南瓜種質資源遺傳多樣性的SSR分析

王迎兒，邢乃林，應泉盛，張慧波, 2，黃蕓萍，王毓洪*

(1.寧波市農業科學研究院 蔬菜研究所，浙江 寧波 315040； 2.浙江農林大學 農業與食品科學學院，浙江 杭州 311300)

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南瓜種質資源遺傳多樣性的SSR分析

王迎兒1，邢乃林1，應泉盛1，張慧波1, 2，黃蕓萍1，王毓洪1*

(1.寧波市農業科學研究院 蔬菜研究所，浙江 寧波 315040； 2.浙江農林大學 農業與食品科學學院，浙江 杭州 311300)

以主要來源于浙江省的41份南瓜種質資源為材料，利用26對南瓜SSR標記對其進行遺傳多樣性及親緣關系分析。結果表明，41份種質被分為4類，2類為白籽南瓜(各1份)，1類中國南瓜(35份)，1類印度南瓜(4份)。材料間的遺傳相似系數介于0.45～0.96，平均為0.79。其中，中國南瓜類群種內平均相似系數為0.86，印度南瓜類群種內平均相似系數為0.67，這2個類群間的平均相似系數為0.54。所收集的浙江省種質資源除其中2份外，均被分類為中國南瓜，平均遺傳相似系數為0.87。中國南瓜的親緣關系較印度南瓜近，種內親緣關系較種間近。研究結果對浙江省南瓜種質資源保護和開發利用具有重要意義。

南瓜； 種質資源； SSR； 聚類分析； 遺傳相似性

南瓜(CucurbitaL.)為1年生草本植物，屬于葫蘆科南瓜屬，在世界范圍內廣泛栽培。栽培種主要分為5類，包括美洲南瓜(Cucurbitapepo)、中國南瓜(C.moschata)、印度南瓜(C.maxima)、黑籽南瓜(C.ficifolia)和灰籽南瓜(C.mixta)，用途廣泛，營養豐富，變種繁多[1-2]。南瓜起源于美洲大陸，明代由東南亞、朝鮮和日本等地傳入我國，距今近500多年的歷史[3]。傳入中國后，由浙江、福建等東南沿海地區向內地擴展，在多年栽培擴展過程中產生了豐富的表型及遺傳變異。對育種工作者而言，種質資源是品種培育的基礎，而種質資源的收集及評價分析則是種質資源利用的必需過程，可為雜交育種中親本選配提供依據，有利于優良品種的選育。地方種質資源在地區氣候環境適應性方面具有一定優勢，具有豐富的生物及非生物脅迫抗性遺傳資源，適宜用作地方品種的選育基礎[4]。因此，開發利用地方種質資源已成為育種的重要發展方向，對品種選育具有重要意義。

遺傳多樣性是種質資源評價的重要指標，主要包括表型水平和分子水平2個方面。通過SSR等分子標記在分子水平對種質資源進行多樣性評價，相對表型水平受環境影響較小，重復性及穩定性較高，因此，在分子水平對種質資源遺傳多樣性進行評價，可靠性更高[5-6]。目前，國內外學者為了從分子水平研究南瓜種質資源的遺傳多樣性，已經利用過氧化物同工酶[7]、RAPD[8-14]、AFLP[15]、SSR[16-18]、EST-SSR[19]、SRAP[20]、ISSR[13-14, 21]等分子標記對國內外種質資源進行栽培種內及栽培種間的遺傳多樣性進行分析。但是作為南瓜在國內傳播的重要節點，浙江相關的地方種質資源少有涉及。本研究以浙江省為主的41份南瓜種質資源為研究材料，利用SSR分子標記對其進行遺傳多樣性分析，旨在為南瓜種質資源保護及新品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料共41份(表1)。分別為中國南瓜、印度南瓜、中國南瓜與印度南瓜雜交材料，主要來源于浙江省內的農家留種，少量為其他國家和地區引進的材料。

1.2 處理設計

材料于2016年秋季種植于寧波市農業科學研究院寧波市高新農業技術實驗園區設施大棚內，每份材料定植15株。開花期對每份材料隨機選取4株取幼嫩葉片，混合后進行基因組DNA提取。DNA提取方法參照文獻[22]。利用超微量分光光度計檢測DNA質量及濃度，稀釋至20 ng·μL-1后進行PCR擴增。

