腺苷激酶抑制劑ABT-702在大鼠腦缺血再灌注損傷中的保護作用及機制

郭 升， 殷 闖， 譚 軍

腺苷激酶抑制劑ABT-702在大鼠腦缺血再灌注損傷中的保護作用及機制

郭 升1， 殷 闖2， 譚 軍2

目的 探討腺苷激酶抑制劑ABT-702在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用。方法 雄性SD大鼠84只，隨機分為對照組、假手術組、模型組、ABT-702組，每組21只，所有大鼠在再灌注后進行神經功能缺失評分，每組選取6只進行TTC染色檢測梗死體積；各組再隨機選取9只分為3個亞組，在不同時間點通過HPLC法檢測腦組織腺苷含量；最后各組再隨機選取6只通過PCR法檢測Beclin1的表達。結果 ABT-702組神經缺失功能評分低于模型組；模型組及ABT-702組在再灌注后TTC染色均有梗死灶形成，但ABT-702組的梗死體積明顯低于模型組；各組腦組織中均檢測出腺苷，但ABT-702組的含量明顯高于其它各組；通過PCR法檢測發現各組均有自噬蛋白Beclin1的表達，但ABT-702組表達量更大。結論 ABT-702對大鼠缺血再灌注損傷具有保護作用，其機制可能是通過上調體內腺苷含量并增強自噬作用，從而減輕腦組織及神經元損傷的程度。

ABT-702； 缺血再灌注； 腺苷含量； Beclin1

腺苷(adenosine)是廣泛存在于人體細胞內的內源性核苷，是神經系統中興奮性的調劑遞質，自1920年以來，腺苷已在醫學及生物學研究中被證實對于神經、心血管等機體系統具有多種保護作用。腺苷激酶(adenosine kinase，ADK)是調節機體內腺苷代謝水平的關鍵酶，其將腺苷磷酸化后轉換為腺嘌呤核糖核苷酸(Adenosine monophosphate，AMP)，從而導致腺苷含量降低。近年來對腺苷的研究的過程中發現，腺苷在體內會被腺苷激酶在幾秒鐘之內磷酸化為磷酸腺苷，因此其半衰期短，故而選擇通過直接給予外源性腺苷，很難被機體較長時間地有效利用。基于此，通過利用腺苷激酶抑制劑，抑制腺苷激酶的水平以提高腺苷水平逐漸成為研究熱點。ABT-702是一種新型的非核苷類腺苷激酶抑制劑(見圖1)[1]，其通過抑制炎癥等多種方式在疾病中起到保護作用[2]，但是目前暫無相關研究及文獻報道其在大鼠腦缺血性再灌注損傷中是否有保護作用。本研究通過建立缺血再灌注大鼠模型，觀察應用ABT-702后，大鼠腦組織腺苷含量變化及腦缺血損傷自噬相關蛋白Beclin1的變化，來探索ABT-702在大鼠腦缺血性再灌注損傷中是否會起保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選用的實驗動物為新鄉醫學院動物實驗中心提供的雄性Sprague-Dawley大鼠84只，體重均介于250～300 g之間。

1.2 主要試劑及儀器 腺苷激酶抑制劑ABT-702 dihydrochloride購自美國ApexBio公司，腺苷標準對照品購自Solarbio公司，HPLC法檢測腺苷含量使用美國Agilent Technologies 1260 Infiniby高效液相色譜儀進行檢測，Beclin1和β-actin引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 將雄性SD大鼠隨機分為對照組、假手術組、模型組、ABT-702組，每組21只。其中對照組在處死前12 h禁止進食及禁水，假手術組、模型組、ABT-702組在術前12 h禁用食、水。

