肝龍膠囊聯合水飛薊賓膠囊在體外對大鼠肝星狀細胞增殖活性的影響研究*

楊強麗，李輝，賴泳

（大理大學藥學與化學學院藥理學教研室，云南 大理 671000）

肝龍膠囊聯合水飛薊賓膠囊在體外對大鼠肝星狀細胞增殖活性的影響研究*

楊強麗，李輝，賴泳

（大理大學藥學與化學學院藥理學教研室，云南 大理 671000）

目的研究臨床常用抗肝纖維化藥物水飛薊賓膠囊單用及聯合肝龍膠囊對大鼠肝星狀細胞（HSC）增殖活性的影響，評價肝龍膠囊在體外對水飛薊賓抗肝纖維化作用的影響。方法采用2因素5水平完全實驗，單獨或聯合使用不同劑量水飛薊賓膠囊和肝龍膠囊在不同時間作用于HSC，并用MTT比色法測定HSC增殖影響。結果水飛薊賓膠囊與肝龍膠囊合用增強水飛薊賓膠囊對HSC的抑制作用，尤其是0.063、0.125和0.250 mg/ml濃度的水飛薊賓膠囊與不同濃度肝龍膠囊合用后，水飛薊賓膠囊的作用明顯增加，與單用水飛薊賓膠囊組比較差異均有統計學意義（<0.05）。水飛薊賓膠囊聯合不同濃度肝龍膠囊的IC50值與單用水飛薊賓膠囊的IC50值相比較，在24、48和72 h時均有降低，且水飛薊賓膠囊與不同濃度肝龍膠囊聯合后，其合用指數CI<1.0，呈現出協同作用，增強了水飛薊賓膠囊對HSC細胞的抑制作用。結論肝龍膠囊在體外能增強水飛薊賓膠囊的抗肝纖維化作用。

肝星狀細胞；水飛薊賓膠囊；肝龍膠囊；細胞活性

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是一種慢性損傷的反應，促進細胞外基質蛋白的積累，最終可導致肝硬化和肝癌，嚴重威脅著肝慢性疾病患者的健康和生活，但目前沒有有效的藥物或治療方法。肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）是正常肝臟引起肝纖維化的中心環節，HSC被激活后可轉化成肌纖維母細胞，誘發促纖維化細胞因子的分泌，膠原合成增加[1-2]。肝纖維化與肝硬化不同的是，肝纖維化為可逆性病變，因此，抑制肝纖維化的發生和發展，對預防和治療慢性肝病和肝硬化具有重要意義。

水飛薊素是從菊科草本植物水飛薊果實提取的活性成分，主要治療肝膽系統疾病。水飛薊素包括水飛薊寧、異水飛薊賓及水飛薊賓等，其中，水飛薊賓的保肝活性最強，量也最高。水飛薊賓膠囊應用廣泛，療效確切，臨床上主要用于治療急慢性肝炎和肝纖維化。根據以往的研究，水飛薊賓膠囊具有抗纖維化、抗炎、免疫調節促進蛋白合成、抗氧化、調節細胞周期、細胞再生及誘導細胞凋亡等作用。在膽管結扎的肝纖維化模型中發現，水飛薊賓膠囊可降低35%的總膠原蛋白量，抑制肝臟TIMp1、TGF-β1及I型膠原的mRNA表達水平[3-4]。水飛薊賓膠囊能改善大鼠酒精性肝組織損傷[5]，減輕肝纖維化。美洲大蠊（periplaneta mericana），為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲。在民間，人們用蟑螂來治療肝炎或肝硬化等疾病者[6]。藥理作用主要包括抗病毒作用、組織修復作用、消炎等。肝龍膠囊作為肝細胞膜穩定劑，主要用于抗肝炎的中藥新藥[7]，具有療效較好、給藥方便、無不良反應等優點。肝龍膠囊對大鼠慢性酒精性肝損傷也有顯著的防治作用[8]。肝龍膠囊可保護CCl4所致的小鼠肝損傷，此外肝龍膠囊有顯著的抗乙型肝炎作用并對各種刺激因素導致的肝損傷具有修復作用[9]。有研究表明[10]，美洲大蠊提取物對大鼠HSC有抑制作用。但肝龍膠囊單獨用藥治療肝纖維化的臨床效果不理想，聯合用藥可能會有較好的治療效果，且肝龍膠囊與水飛薊賓膠囊聯合使用作用于HSC進行體外抗肝纖維化的研究并未見報道。因此，本研究選用大鼠HSC，給予肝龍膠囊和水飛薊賓膠囊聯合處理，觀察藥物對細胞增殖抑制作用，來探討肝龍膠囊在體外對水飛薊賓膠囊抗肝纖維化的影響。本文采用MTT法檢測肝龍膠囊與水飛薊賓膠囊聯合對大鼠HSC細胞的體外增殖抑制作用，為尋找治療肝纖維化的藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細胞株：大鼠肝星狀細胞（HSCT6）購自中國科學院昆明細胞庫（No：KCB200703YJ）。試劑：DMEM培養基粉末（美國Gibco公司Lot：1710802），Hepes（北京索萊寶公司），碳酸氫鈉（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司），胎牛血清（FBS，美國Gibco公司Lot：1618862），噻唑藍（MTT，北京索萊寶公司Lot：1028D056）。藥品：水飛薊賓膠囊（天津天士力圣特制藥有限公司，批號：16041601）；肝龍膠囊（昆明賽諾制藥有限公司，批號：550706087）。