表1 種質資源編號及類別

SSR引物序列參考文獻[23]，本研究選取其中擴增條帶清晰、穩定、多態性高的50對引物進行分析，引物由上海英濰捷基生物公司合成，引物序列見表2。PCR擴增體系10 μL：DNA(20 ng·μL-1)2 μL，10× PCR buffer 1 μL，25 mmol·L-1MgCl20.8 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.16 μL，10 mmol·L-1Primer 1 μL，Taq酶(全式金)0.1 μL，dd H2O 4.94 μL。PCR程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，65 ℃ 30 s(每循環降0.7 ℃)，72 ℃ 1 min，10個循環；94 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25個循環；72 ℃ 10 min，25 ℃ 10 min。擴增產物用0.6%變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，常規硝酸銀染色法銀染。

1.3 數據分析

為了后續SSR分析，對每個多態性位點，出現及缺失的PCR擴增帶紋分別賦值為1和0。通過NTSYSpc 2.10e軟件進行數據分析，獲得材料間的遺傳相似性及遺傳距離，并進一步繪制樹狀聚類圖。

2 結果與分析

2.1 SSR引物的篩選

利用50對SSR引物對收集的41份南瓜種質材料進行分析，結果(表2)顯示，26對引物具有多態性，多態性條帶141條，平均5.42條。擴增多態性條帶最多的為標記S198，共有17條，最少的為S125，只有1條。多態性信息含量平均0.58，S198的多態性信息含量最高，為0.91，S312的多態性信息含量最低，為0.32。圖1為SSR引物S264對41份南瓜種質材料的擴增電泳圖譜。

圖1 41份材料SSR引物S264的擴增結果

2.2 41份南瓜材料的遺傳相似性分析

基于SSR數據，通過NTSYSpc 2.10e統計41份南瓜資源的遺傳相似系數。材料間的遺傳相似系數為0.45～0.96，平均為0.79。其中51與52、79與84之間的遺傳相似系數最大，為0.96，表明這2對種質資源之間的親緣關系最近。73與85之間的遺傳相似系數最小，為0.45，表明這2份種質資源間的親緣關系最遠。

2.3 41份南瓜材料的聚類分析

利用26對SSR引物得出的電泳譜帶數據進行聚類分析，得到聚類樹狀圖(圖2)。

表2 26對SSR引物序列及擴增結果

圖2 基于SSR分析的41份南瓜種質材料的聚類結果

由圖2可知，在閾值為0.13時，41份南瓜種質資源劃分為4個類群。第Ⅰ類群包括1份材料，編號47，為白籽南瓜；第Ⅱ類群包括4份材料(編號72、73、89、90)，為印度南瓜；第Ⅲ類群包括35份材料，為中國南瓜；第Ⅳ類群包括1份材料87，為白籽南瓜。

第Ⅰ類群與第Ⅱ類群的平均相似系數為0.61，編號47與90的相似系數達0.69，編號47與89的相似系數為0.55。第Ⅰ類群與第Ⅲ類群的平均相似系數為0.70，編號47與48的相似系數達0.77，編號47與83、91的相似系數為0.64。第Ⅰ類群與第Ⅳ類群的平均遺傳相似性為0.55。第Ⅱ類群與第Ⅲ類群的平均相似系數為0.54，編號51與90的相似系數達0.65，編號73與85的相似系數為0.45。第Ⅱ類群與第Ⅳ類群的平均相似系數為0.51，編號87與72的相似系數達0.53，編號87與90的相似系數為0.49。第Ⅲ類群與第Ⅳ類群的平均相似系數為0.62，編號87與59的相似系數達0.68，編號87與53的相似系數為0.58。第Ⅱ類群中，編號72與73的遺傳相似性最大為0.82，90與72、73的遺傳相似性最小為0.62，平均為0.67。第Ⅲ類群的平均遺傳相似性為0.86，編號79與84、51與52的遺傳相似性最大為0.96，編號63與91的遺傳相似性最小為0.73。47和87這2份白籽南瓜與印度南瓜的平均遺傳相似性為0.56，與中國南瓜的平均遺傳相似性為0.66。2份白籽南瓜與印度南瓜類群的遺傳相似性較中國南瓜類群低，表明所收集的2份雜交材料的中國南瓜背景較大。中國南瓜類群內遺傳相似性顯著高于印度南瓜類群。除了編號87與印度南瓜類群外，印度南瓜和中國南瓜類群間的遺傳相似性最低，親緣關系最遠。中國南瓜類群內的遺傳相似性最高，內部親緣關系最遠的為0.73，最高達到0.96；其中，浙江省的中國南瓜材料平均相似系數為0.87，編號79與84、51與52的相似系數最大，均為0.96；63與91的相似系數最小，為0.73。