1.3.2 實驗模型制備 模型組及ABT-702組使用尼龍線線栓法行大腦中動脈栓塞術(middle cerebral artery occlusion，MCAO)。SD雄性大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 ml/kg)麻醉，將成功麻醉后的SD大鼠仰臥固定于大鼠解剖專用手術臺上，對頸部皮膚進行備皮并消毒，用手術刀沿大鼠頸正中線縱向切開約2.5～3 cm皮膚，逐層分離肌肉，將大鼠的右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)、頸內動脈(internal carotid artery，ICA)充分暴露并使用玻璃分針對其周圍神經與血管進行充分分離。使用無菌縫線將ECA結扎，將ICA分離至顱底，動脈夾充分夾閉ICA及CCA后，使用眼科剪在CCA上剪出斜形小口，將準備好的尼龍線輕輕插入斜形小口，當線頭進入到ICA后及時松開ICA上的動脈夾，繼續插入尼龍線，使其到達至大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)處，插入的深度約為17～19 mm，將MCA的血流予以阻斷。固定尼龍線，消毒并進行逐層縫合，皮膚外的尼龍線使用記號筆涂色，保持體溫，并腹腔注射生理鹽水2 ml，以防大鼠術后脫水。ABT-702組給予腺苷激酶抑制劑(ABT-702 3.0 mg/kg)腹腔注射，模型組給予腹腔注射同等劑量的生理鹽水。栓塞2 h后，將尼龍線輕輕拔出至CCA主干，恢復大鼠大腦中動脈及Willis環的血液供應。假手術組僅切開頸部皮膚后，分離ICA、ECA、CCA后進行逐層縫合并給予消毒，術后給予生理鹽水2 ml腹腔注射。對照組僅腹腔注射生理鹽水2 ml。

1.3.3 神經功能缺失評分 模型組及ABT-702組大鼠再灌注后(空白組及假手術組在相同時間點進行評分)，均進行神經功能缺失評分，評分標準采用Zea Longa[3]的5分制方法進行評價。評分方法：0分：未發現神經功能缺損的癥狀；1分：線栓對側前上肢不能完全伸展；2分：大鼠行走時上肢不能伸展完全；3分：大鼠進行行走時向被阻塞大腦的對側傾倒：4分：大鼠出現昏迷及意識喪失。1～3分為納入標準，0分及4分為排除標準。

1.3.4 TTC染色計算梗死體積 各組選取6只大鼠于再灌注6 h后，將SD大鼠于冰盤上斷頭后，分離大腦，將大腦冷凍后(置于-20 ℃冰箱中快速冷凍)，再在預冷的大鼠腦槽中，將大鼠大腦均勻切成5個冠狀切片，將各冠狀切片放置在2%TTC染液中(pH 7.4)，將染液放入恒溫箱(溫度設定為38 ℃)染色30 min，之后將腦片放入4%多聚甲醛溶液中固定約20h左右，用高清數碼相機對腦片進行拍照，利用Image Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析，計算腦組織中梗死的體積。

1.3.5 HPLC法檢測腦組織腺苷含量變化 各組選取9只大鼠，每個組別再分為3個亞組，分別于再灌注后2 h，6 h，12 h后在冰盤上斷頭取出大腦腦組織，并將腦組織迅速放于液氮內凍干，在冰凍狀態下，對腦組織精確稱重后，放入20 ml的組織勻漿器中，加入其質量(g)10倍體積(ml)的4 ℃高氯酸提取溶液(含乙二胺四醋酸二鈉0.2 mmol/L和高氯酸0.1 mmol/L的混合溶液)，在冰浴下充分研磨勻漿，于4 ℃離心機中以12000 r/min的速度離心10 min，取離心后的上清液經針頭濾器過濾后，放入-80 ℃超低溫冰箱中備用。應用高效液相色譜儀進行腺苷含量檢測，進樣時，色譜柱選用Bio Pearl-HC Column C18(4.6 mm×250 mm)，流動相使用甲醇-水(含有磷酸氫二鈉4 mmol/L，磷酸二氫鈉50 mmol/L，pH值為5.8)(18：82)，流速調試為1.2 ml/min，每次進樣量為20 μl，色譜柱柱溫設置為40 ℃，波長為254 nm，經軟件分析后，計算腦組織中腺苷含量。