1.2 儀器與設備

Thermo Scientific Series二氧化碳恒溫培養箱（美國Thermo公司），CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），Synergy HT多功能酶標儀（美國BIO Tek公司），80-2型臺式點的離心機（江蘇省金壇市科析儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 MTT的配制（5 mg/ml）精密稱取500 mg MTT粉，將其溶于100 ml滅菌水中，超聲30 min，待MTT粉完全溶解后，避光，-20℃冰箱內保存。DMEM培養基的配制[1%青鏈霉素抗生素（10 000 IU/ml的青霉素，10 000μg/ml的鏈霉素）+10%胎牛血清]：先將DMEM溶于1L滅菌水中攪拌15 min，溶解完畢加入4.766 g Hepes并攪拌15 min后加入碳酸氫鈉2.0 g，同樣繼續攪拌15 min。在超凈臺內用0.22μm濾膜進行過濾，4℃冰箱內保存備用。使用前，在超凈臺內分別加入10%的胎牛血清和1%青鏈霉素抗生素，4℃冰箱保存。

1.3.2 細胞培養將細胞從-80℃超低溫冰箱取出，在37℃內搖晃至融化，將細胞凍存液吸入裝有10 ml培養基的15 ml離心管內，2 000 r/min；遺棄上清液，加入7～8 ml的DMEM培養基對細胞吹打均勻，再吸入裝有新鮮培養基的培養瓶內吹打均勻。并放37℃、5%CO2培養箱內培養；當細胞長到80%左右時，就對其進行傳代。

1.3.3 藥物濃度篩選種板：將HSC細胞經過消化離心后，用新的培養基吹打均勻，其種板密度為6×104個/ml，并設空白對照組和陰性組對照。并置于37℃、5%CO2培養箱內培養細胞12 h，使其完成貼壁。分組：吸棄培養基上清液，加入培養基和藥物溶液：肝龍膠囊（A）3.750、1.880、0.938、0.469和0.235 mg/ml，水飛薊賓膠囊（B）以1.000、0.500、0.250和0.125和0.063 mg/ml濃度進行2因素5水平完全實驗設計，并設立單獨用藥組。并置37℃、5%CO2培養箱內分別培養24、48和72 h。遺棄培養基，用PBS清洗2次，每孔加入MTT溶液20μl，繼續孵育4 h后，加入150μl DMSO，使用酶標儀490 nm處檢測光密度（OD）值。