3 討論

南瓜自明代傳入我國浙江和福建以來，迅速北上南下，成為解決人民溫飽的重要農作物[24]。因此，收集并研究浙江地區南瓜種質資源情況對了解我國南瓜的推廣及種質資源利用和培育具有重要作用。本研究中，浙江地區收集的種質資源主要為中國南瓜，平均遺傳相似系數為0.87，多個地區總體親緣關系較近，遺傳多樣性不夠豐富。這或許與南瓜引入我國時間較短，自然及人為選擇壓力不大有關。因此，為選育優良品種，仍需創造或引進變異更豐富的種質資源。

SSR分子標記因其重復性高、基因組分布及數量豐富等優勢而在種質資源評價、遺傳進化、分子育種等方面而被廣泛應用[25]。但是在南瓜種質資源評價中的應用還較少[16-18]。最近，超過500對南瓜SSR分子標記被公布[23]。本研究從中隨機選擇50對SSR分子標記對41份南瓜種質資源進行遺傳多樣性分析，結果有26對分子標記具有多樣性。這26對標記平均擴增多態性條帶5.42條，高于已知的4.18、2.4以及2.29[16-18]，這可能與所選擇的分子標記位點受自然及人工選擇壓力較小有關。

本研究所用材料有印度南瓜、中國南瓜及白籽南瓜3類，其中2份白籽南瓜因為親緣關系較遠而被分在2個類群。總體上，種間親緣關系較種內遠，中國南瓜種內親緣關系較印度南瓜近。這與已發表的利用SSR、ISSR、SRAP等分子標記分析結果一致[16, 26-27]。但與利用同工酶對南瓜親緣關系研究結果不一致，這可能與材料及標記的選擇有關[7]。

目前蔬菜種子市場混亂，具有同名異物和同物異名現象。另外，由于農家留種大多無名稱或名稱不清楚，極易造成種質資源重復收集及收集遺漏。本研究中51與52、79與84間的遺傳相似性高達0.96，疑為同一材料短時間內分離而來，已發表研究也有類似結果[27]。75與76這兩份來自浙江舟山的材料雖然具有同一名字，但材料間遺傳相似性為0.88，表明材料間具有一定程度的差異，對密本南瓜的研究中也發現類似現象[26]。本研究中編號47的材料，因為可自交結實收種，通過外觀初步歸為印度南瓜；但該材料為印度南瓜與中國南瓜的雜交材料，雖然可自交收種，但種子量較少，結合田間植株詳細表現，最終認為該材料為種間雜交材料。

本研究利用SSR標記對收集的南瓜種質資源進行遺傳多樣性分析，進一步分析了中國南瓜、印度南瓜及白籽南瓜3個栽培種的遺傳多樣性，構建了聚類圖譜。雖然本研究中印度南瓜及白籽南瓜材料較少，但仍可以為南瓜親本選配和品種選育提供參考。

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(責任編輯：侯春曉)

2017-04-25

寧波市科技富民惠民項目(2015C10053)；國家西甜瓜產業技術體系(CARS-26)；寧波市瓜菜育種重點實驗室(2014A22007)

王迎兒(1985—)，女，浙江寧波人，農藝師，碩士，從事瓜類砧木育種工作，E-mail: wangyinger0601@sina.com。

王毓洪，E-mail: yhwangsc@163.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170721

S642.1

A

0528-9017(2017)07-1161-05

文獻著錄格式：王迎兒，邢乃林，應泉盛，等. 南瓜種質資源遺傳多樣性的SSR分析[J].浙江農業科學，2017，58(7)：1161-1165.