熱性驚厥患兒血清中表觀遺傳標志物的表達及臨床意義*

徐健，孫明強，王媛媛，張成元

（山東省濰坊市婦幼保健院1.檢驗科，2.兒科，3.新生兒科，山東 濰坊 261011）

臨床研究·論著

熱性驚厥患兒血清中表觀遺傳標志物的表達及臨床意義*

徐健1，孫明強1，王媛媛2，張成元3

（山東省濰坊市婦幼保健院1.檢驗科，2.兒科，3.新生兒科，山東 濰坊 261011）

目的分析熱性驚厥（FS）患兒血清中DNA甲基轉移酶1、3A、3B（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B）、組蛋白甲基轉移酶EZH2（EZH2）及組蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）的變化情況，探討其在FS疾病中的臨床意義。方法選取60例FS患兒，其中包括30例單純型FS（SFS）和30例復雜型FS（CFS）。另選取30例正常健康體檢兒童為正常對照組，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）和酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測比較3組間3種酶基因和蛋白之間的表達水平變化。結果①SFS組和CFS組基因表達均高于正常對照組，差異有統計學意義（<0.05）；SFS組與CFS組之間比較，差異無統計學意義（>0.05）。②SFS組和CFS組DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、EZH2、HDAC4蛋白表達水平均高于正常對照組，差異有統計學意義（<0.05）；SFS組與CFS組之間比較，差異無統計學意義（>0.05）。結論SFS和CFS組患兒血清中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、EZH2和HDAC4基因及蛋白水平均呈現高表達模式，提示表觀遺傳修飾在FS中的發生發展過程中發揮著重要作用，為深入研究FS的致病機制及防治FS提供了實驗依據。

熱性驚厥；表觀遺傳；DNA甲基轉移酶；組蛋白甲基化酶；組蛋白去乙酰化酶

熱性驚厥（febrile seizures，FS）是小兒時期較常見的中樞神經系統功能異常的緊急癥狀[1]，一般情況下無并發癥，但突發驚厥可致外傷，嚴重持續驚厥可致腦缺氧、腦損傷。根據臨床表現主要分為單純型FS（simple febrile seizures，SFS）和復雜型FS（complex febrile seizures，CFS）。前者具有良好的自愈性，一般不會留下后遺癥。后者如果反復發生，具有發展成癲癇的可能性，導致智力低下，增加死亡的危險[2]。

近年來，DNA甲基化、組蛋白甲基化、組蛋白乙酰化等表觀遺傳調控機制研究為驚厥或癲癇發病機制的研究熱點[3]。研究表明[4-5]，中樞神經系統中DNA甲基化可調控神經元網絡活性和突觸可塑性。DNA甲基化主要由DNA甲基轉移酶（DNA methyltranferase，DNMT）來完成的，主要維持體內基因甲基化狀態的催化酶，尤其是DNMT1被認為是維持DNA甲基化的關鍵酶[6]。組蛋白甲基轉移酶EZH2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）作為一種重要的調節組蛋白甲修飾的酶類，主要特異性的完成H3K27的甲基化修飾。研究表明，EZH2可以介導H3K27甲基化從而影響神經元的分化以及神經退行性疾病等[7]。另一種表觀遺傳修飾酶—組蛋白去乙酰化酶主要是調控組蛋白乙酰化水平的重要催化酶。經研究表明，組蛋白去乙酰化酶4（histone deacetylase 4，HDAC4）可以影響許多神經元相關基因的異常表達，導致神經元細胞死亡，進而影響神經疾病的發生發展[8]。

本研究通過檢測FS患兒血清中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、EZH2、HDAC4的基因及蛋白表達情況，探討這些表觀遺傳修飾在FS中的臨床價值，為治療FS提供更好的臨床指導。