1.4 統計學方法

數據處理用SPSS 17.0軟件。所得數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用檢驗，多組數據比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，<0.05為差異有統計學意義。抑制率（fa）=（實驗組OD值-空白組OD組）（/陰性組OD值-空白組OD值）×100%；IC50值根據細胞生長抑制率-藥物濃度繪制生長曲線。聯合指數CI=AB（聯合組OD值/陰性OD值）/A（單用A藥組OD值/陰性OD值）×B（單用B藥組OD值/陰性OD值）。

2 結果

2.1 HSC細胞的形態

HSC被不同濃度處理不同時間后，倒置顯微鏡下放大4倍觀察細胞的形態特征，陰性對照組細胞狀態良好，緊貼板底，細胞呈纖維樣。用0.469 mg/ml肝龍膠囊處理24 h后HSC細胞狀態良好，細胞形態未出現太多改變。而單用0.125 mg/ml水飛薊賓膠囊處理24 h后HSC細胞狀態與陰性對照組的HSC細胞相比，細胞數有一定程度的減少，且細胞形態縮短或呈球狀。而0.469 mg/ml肝龍膠囊聯合0.125 mg/ml水飛薊賓膠囊處理24 h后HSC細胞數明顯減少，細胞形態基本上呈球狀。見圖1～6。

2.2 HSC細胞的生長抑制情況

圖1 陰性對照組24 h（倒置顯微鏡×4）

圖2 單用0.469 mg/ml肝龍膠囊24 h（倒置顯微鏡×4）

圖3 單用0.125 mg/ml水飛薊賓膠囊24 h（倒置顯微鏡×4）

圖40 .125 mg/ml水飛薊賓膠囊+0.469 mg/ml肝龍膠囊24 h（倒置顯微鏡×4）

圖5 單用1.000mg/ml水飛薊賓膠囊24 h（倒置顯微鏡×4）

2.2.1 水飛薊賓膠囊與不同濃度肝龍膠囊聯合24 h后對HSC細胞的生長抑制作用水飛薊賓膠囊濃度為0.063、0.125、0.250、0.500和1.000 mg/ml時對HSC細胞的抑制率分別為26.1%、27.3%、44.8%、47.3%和80.7%。0.063 mg/ml水飛薊賓膠囊分別與3.750、1.875、0.938、0.469和0.235 mg/ml濃度的肝龍膠囊聯合后，其中與3.750 mg/ml肝龍膠囊聯合后的抑制率與單用水飛薊賓膠囊相比，差異有統計學意義（=-29.475，=0.001），聯合后的抑制率增大。0.125 mg/ml水飛薊賓膠囊與不同濃度肝龍膠囊聯合后，其中與0.938 mg/ml肝龍膠囊聯合后的抑制率與單用水飛薊賓膠囊相比，差異有統計學意義（=-16.667，=0.000），聯合后抑制率增大。0.250 mg/ml水飛薊賓與不同濃度的肝龍膠囊聯合，其中與1.875、0.938、0.469、0.235 mg/ml肝龍膠囊聯合后的抑制率與單用水飛薊賓膠囊相比，差異具有統計學意義（=-3.198、-6.672、-8.751和-12.421=0.033、0.011、0.005和0.000），聯合后抑制率增大。見表1。

2.2.2 水飛薊賓膠囊與不同濃度肝龍膠囊聯合48 h后對HSC細胞的生長抑制作用水飛薊賓膠囊濃度為0.063、0.125、0.250、0.500和1.000 mg/ml時對HSC細胞的抑制率分別為36.4%、52.3%、88.7%、87.3%和77.1%。0.063及0.125 mg/ml濃度水飛薊賓膠囊分別與3.750、1.875、0.938、0.469和0.235 mg/ml肝龍膠囊聯合后的抑制率與單用水飛薊賓膠囊相比，差異有統計學意義（=-4.434、-3.423、-4.434、-4.596和-5.192，=0.020、0.039、0.020、0.017和0.011），聯合后的抑制率增大。1.000 mg/ml濃度水飛薊賓膠囊與不同濃度肝龍膠囊聯合后，其中與3.750和0.938 mg/ml肝龍膠囊聯合后的抑制率與單用水飛薊賓膠囊相比，差異有統計學意義（=-5.365和-2.863，=0.006和0.046），聯合后抑制率增大。見表2。