1.3.6 PCR法檢測腦組織中Beclin1的表達 每組選取6只大鼠，在缺血再灌注6 h后，進行RT-PCR檢測。Beclin1上游引物：5-TTCAAGATCCTGGACCGAGTGAC-3’，下游引物：5’-AGACACCATCCTGGCGAGTTC-3’，產物長度為142bp。

β-actin上游引物：5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，下游引物：5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’，產物長度為240 bp。將取出的大鼠右側額頂葉大腦皮質組織放入2 ml組織勻漿器內，加入Trizol組織提取液1 ml，充分研磨勻漿，提取腦組織中的總RNA，測出總RNA的濃度，同時計算A260/A280的比值。之后以總RNA為合成模板，將其合成為cDNA，再后以cDNA為模板進行PCR擴增，循環反應條件為：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；59 ℃，45 s；72 ℃，30 s，共循環40次；72 ℃，5 min。反應結束后于1%瓊脂糖凝膠中電泳，經BIO-RAD成像系統進行影像顯影，利用image J軟件計算Beclin1的表達量。

2 結 果

2.1 神經功能缺失評分結果 對照組與假手術組無神經功能缺失癥狀，通過Zea Longa法進行評分后，均為0分，模型組與ABT-702組均有神經功能缺失癥狀，但ABT-702神經功能缺失評分低于模型組，差距具有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

2.2 TTC染色后梗死體積 對照組及假手術組TTC染色后未見梗死區域，模型組及ABT-702組均可見大片梗死區域(TTC染色后為白色)。但ABT-702組梗死體積與模型組相比，梗死體積小于模型組，差距具有統計學意義(P<0.05)(見表2)。

2.3 HPLC法檢測大鼠大腦腺苷含量變化 各組在再灌注后，分別通過HPLC法在不同時間點(2 h、6 h、12 h)進行腦組織中腺苷含量檢測。結果提示，各組在各時間點均可以檢測處腺苷的存在。對照組與假手術組兩組對比，在各時間點腺苷含量水平沒有差距，模型組與ABT-702組在再灌注2 h、6 h時腺苷含量均高于對照組與假手術組組。ABT-702組與模型組對比，ABT-702組在再灌注各時間段腺苷含量水平均高于模型組。但是在再灌注12 h后時ABT-702組的腺苷含量水平低于本組再灌注后2 h及6 h時的水平(見圖2、表3)。

2.4 腦組織中Beclin1的表達 各組在再灌注6 h后，Beclin1均有表達，但模型組Beclin1的表達量高于對照組與假手術組。而ABT-702組的Beclin1表達量明顯高于其它3組(見表4)。

表1 各組神經功能缺失評分±s)

與對照組、假手術組相比較▲P<0.05，與模型組相比較*P<0.05

表2 各組TTC染色后大腦梗死體積的比較±s)

與對照組、假手術組相比較▲P<0.05，與模型組相比較*P<0.05

表3 各組不同時間點腺苷含量變化±s)