1 資料與方法

1.1 研究對象

FS組：選取2015年7月-2016年8月來山東省濰坊市婦幼保健院就診的60例FS兒童（不包括新生兒）。根據病史及臨床特征，符合FS的臨床診斷標準。其中包括30例SFS患兒和30例CFS患兒。兩組分別男15例，女15例；年齡1～5歲，平均（2.9±1.2）歲。對照組：30例健康體檢兒童，排除感染或具有免疫疾病者；男15例，女15例；年齡1～5歲，平均（3.0±1.2）歲；既往均無FS及癲癇病史。所有FS患兒治療方案均告知家長，并在家長簽署同意書的情況下執行。3組患兒性別、年齡及發熱程度差異無統計學意義（>0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 血液樣本收集SFS組和CFS組在驚厥發作后5 h內抽取靜脈血5 m（l需EDTA抗凝）。全血樣本一部分立即進行3 000 r/min，離心10 min，取上清冷凍保存于-80℃冰箱，準備后續進行酶聯免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測。另一部分血液樣本用于提取RNA，準備后續進行基因表達檢測。對照組血液樣本按照上述方法進行同樣的處理。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測首先將前面提取的RNA逆轉錄成cDNA作為模板，加入引物、DNA聚合酶，混勻后進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測。PCR反應體系如下所示：cDNA 1μl；2×SYBR Green Mix 9μl；正向引物（10μmol）0.5μl；反向引物（10μmol）0.5μl；水9μl；總體積20μl。PCR擴增反應參數：預變性95℃3 min，94℃30 s，退火溫度（基因不同，退火溫度不同）15 s，72℃延伸15 s，35個循環。β-actin基因為內參基因。根據公式2-△△Ct=[Ct（target）-Ct（actin）]A-[C（ttarget）-（Ctactin）]B，分析各組間基因相對表達量。引物序列見表1。

1.3 ELISA檢測

按照博士德公司購買的酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒說明書操作，每份標準品測3孔，取其平均值，根據標準曲線計算出樣本濃度。

1.4 統計學方法

采用SPSS 15.0統計軟件進行統計學分析，各組數據以均數±標準差（±s）表示。兩組間采用檢驗，3組間采用One-way ANOVA法，<0.05為差異有統計學意義。

表1 引物序列

2 結果

表2 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、EZH2、HDAC4在FS患兒血清中的蛋白表達水平（±s）

表2 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、EZH2、HDAC4在FS患兒血清中的蛋白表達水平（±s）

注：1）與正常對照組比較，<0.05；2）與SFS組比較，<0.05

組別HDAC4/（ng/L）DNMT1/（μg/L）DNMT3A/（μg/L）DNMT3B/（μg/L）EZH2/（ng/L）正常對照組（=30）12±311±410±4264±32362±45 SFS組（=30）96±221）101±341）88±341）679±751）691±341）CFS組（=30）153±351）2）115±431）92±431）725±641）765±551）

圖1 DNA甲基轉移酶基因、基因表達

2.4 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、EZH2、HDAC4蛋白表達情況

SFS組和CFS組血清中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、EZH2、HDAC4的蛋白的表達情況均高于正常對照組，差異有統計學意義（<0.05），與SFS組比較，CFS組中DNMT1蛋白表達高于SFS組，差異有統計學意義（=0.011）。其余各指標兩組間差異無統計學意義（>0.05），見表2。

圖2 組蛋白甲基轉移酶2基因表達

圖3 組蛋白去乙酰化酶基因表達

3 討論

近年來，表觀遺傳調控在許多重要的神經系統疾病當中起到重要的作用，例如，癲癇、阿爾茲海默病、帕金森病等[8]。FS可以使神經系統中大量的神經細胞受損，進而影響各種信號通路之間的信號傳遞，信號通路中的各種因子受到DNA甲基化、組蛋白甲基化、乙酰化等修飾后，改變了蛋白的活性進而影響疾病的進程。表觀遺傳調控機制主要包括DNA甲基化、組蛋白甲基化、組蛋白乙酰化等修飾，這些修飾可以影響緊密染色質結構的改變和基因表達模式的改變，并且對于中樞神經系統發育、突觸可塑性、學習記憶等方面起到調控作用[9]。許多研究者希望能從表觀遺傳學方面解釋FS的發病機制，以期在不遠的將來能尋找新干預措施。