圖61 .000 mg/ml水飛薊賓膠囊+0.469 mg/ml肝龍膠囊24 h（倒置顯微鏡×4）

表1 水飛薊賓膠囊單用及合用肝龍膠囊24 h對HSC增殖的影響（%±s）

表1 水飛薊賓膠囊單用及合用肝龍膠囊24 h對HSC增殖的影響（%±s）

注：?與單獨用藥比較，<0.05

肝龍膠囊0.235mg/ml 0.063 mg/ml0.556±0.048?-0.071±0.161-0.413±0.018-0.739±0.058?-0.265±0.120抑制率水飛薊賓膠囊肝龍膠囊3.750mg/ml肝龍膠囊1.875mg/ml肝龍膠囊0.938mg/ml肝龍膠囊0.469mg/ml肝龍膠囊0.000 mg/ml-0.261±0.00171.2080.000值值0.125 mg/ml 0.250 mg/ml 0.337±0.104?0.521±0.045 0.397±0.029 0.699±0.028?0.464±0.015 0.722±0.050?0.299±0.024 0.682±0.057?0.359±0.037 0.713±0.142?0.273±0.0135.4790.007 0.448±0.0218.6880.0010.500 mg/ml0.532±0.0020.611±0.0860.730±0.0050.581±0.0740.694±0.001 1.000 mg/ml0.835±0.0740.874±0.0180.793±0.1480.803±0.1200.874±0.018 0.473±0.0866.0900.005 0.807±0.0330.5390.743

表2 水飛薊賓膠囊單用及合用肝龍膠囊48 h對HSC增殖的影響（%±s）

表2 水飛薊賓膠囊單用及合用肝龍膠囊48 h對HSC增殖的影響（%±s）

注：?與單獨用藥比較，<0.05

抑制率水飛薊賓膠囊肝龍膠囊0.235 mg/ml 0.063 mg/ml0.875±0.088?0.811±0.084?0.789±0.079?0.694±0.081?0.754±0.066?肝龍膠囊3.750 mg/ml肝龍膠囊1.875 mg/ml肝龍膠囊0.938 mg/ml肝龍膠囊0.469 mg/ml肝龍膠囊0.000 mg/ml0.364±0.14611.1810.000 0.523±0.1533.5720.033 0.887±0.0073.3590.040 0.873±0.0133.5750.033 0.771±0.0663.1060.050值值0.125 mg/ml 0.250 mg/ml 0.913±0.000?0.970±0.059?0.903±0.015?0.956±0.059 0.862±0.013?0.919±0.043 0.824±0.037?0.905±0.025 0.811±0.016?0.857±0.0090.500 mg/ml0.967±0.0790.984±0.0250.984±0.0250.931±0.1080.764±0.134 1.000 mg/ml0.976±0.105?0.966±0.125?0.980±0.014?0.846±0.1030.889±0.002

2.2.3 水飛薊賓膠囊與不同濃度肝龍膠囊聯合72 h后對HSC細胞的生長抑制作用水飛薊賓膠囊濃度為0.063、0.125、0.250、0.500和1.000 mg/ml時對HSC細胞的抑制率分別為63.2%、95.0%、98.6%、96.7%和89.3%。0.063 mg/ml水飛薊賓膠囊與不同濃度肝龍膠囊聯合后，其中與3.750和1.875 mg/ml濃度肝龍膠囊聯合后的抑制率與單用水飛薊賓膠囊相比均增大，差異有統計學意義（=-2.907和-2.774，=0.044和0.050）。見表3。

2.3 HSC細胞IC50值的影響

2.3.1 水飛薊賓膠囊與不同濃度肝龍膠囊聯合24 h后對HSC細胞IC50值的影響0.063、0.125、0.250、0.500和1.000 mg/ml水飛薊賓膠囊與3.750、1.875、0.938、0.469和0.235 mg/ml肝龍膠囊合用24 h均可使IC50值降低，與單用水飛薊賓膠囊的IC50值0.585 mg/ml比較，分別降低到0.440、0.429、0.478、0.582和0.581 mg/ml。其下降幅度分別為24.79%、26.67%、18.29%、0.50%和0.68%。見表4。