與對照組、假手術組相比較▲P<0.05，與模型組相比較*P<0.05

表4 各組在再灌注6 h后Beclin1的表達

與對照組、假手術組相比較▲P<0.05，與模型組相比較*P<0.05

圖1 ABT-702的結構圖

圖2 HPLC法檢測腺苷含量高效液相色譜圖

圖3 RT-PCR法檢測Beclin1的表達水平

3 討 論

卒中在導致人類死亡的疾病中排名第2。腺苷已經被證實在缺血性腦損傷中具有保護作用，但腺苷半衰期短，在體內數秒內迅速被腺苷激酶磷酸化，降低機體內腺苷含量。動物大腦發育初期以及出現急性大腦損傷時，腺苷激酶會隨之急劇升高，從而降低了顱內腺苷水平，所以可以通過抑制腺苷激酶而增加腺苷水平。5’-Amino-5’-deoxyadenosine、5’-iodotubercidin等早期的腺苷激酶抑制劑可以抑制腺苷激酶的水平，但是同時發現這些早期的抑制劑因為腺苷結構相近似，從而會產生多種毒副作用，由于它們在和腺苷一樣，在體內半衰期短，口服的生物利用度和細胞穿透性差，缺乏藥物選擇性，易形成細胞毒性代謝物，因而應用受到限制[4，5]。研究發現非核苷類的腺苷激酶抑制劑生物利用度較高，細胞穿透性較強，且細胞毒性相對較小，且對細胞合成的DNA無明顯的毒副作用，因而受到重視并引起新的研究熱潮[6]，非核苷類腺苷激酶抑制劑中，ABT-702作為一種新型的抑制劑，已被證實在年齡性聽力功能損傷、糖尿病性腎病、視神經病變、佐劑性關節炎、糖尿病視網膜病變[7～10]等多種疾病中具有保護作用，也有學者通過18-FDG PET證實了ABT-702的增加降低了腦內局部區域的腺苷激酶的水平[11]。但是目前應用ABT-702進行缺血性腦血管病的研究尚少。

自噬是在真核細胞中發生的程序死亡中的一中特殊方式，自噬體將體內的蛋白質與其它成分的細胞以雙側膜的形式進行包裹，然后同體內的溶酶體相結合后形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物，以此實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新，以維持機體的穩態和細胞的生長[12]。Beclin1基因又名BECN1，與酵母ATG6為同系物，Beclin 1是參與自噬調控的重要基因，其表達的強度與細胞自噬的發生有密切關系，早在1999年，Liang等已經證實通過上調Beclin1基因水平，能夠促進自噬的發生[13]。Beclin1作為自噬發生的特異性標記蛋白，其應用在研究腫瘤、退行性神經病變、缺血性腦血管病等多個疾病領域中。2005年，Zhu等人研究發現，在缺血性腦損傷中，腦組織的自噬現象明顯增多，但是在正常腦組織中，自噬現象發生較少[14]。

本研究通過制作大鼠腦缺血再灌注損傷模型，給予大鼠藥物ABT-702應用，觀察大鼠再缺血再灌注損傷中的損傷程度，發現在腺苷激酶抑制劑應用后，大鼠神經功能缺損癥狀減輕，其缺血后梗死的面積也明顯減少。同時，為了證實是否是因藥物保護而使缺血再灌注損傷減輕，通過高效液相色譜儀進行腺苷含量的測定，發現藥物應用后，腺苷含量明顯升高，并且應用ABT-702后，在再灌注6 h時腺苷含量最高，而腺苷對腦缺血性損傷有明顯的保護作用，從而證實了ABT-702抑制了腺苷激酶，提高了損傷后大鼠腦組織內的腺苷含量。而為研究ABT-702是否在大鼠腦缺血性損傷中增強細胞自噬，通過PCR對Beclin1進行檢測，發現在應用ABT-702后Beclin1蛋白水平明顯升高，因此，提示腺苷激酶抑制劑可能通過增強損傷后細胞自噬，在腦缺血再灌注損傷中起到保護作用。但是ABT-702對激活自噬的具體機制以及在自噬發生的上下游通路中的作用，尚不清楚，需進一步研究，以便為今后缺血性腦血管的深入研究以及新的藥物治療靶點提供了新的思路。

[1]Boyle DL，Kowaluk EA，Jarvis MF，et al. Anti-inflammatory effects of ABT-702，a novel non-nucleoside adenosine kinase inhibitor，in rat adjuvant arthritis[J]. J Pharmacol Exp Ther，2001，296(2)：495-500.

[2]Pye C，Elsherbiny NM，Ibrahim AS，et al. Adenosine kinase inhibition protects the kidney against streptozotocin-induced diabetes through anti-inflammatory and anti-oxidant mechanisms[J]. Pharmacol Res，2014，85：45-54.

[3]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke，1989，20(1)：84-91.