本研究結果顯示，在SFS和CFS組中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、EZH2、HDAC4基因及蛋白表達水平呈現高表達模式，說明在FS疾病過程中DNA甲基轉移酶的變化可能會影響某些基因甲基化狀態的改變，進而影響FS的發生發展。經過理論分析和實驗研究，有關科學家提出了“甲基化假說”。該假說認為，驚厥可以使表觀遺傳染色質結構發生改變，進而影響某些關鍵基因的表達，最終增加了導致驚厥或癲癇的發病條件，這種異常的表觀遺傳染色質修飾已經在許多神經系統疾病中被發現，包括自閉癥、精神分裂癥、腦腫瘤等[9]。DNA甲基轉移酶是DNA甲基化的關鍵調控酶，迄今發現主要有3種DNMTs參與基因的甲基化過程。DNMTs的表達與基因的甲基化水平呈正相關，且其改變常早于基因甲基化狀態的改變，因此，常作為基因甲基化狀態的參考指標[10]研究表明，DNA甲基化可以調節神經元的發育及突觸可塑性[5]。在動物實驗中，如果敲除海馬區的DNMT基因，其突觸的形成會受到抑制。另有研究顯示，DNMT3A能夠使神經干細胞向神經元方向進行分化，如果敲除該基因會使神經元的數量顯著減少，進而產生一系列的神經異常變化[11]。

本研究結果顯示SFS組和CFS組的EZH2表達高于正常對照組，表明EZH2在FS的發生發展中同樣也起到一定的作用。組蛋白甲基化水平由組蛋白甲基化酶和去甲基化酶催化決定。目前已發現3個家族的酶能夠將S-腺苷甲硫氨酸上的催化基團轉移到組蛋白氨基酸殘基[12]。組蛋白甲基化與DNA甲基化之間存在密切的聯系。在神經細胞實驗研究中發現，組蛋白甲基轉移酶EZH2可以與DNMT3A、DNMT3B相互作用[13]，受PRC2復合體調控的基因出現DNA甲基化。組蛋白甲基化和DNA甲基化都可以引起基因轉錄抑制，組蛋白甲基化引起基因轉錄抑制的兩種機制包括介導染色體局部異染色質形成和介導DNA甲基化[14]。組蛋白甲基化與DNA甲基化兩種表觀遺傳機制可以通過組蛋白甲基化在DNA復制過程中將DNA甲基化導入到DNA鏈上的相應位置，復制結束后甲基化DNA成為組蛋白甲基化的模板。這兩種機制之間的對話主要是通過組蛋白甲基轉移酶和DNA甲基轉移酶之間的相互作用來交流的。

大量研究顯示[15]，組蛋白去乙酰化酶及其抑制劑與多種神經系統疾病有著密切的聯系。在神經疾病條件下，組蛋白乙酰化水平被降解，去乙酰化水平增強，因此造成染色質組蛋白乙酰化穩態失去平衡，進而使神經細胞的正常功能受損，最終產生一系列神經異常變化[16]。研究顯示[17]，HDAC1、HDAC4、HDAC6在小鼠海馬及杏仁核區域呈現高表達，癲癇可以使組蛋白去乙酰化水平增加，進而引起組蛋白乙酰化水平下降。另外，HDAC抑制劑丁酸鈉可以很好地改善腦損傷后的小鼠的學習記憶能力，起到一種神經保護作用。

綜上所述，本文通過檢測FS患兒血清中各種表觀遺傳標志物的變化情況，提示表觀遺傳修飾在FS中的發生發展過程中發揮著重要作用。表觀遺傳標志物作為FS一種新的潛在的臨床干預靶點，其抑制或者促進驚厥或癲癇的作用機制尚需進一步的研究，希望能夠為臨床FS的治療提供更可靠的臨床依據。

[1]LEE S H,BYEON J H,KIM G H,et al.Epilepsy in children with a history of febrile seizures[J].Korean Journal of Pediatrics,2016,59(2):74-79.

[2]PAVLIDOU E,PANTELIADIS C.Prognostic factors for subsequent epilepsy in children with febrile seizures[J].Epilepsia,2013,54(12):2101–2107.

[3]FENG J,FAN G.The role of DNA methylation in the central nervoussystemandneuropsychiatricdisorders[J].International Review of Neurobiology,2009,89:67-84.

[4]FENG J,ZHOU Y S,LE T,et al.Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons[J].Nature Neuroscience,2010,13(13):423-430.

[5]肖小晶,唐含林,姬晨,等.DNA甲基化在中樞神經系統發育中的研究進展[J].生理科學進展,2014(5):399-400.

[6]趙娜,趙翠萍.DNA甲基化的相關研究進展[J].醫學綜述,2015,21(8):1359-1361.