2.3.2 水飛薊賓膠囊與不同濃度肝龍膠囊聯合48 h后對HSC細胞IC50值的影響0.063、0.125、0.250、0.500和1.000 mg/ml水飛薊賓膠囊與1.875、0.938、0.469和0.235 mg/ml肝龍膠囊合用48 h后可使IC50值降低，其中與單用水飛薊賓膠囊的IC50值0.808 mg/ml比較，分別降低到0.752、0.709、0.015和0.496 mg/ml。其下降幅度分別為6.93%、12.25%、98.14%和38.61%。見表4。

2.3.3 水飛薊賓膠囊與不同濃度肝龍膠囊聯合72 h后對HSC細胞IC50值的影響0.063、0.125、0.250、0.500和1.000 mg/ml水飛薊賓膠囊與3.750、1.875、0.938和0.469 mg/ml肝龍膠囊合用72 h后可使IC50值降低，其中與單用水飛薊賓膠囊的IC50值1.017 mg/ml比較，分別降低到0.988、0.971、0.810和0.387 mg/ml。其下降幅度分別為2.85%、4.52%、20.35%和61.90%。見表4。

2.4 水飛薊賓膠囊聯合不同肝龍膠囊濃度時的聯合指數

水飛薊賓膠囊與不同濃度肝龍膠囊聯合后，其聯合指數CI<1.0，呈現出協同作用，見表5。

表3 水飛薊賓膠囊單用及合用肝龍膠囊72 h對HSC增殖的影響（%±s）

表3 水飛薊賓膠囊單用及合用肝龍膠囊72 h對HSC增殖的影響（%±s）

注：?與單獨用藥比較，<0.05

抑制率水飛薊賓膠囊肝龍膠囊0.235 mg/ml 0.063 mg/ml0.987±0.088?0.922±0.084?0.790±0.078?0.648±0.0160.508±0.016肝龍膠囊3.750 mg/ml肝龍膠囊1.875 mg/ml肝龍膠囊0.938 mg/ml肝龍膠囊0.469 mg/ml肝龍膠囊0.000 mg/ml0.632±0.15110.2860.000值值0.125 mg/ml 0.250 mg/ml 0.931±0.050 0.967±0.013 0.931±0.015 0.961±0.020 0.967±0.013 0.936±0.0430.976±0.037 1.009±0.0520.991±0.083 1.006±0.1160.950±0.1090.6400.670 0.986±0.0250.8230.5560.500 mg/ml0.979±0.0070.997±0.0010.976±0.0590.989±0.1080.936±0.102 1.000 mg/ml0.977±0.0900.959±0.0300.758±0.1000.763±0.1500.831±0.111 0.967±0.0510.2910.909 0.893±0.1022.5310.087

表4 單用水飛薊賓膠囊及合用肝龍膠囊HSC的IC50值變化

表5 水飛薊賓膠囊聯合不同肝龍膠囊濃度時的聯合指數（CI）

3 討論

肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內結締組織異常增生，導致肝內彌漫性細胞外基質過度沉淀的病理過程。其肝纖維化的藥物治療沒有實質性的進展，雖然目前有許多藥物被應用于肝纖維化的治療，但臨床上的應用效果卻不樂觀或者具有較大的毒副作用。其中，水飛薊賓膠囊作為治療肝慢性疾病的傳統藥物，在臨床上被廣泛應用。據估計，約33%的丙型肝炎患者和肝硬化患者正在使用或曾經使用過水飛薊賓膠囊相關產品[11]；在德國，水飛薊賓膠囊相關藥物的年治療費用就達到1.8億美元[12]；在我國，水飛薊賓膠囊的臨床應用也在逐年增加。因此本研究以聯合用藥的角度出發，旨在探索肝龍膠囊與水飛薊賓膠囊聯合對HSC增殖的影響，從而為臨床抗肝纖維化應用肝龍膠囊與水飛薊賓膠囊提供新的思路。