[4]Kowaluk EA，Jarvis MF. Therapeutic potential of adenosine kinase inhibitors[J]. Expert Opin Investig Drugs，2000，9(3)：551-564.

[5]Otsuguro K，Tomonari Y，Otsuka S，et al. An adenosine kinase inhibitor，ABT-702，inhibits spinal nociceptive transmission by adenosine release via equilibrative nucleoside transporters in rat[J]. Neuropharmacology，2015，97：160-170.

[6]Butini S，Gemma S，Brindisi M，et al. Non-nucleoside inhibitors of human adenosine kinase：synthesis，molecular modeling，and biological studies[J]. J Med Chem，2011，54(5)：1401-1420.

[7]Vlajkovic SM，Guo CX，Telang R，et al. Adenosine kinase inhibition in the cochlea delays the onset of age-related hearing loss[J]. Exp Gerontol，2011，46(11)：905-914.

[8]Steinsapir KD，Goldberg RA. Traumatic optic neuropathy：an evolving understanding[J]. Am J Ophthalmol，2011，151(6)：928-933.

[9]Ahmad S，Elsherbiny NM，Bhatia K，et al. Inhibition of adenosine kinase attenuates inflammation and neurotoxicity in traumatic optic neuropathy[J]. J Neuroimmunol，2014，277(1/2)：96-104.

[10]Zhu XF，Zou HD. PEDF in diabetic retinopathy：a protective effect of oxidative stress[J]. J Biomed Biotechnol，2012，2012：580687.

[11]Parkinson FE，Paul S，Zhang D，et al. The effect of endogenous adenosine on neuronal activity in rats：an FDG PET study[J]. J Neuroimaging，2016，26(4)：403-405.

[12]Deretic V. Multiple regulatory and effector roles of autophagy in immunity[J]. Curr Opin Immunol，2009，21(1)：53-62.

[13]Liang XH，Jackson S，Seaman M，et al. Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1[J]. Nature，1999，402(6762)：672-676.

[14]Zhu C，Wang X，Xu F，et al. The influence of age on apoptotic and other mechanisms of cell death after cerebral hypoxia-ischemia[J]. Cell Death Differ，2005，12(2)：162-176.

The Effects of ABT-702 on Ischemia-reperfusion Injury of Brain in Rats

GUOSheng，YINChuang，TANJun.

(TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity，Xinxiang453100，China)

Objective To investigate the effect of adenosine kinase inhibitor ABT-702 on ischemia-reperfusion injury in rats. Methods 84 male rats were randomly divided into control group，sham operation group，model group and ABT-702 group，21 rats in each group. All rats

neurological deficit score after reperfusion. We selected 6 rats to detect the infarct volume according to TTC staining in each group. Then we selected 9 rats and divided into three subgroups randomly to detect the adenosine content of brain tissue by High Performance Liquid Chromatography(HPLC) at different time points in each group. Six rats were randomly selected to detect the Beclin1 expression by RT-PCR in each group at last. Results The neurological functional score of ABT-702 group was lower than that model group；Both model group and ABT-702 group had the infarct after reperfusion according to TTC staining. But the infarct volume of ABT-702 group was significantly lower than the model group；The adenosine was contained in brain tissues of all groups，but the ABT-702 group was significantly higher than other groups；The autophagy marker protein Beclin1 was expressed in each group by PCR method but the ABT-702 group expressed more Beclin1 than other groups. Conclusion ABT-702 has protective effects on ischemia reperfusion injury in rats. The mechanism may be reduce the degree of damage of brain tissue and neurons by increasing the level of adenosine and enhancing the autophagy.

ABT-702； Ischemia reperfusion； Adenosine content； Beclin1

1003-2754(2017)07-0621-04

2017-03-05；

2017-06-20

(1.新鄉醫學院第一附屬醫院，河南 新鄉 453100；2.新鄉醫學院第三附屬醫院，河南 新鄉 453003) 通訊作者：譚 軍，E-mail：tanjun1997@126.com

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