L明顯發(fā)揮了對魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，隨著姜黃素濃度的增加(5.0 μmol/L、 10 μmol/L)細(xì)胞活力和凋亡率較魚藤酮組比較沒有顯著變化。崔群力[14]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在一定濃度范圍內(nèi)發(fā)揮保護(hù)作用，濃度過高時(shí)保護(hù)作用較低，甚至起促氧化損傷作用，損傷可能與應(yīng)激因素激活熱休克蛋白、促進(jìn)a-突觸蛋白有關(guān)[14]。以上實(shí)驗(yàn)研究表明姜黃素在0.5～1.0 μmol/L范圍內(nèi)可以拮抗魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。魚藤酮組IGF-1、p-Akt、p-FoxO3a的表達(dá)明顯減弱，細(xì)胞活力明顯降低、凋亡率明顯升高；同時(shí)姜黃素濃度(0.5 μmol/L、 1.0 μmol/L)時(shí)IGF-1、p-Akt、p-FoxO3a的表達(dá)較魚藤酮組顯著增強(qiáng)且細(xì)胞活力較魚藤酮組明顯升高、凋亡率明顯降低，提示IGF-1/Akt/FoxO3a信號通路是姜黃素發(fā)揮對魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，姜黃素能增強(qiáng)PI3K/Akt通路中IGF-1的表達(dá)從而促進(jìn)p-Akt、p-FoxO3a表達(dá)增強(qiáng)，磷酸化的FoxO3a與DNA親和力下降，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，Bim蛋白表達(dá)下降，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。而高濃度(5.0 μmol/L、 10 μmol/L)的姜黃素組細(xì)胞IGF-1、p-Akt、p-FoxO3a的表達(dá)較魚藤酮沒有顯著增強(qiáng)，細(xì)胞活力和凋亡率較魚藤酮組比較沒有顯著變化。說明姜黃素在一定濃度范圍內(nèi)激活I(lǐng)GF-1/Akt/FoxO3a信號通路發(fā)揮對魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。

總之，姜黃素對魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用呈濃度依賴性，作用機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞IGF-1、p-Akt、p-FoxO3a的表達(dá)，通過該信號通路調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有關(guān)。但姜黃素能否通過其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用仍需要進(jìn)一步探索研究。

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Curcumin prevents the PD model of rote-none-induced PD12 cells through IGF-1 /Akt/FoxO3a signaling pathway

LIMengnan，MAZhenkai，BAIHongying.

(DepartmentofNeurology，TheSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014，China)

Objective To investigate the cytoprotection of curcumin(Cur) against rote-none(Ro)-induced injury and the molecular mechanisms underlying in PC12 cells. Methods The Parkinson model of PC12 cells was established with Ro，use Cur to intervene. The experiment group was blank control(Co) group，Ro model group(final contentration：0.1 μmol/L)，Cur intervention group(final contentration：0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、5.0 μmol/L、10 μmol/L). Cell viability was determined using MTT reduction assay，cell apoptosis was observed by the method of AO/BE fluo-rescence staining，flow cytometry to detect the apoptosis rate. the expressions of IGF-1，Akt and FoxO3a proteins were measured by Western blotting. Results MTT results showed：Ro group cell viability significantly decreased as compared with the Co group，the difference was statistically significant(P<0.01)；0.5 and 1.0 μmol/L Cur intervention groups significantly decreased the inhibitory rate of 0.1 μmol/L Ro on the growth of PC12 cells for 24 h，significantly inhibited the apoptosis of PC12 cells induced by Ro for 24 h as compared with the Ro group (P<0.01)；Western blot results showed：Ro group cell significantly decreased as compared with the Co group，the difference was statistically significant(P<0.01)；The expression of IGF-1，p-Akt and p-FoxO3a between 0.5 μmol/L and 1.0 μmol/L Cur intervention group and the Ro group all had statistics significance(allP<0.01 ). The results above all showed：5.0 and 10 μmol/L Cur intervention groups had no significant difference as compared with the Ro group(P>0.05). Conclusion Appropriate concentration of Cur had protective effect on the PD model by the mechanism of activating the IGF-1/Akt/FoxO3a pathway，and the protective effect was concentration dependent.

PC12 cells； Curcumin； Rotenone； Apoptosis

1003-2754(2017)07-0588-05

2017-03-28；

2017-06-17

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No. 142300410461)

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450014) 通訊作者：白宏英，E-mail：hybai@126.com

R742.5；Q26

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