本實驗研究結果表明，不同濃度水飛薊賓膠囊對大鼠HSC細胞有不同程度的抑制作用。水飛薊賓膠囊聯合肝龍膠囊對HSC細胞的抑制作用與單用水飛薊賓膠囊組比較，作用更強，尤其48 h時0.063、0.125及0.250 mg/ml水飛薊賓膠囊與其不同濃度肝龍膠囊聯合后，與單用水飛薊賓膠囊組比較差異具有統計學意義。水飛薊賓膠囊聯合不同濃度肝龍膠囊的IC50值與單用水飛薊賓膠囊的IC50值相比較，在24、48、72 h時均有下降，因此，水飛薊賓膠囊與肝龍膠囊合用可在一定程度上降低水飛薊賓膠囊的毒性，而且水飛薊賓膠囊與不同濃度肝龍膠囊聯合后，其聯合指數CI<1.0，呈現出協同作用，增強了水飛薊賓膠囊對HSC細胞的抑制作用。本實驗發現同一個濃度沒有時間依賴性，用高濃度水飛薊賓膠囊處理HSC后，其會產生黑色物質，從而影響其吸光度值，但與肝龍膠囊聯合后這種黑色物質會消失。因此，可以用較低劑量的水飛薊賓膠囊與肝龍膠囊聯合達到和高劑量水飛薊賓膠囊相同或更好的療效。該結果將為肝纖維化藥物的研發提供一定的理論依據。綜上所述，水飛薊賓膠囊與肝龍膠囊合用在體外抗肝纖維化具有協同作用，此作用是通過抑制HSC細胞達到的，其作用機制尚需進一步研究。但目前觀察結果僅為體外實驗，體內實驗是否有相同結果尚需更多研究加以證實，下一步將繼續進行體內實驗的研究，為臨床提供更多的依據。

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（張蕾編輯）

Effect of Ganlong Capsules combined with Silibinin Capsules onproliferative activity of rat hepatic stellate cells*

Qiang-li Yang,Hui Li,Yong Lai
(Department of Pharmacology,College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of anti-liver fibrosis agent Silibinin Capsules alone or combined with Ganlong Capsules on proliferative activity of rat hepatic stellate cells(HSC),and to evaluate the effect of Ganlong Capsules on theanti-liver fibrosis activity of Silibinin.Methods Two-factors and five-levels full experiment was applied for single use or combined use of Silibinin Capsules with different dosages of Ganlong Capsules in HSC at different time points.Tetrazolium salt colorimetric assay(MTT)was utilized to determine the effect of Ganlong Capsules on HSC proliferation.ResultsCombination of Silibinin Capsules and Ganlong Capsules enhanced the suppression effect of Silibinin Capsules on HSC proliferation.The effect of Silibinin Capsules was obviously increased especially at a dosage of 0.063 mg/ml,0.125 mg/ml or 0.250 mg/ml and in combination with Ganlong Capsules,and the differences were significant when compared with the Silibinin Capsule single drug groups.Compared with the IC50value of Silibinin Capsules alone,the IC50values of Silibinin Capsules combined with Ganlong Capsules at different dosages decreased at 24,48 and 72 h.Moreover,the combination indexes(CI)of the combined drug therapies were all less than 1.0,which illustrated synergistic effect and enhanced the suppression effect of Silibinin Capsules on HSC.ConclusionsGanlong Capsules can enhance theanti-liver fibrosis effect of Silibinin Capsules.

hepatic stellate cell(HSC);Silibinin capsule;Ganlong capsule;cell activity

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.16.005

1005-8982（2017）16-0024-06

R-332

A

2017-01-15

云南省教育廳科學研究基金項目（No：2016YJS120）；云南省教育廳科學研究基金重大專項項目（No：ZD2014013）

賴泳，E-mail：laiyong8879@163.com