[7]YU Y L,CHOU R H,SHYU W C,et al.Smurf2-mediated degradation of EZH2 enhances neuron differentiation and improves functional recovery after ischaemic stroke[J].Embo Molecular Medicine,2013,5(4):531-547.

[8]QURESHI I A,MEHLER M F.Epigenetic mechanisms underlying human epileptic disorders and the process of epileptogenesis.Neurobiol Dis(in eng),2010,39:53-60.

[9]URDINGUIO R G,SANCHEZ-MUT J V,ESTELLER M.Epigenetic mechanisms in neurological diseases:genes,syndromes,and therapies[J].Lancet Neurol,2009,8:1056-1072.

[10]王志剛,吳建新.DNA甲基轉移酶分類、功能及其研究進展[J].遺傳,2009,31(9):903-912.

[11]WU Z,HUANG K,YU J,et al.DNMT3A regulates both cell proliferation and differentiation of mouse neural stem cells[J].Journal of Neuroscience Research,2012,90(10):1883-1891.

[12]趙俊龍,秦鴻雁,韓驊.組蛋白甲基轉移酶的研究進展[J].國際遺傳學雜志,2011,34(3):141-147.

[13]SINHA S,THOMAS D,YU L,et al.Mutant WT1 is associated with DNA hypermethylation of PRC2 targets in AML and responds to EZH2 inhibition[J].Blood,2015,125(2):316-326.

[14]CEDAR H,BERGMAN Y.Linking DNA methylation and histone modification:patterns and paradigms[J].Nature Reviews Genetics,2009,10(5):295-304.

[15]PARK M J,SOHRABJI F.The histone deacetylase inhibitor,sodium butyrate,exhibits neuroprotective effectsforischemic stroke in middle-aged female rats[J].Journal of Neuroinflammation,2016,13(1):300.

[16]LANGLEY B,GENSERT J M,BEAL M F,et al.Remodeling chromatin and stress resistance in the central nervous system:histonedeacetylaseinhibitors as novelandbroadlyeffective neuroprotective agents[J].Current Drug Targets Cns&Neurological Disorders,2005,4(1):41-50.

[17]喬珊,韓濤,李文娜,等.新型組蛋白脫乙酰酶抑制劑11r對癲癇持續狀態大鼠的神經保護作用[J].山東大學學報(醫學版),2015,53(6):39-43.

（張蕾編輯）

Expression and significance of epigenetic markers in serum of children with febrile seizures*

Jian Xu1,Ming-qiang Sun1,Yuan-yuan Wang2,Cheng-yuan Zhang3
(1.Clinical Laboratory,2.Department of Pediatrics,3.Department of Neonatology,Weifang Maternal and Child Care Hospital,Weifang,Shandong 261011,China)

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of epigenetic markers in the serum of the children with febrile seizures(FS).MethodsRT-PCR and ELISA were used to measure the gene and protein expressions of DNA methyltransferase 1(DNMT1),DNMT3A,DNMT3B,histone methyltransferase EZH2(EZH2),and histone deacetylase 4(HDAC4)in 60 children with febrile seizures[30 with simple FS(SFS)and 30 with complex FS(CSF)]and 30 healthy controls.ResultsThe gene expression levels of DNMT1,DNMT3A,DNMT3B,EZH2 and HDAC4 in the SFS and CFS groups were significantly higher than those in the control group(<0.05),while there were no significant differences between the SFS group and the CFS group(>0.05).The protein expressions of DNMT1,DNMT3A,DNMT3B,EZH2 and HDAC4 in the SFS and CFS groups were significantly higher than those in the control group(<0.05);there were no significant differences between the SFS group and the CFS group(>0.05).ConclusionsDNMT1,DNMT3A,DNMT3B,EZH2 and HDAC4 are highly expressed at the gene and proteinlevels in the serum of the children with SFS and CFS,which suggests that these epigenetic modifications may play important roles in the occurrence and development of FS and provides a reliable theoretical basis for further research of pathogenesis and prevention of FS.

febrile seizure;epigenetic;DNA methyltransferase;histone methyltransferase;histone deacetylase

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.16.007

1005-8982（2017）16-0035-05

R742

A

2016-12-19

國家自然科學基金（No：81401230）；濰坊市科學技術發展計劃項目（No：2014001）

孫明強，E-mail：763050348@qq.com；Tel：0536-8089176